畢溫磊，楊志松，陳　鵬，陳　超，馮菲菲， ，侯　蓉，張志和，李明喜，齊敦武

(1.成都大熊貓繁育研究基地 四川省瀕危野生動物保護(hù)生物學(xué)省部共建實驗室，四川 成都　610861；2.西華師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，四川 南充　637009)

大熊貓糞便類固醇激素的保存時效性及檢測準(zhǔn)確性研究

畢溫磊1，楊志松2，陳鵬1，陳超1，馮菲菲1，JacobROwens1，侯蓉1，張志和1，李明喜1，齊敦武1

(1.成都大熊貓繁育研究基地 四川省瀕危野生動物保護(hù)生物學(xué)省部共建實驗室，四川 成都610861；2.西華師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，四川 南充637009)

摘要：對大熊貓類固醇激素的監(jiān)測有助于了解其生存環(huán)境的狀況，然而，野外采集的糞便樣品的時間尚缺乏準(zhǔn)確估計，因此，樣品中有效保存的時間與分析量是否對檢測結(jié)果具有影響尚不得而知。為評估樣品分析量和保存時間對野生大熊貓糞便樣品類固醇激素結(jié)果的影響，我們設(shè)置0.5g和0.2g兩種樣品分析量，以及模擬野外溫度(13±2℃)環(huán)境下，進(jìn)行連續(xù)360 h的檢測分析。結(jié)果表明：不同樣品分析量(即0.5g和0.2g)間差異顯著(p=0.000)，且分析量越大檢測結(jié)果越準(zhǔn)確。雄性大熊貓的皮質(zhì)醇可穩(wěn)定保存48h(F=6.08，P<0.05)，睪酮未出現(xiàn)顯著性變化(F=0.813，P>0.05)，結(jié)果在360 h內(nèi)具有可比性；雌性大熊貓的皮質(zhì)醇可穩(wěn)定保存72 h(F=5.96，P<0.05)，孕酮可穩(wěn)定保存48 h(F=2.365，P<0.05)。在實際應(yīng)用中，對于非新鮮的大熊貓糞便樣品應(yīng)根據(jù)不同檢測目的在樣品保存的有效期內(nèi)進(jìn)行類固醇激素的準(zhǔn)確檢測。

關(guān)鍵詞：大熊貓糞便；類固醇激素；野外環(huán)境；保存時效性；準(zhǔn)確性

近年來，許多研究通過分析瀕危野生動物類固醇激素的含量和變化情況實現(xiàn)對其繁殖、應(yīng)激等生理水平的監(jiān)測[1-6]。與傳統(tǒng)采集動物血液[7]、組織樣品等方法相比，利用非損傷性取樣方法(Noninvasivesamplingmethods)[5,8]獲取動物糞便樣品，對動物的干擾最小[9,10]，成為分析動物類固醇激素水平的重要、可行途徑[11-13]。從動物糞便樣品中檢測到的一般都是類固醇激素的代謝物，而不是源激素[14]，這些代謝物容易受到微生物的降解[15]，野外環(huán)境的降雨、雪、日曬等均會加快降解反應(yīng)[16,17]。因此，隨著樣品在環(huán)境中滯留時間的增加，會使得其中的類固醇激素含量發(fā)生變化，影響動物糞便內(nèi)的類固醇激素含量。而明確糞便樣品中類固醇激素含量隨時間變化的情況，可以有效指導(dǎo)野外糞便樣品的正確采集，從而得到更為準(zhǔn)確科學(xué)的實驗結(jié)果。

在動物糞便類固醇激素的提取中，研究者通常取用少量的樣品量進(jìn)行類固醇激素提取的統(tǒng)計分析(0.2g)[18]。通過取用0.2g棕熊(Ursus arctos horribilis)糞便樣品來驗證季節(jié)、食物等對棕熊糞便糖皮質(zhì)醇激素的影響[19]，取用0.2g獵豹(Acinonyx jubatus)糞便樣品進(jìn)行樣品保存方式的研究[20]，取用0.2g的樣品量驗證不同儲存條件對野生狒狒(Papio cynocephalus)糞便樣品中類固醇激素的影響，從而得出-20℃冷凍是最佳條件的結(jié)論[21]。也有0.5g大熊貓濕糞樣品進(jìn)行有關(guān)雄性大熊貓(Ailuropoda melanoleuca)腎上腺皮質(zhì)激素隨季節(jié)變化的研究[22]。在鳥類等研究中，則僅能取用更少的樣品量(0.02g)，然而這可能給結(jié)果帶來一定的誤差[23]。

瀕危野生動物的非損傷性生理研究面臨著新鮮樣品較難獲取的問題[18]。首先，野外采集的糞便樣品通常并不是非常新鮮[24]，往往只能通過辨別其物理形態(tài)特征如糞便表層粘膜的新鮮程度等大致確定排出時間[25]，其次，采集到的樣品也不能及時的進(jìn)行檢測，通常要經(jīng)過一定時間的運輸和有效保存到實驗室后方能進(jìn)行檢測分析[26]，這會對諸如類固醇激素等生理激素水平的研究造成一定的影響。有研究發(fā)現(xiàn)，梅花鹿(Cervus nippon)的糞便類固醇激素在常溫(20℃)下只能有效保存24h[27]。圈養(yǎng)林麝(Moschus berezovskii)糞便孕酮及其代謝物在室溫條件下48h有明顯的上升趨勢，雌二醇、睪酮和皮質(zhì)醇及其代謝物在18h均出現(xiàn)顯著變化[28]。大熊貓(Ailuropoda melanoleuca)是我國特有的一級重點保護(hù)物種，也是國際動物保護(hù)的旗艦物種[29]。野外大熊貓種群稀少，總數(shù)量約1 864只[30]，生活在高海拔地區(qū)等獨特的生活特性使得針對該瀕危物種開展野外研究時同樣會面臨樣品獲取的問題。

為明確不同樣品分析量對檢測結(jié)果的影響，我們對比0.5g和0.2g兩個采樣量對檢測結(jié)果的影響。同時，為了解野外大熊貓糞便樣品中類固醇激素隨時間增加的變化情況，我們選取成都大熊貓繁育研究基地25只健康大熊貓個體為研究對象，采集新鮮糞便樣品，在模擬一定野外溫度環(huán)境下，對樣品在15d內(nèi)進(jìn)行類固醇激素的連續(xù)檢測和分析。本項研究旨在為野外環(huán)境下大熊貓糞便類固醇激素的研究提供參考。

表1　研究對象的基本信息

標(biāo)注：“*”表示野外救助大熊貓個體的估測出生日期。

1研究對象

以成都大熊貓繁育研究基地的25只健康大熊貓個體作為研究對象(見表1)。其中雄性12只，雌性13只。每只研究對象均單獨圈養(yǎng)，早晨從夜晚室內(nèi)籠舍處交換至戶外活動場自由活動，每日均以新鮮竹筍、竹子為食，并輔食有蘋果和其它人工精飼料(由牛奶和由豆粉、麩皮、雞蛋和胡蘿卜混合后蒸制所成)。研究期間，所有動物均健康狀況良好。

2研究方法

2.1樣品采集和處理

為驗證取樣量對結(jié)果的影響，我們選取大熊貓個體“北川”作為研究對象，采集其相鄰2個時間(分別為9∶30和10∶20)排出的全部新鮮糞便，其中先排出2團(tuán)糞便，隨后排出另外2團(tuán)糞便，分別標(biāo)記為A1、A2、A3、A4等四個組，然后分別采用0.5g和0.2g兩種分析量各3次，并立即提取皮質(zhì)醇激素。

同時，為驗證類固醇激素隨時間的變化情況，我們于2013年5月24日到 8月5日，每天早6∶00—9∶00，連續(xù)5 次等候采集全部25只大熊貓的新鮮糞便，一般為2 團(tuán)或 2 團(tuán)以上。為避免樣品污染，利用PE手套采集樣品后立即放入密封袋，記錄采集對象的名稱、日期、時間、地點，用冰盒帶回實驗室后，立即將采集到的樣品進(jìn)行稱重和分裝(每份5g)放入-20℃冰箱。每研究對象的樣品選用160份，首先取其中10份充分混合，雄性測定皮質(zhì)醇、睪酮值，雌性測定皮質(zhì)醇和孕酮值。同時，將余下的150份放于恒定溫度的貯藏室內(nèi)(13±2℃)，通風(fēng)放置6h、12h、18h、24h、36h、48h、72h、96h、120h、144h、168h、216h、264h、360h后，并測定各時間點的激素值。

2.2類固醇激素提取與測定

不同取樣量對比分析實驗中，皮質(zhì)醇激素的提取參照崔媛媛等[31]的方法，利用放射免疫分析法(Radioimmuoassay,RIA)進(jìn)行皮質(zhì)醇激素的檢測，放射性免疫分析試劑盒來自北京科美東雅有限公司生產(chǎn)的類固醇激素放射性免疫分析測定盒。試劑盒的主要技術(shù)參數(shù)為：(1)測定范圍為10—500ng/mL；(2)靈敏度<1ng/mL；(3)批內(nèi)變異系數(shù)<5%，批間變異系數(shù)<10%。

類固醇隨時間變化情況的實驗中，激素的提取參考Nie等[26]的方法，步驟如下：解凍糞便，剪碎使其充分混勻；稱取0.5g放入15mL離心管；加入6mL甲醇溶液(甲醇∶水 = 8∶1)；振蕩3min，充分溶解；在25℃，2 500g下離心15min；轉(zhuǎn)移2mL甲醇萃取液至5mL玻璃管；70℃干燥至甲醇溶液完全蒸發(fā)；加2mL磷酸鹽緩沖液(0.1M，pH7.0)重新溶解；將磷酸鹽緩沖液的提取液存放在-20℃的冰箱中冷凍待測定。激素的測定采用酶聯(lián)免疫吸附檢測法(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay，ELISA)，并參照大熊貓糞便樣品較為穩(wěn)定成熟的檢測程序，如[7]。具體步驟如下：首先，用抗體包被酶標(biāo)板，然后，配制標(biāo)準(zhǔn)液，稀釋樣品并用洗液清洗包被過的酶標(biāo)板，依次加入標(biāo)準(zhǔn)液、樣品、酶反應(yīng)物(cortisol-horseradisperoxidase)，1h后，取出洗板，加酶免反應(yīng)底物，最后在酶標(biāo)儀上進(jìn)行讀數(shù)。

2.3數(shù)據(jù)分析

在對數(shù)據(jù)的正態(tài)分布及方差齊性檢驗后，運用spss20.0[32]對不同放置時間下的糞便中的皮質(zhì)醇水平進(jìn)行單因素方差(One-WayANOVO)分析，顯著性水平為P<0.05，測定結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(X±SE)。

表2　不同樣品分析量皮質(zhì)醇結(jié)果

3結(jié)果

3.1不同分析量皮質(zhì)醇水平

分別對兩種分析量(0.5g和0.2g)皮質(zhì)醇水平進(jìn)行獨立樣本t檢驗，發(fā)現(xiàn)二者間具有差異顯著(P<0.001，見表2)，且0.5g穩(wěn)定性較高，即分析量為0.5g的標(biāo)準(zhǔn)差和標(biāo)準(zhǔn)誤差(分別為5.480、1.582)均小于0.2g的結(jié)果(分別為13.176、3.804)。

3.2不同時間的皮質(zhì)醇變化

隨時間增加，雌性和雄性的皮質(zhì)醇都出現(xiàn)下降趨勢，且在360h都達(dá)到最低值(分別為0.41±0.08ng/g和2.76±0.46ng/g)。雄性在48h后出現(xiàn)明顯差異(F=6.08，P<0.05，見圖1)，而雌性則在96h后出現(xiàn)顯著下降(F=5.96，P<0.05，見圖2)。

3.3雄性睪酮隨時間的變化

隨時間增加，雄性睪酮呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，但無明顯差異(F=0.813，P>0.05，見圖3)。相對于0h(3.62±0.64ng/g)，6h睪酮的水平降至3.45±0.84ng/g，并在18h降至最小水平2.31±0.66n/g，但隨后逐漸上升，在144h達(dá)到3.99±0.42ng/g，而在360h時為2.60±0.40ng/g。

3.4雌性孕酮隨時間的變化

相比較雄性，雌性孕酮水平在72h(3.42±0.28ng/g)和96h(3.07±0.34ng/g)時與0h(2.15±0.43ng/g)呈現(xiàn)顯著差異(F=2.365，P<0.05，見圖4)，而在其它時間則未有差異(P>0.05)。

4討論

本研究首次探討分析兩種不同樣品分析量對大熊貓糞便類固醇激素檢測分析的影響，結(jié)果表明0.5g和0.2g分析量之間差異顯著，且分析量大者檢測結(jié)果更穩(wěn)定。這與橫斑林鸮(Strix occidentalis)等一些鳥類的相關(guān)研究類似，因為很多鳥類(尤其鳴禽)糞便樣品的量少，因此，糞樣量會對檢測產(chǎn)生影響，甚至結(jié)果準(zhǔn)確性較差[33,34]。對于大型哺乳動物來說，盡管糞便比較大，但是有時為了取樣方便，節(jié)省樣品存放空間，常常只收集部分糞便樣品[35]。然而，由于糞便樣品中類固醇激素的分布是不均勻的，造成其取用部位對檢測結(jié)果有很大的影響[36]。當(dāng)然，影響糞便樣品測定結(jié)果的因素較多，不同時間排出的以及同一時間排出的大熊貓糞便激素值均是不同的，它們之間的關(guān)系還需要進(jìn)一步實驗探索。

在相同條件下，不同類型類固醇激素水平在不同時間下會出現(xiàn)不同的變化規(guī)律[37]。非洲黃狒狒(Macaca nemestrina)的糞便直接置于室溫保存時，雌二醇和孕酮的含量會在6h左右發(fā)生變化，雌二醇含量明顯下降，而孕酮的含量則明顯上升[15]。當(dāng)我們將新鮮大熊貓糞便樣品置于相對恒定條件下(13±2℃)，雄性睪酮在120h內(nèi)未出現(xiàn)顯著性變化，皮質(zhì)醇可穩(wěn)定保存48h；而雌性皮質(zhì)醇可穩(wěn)定保存72h，孕酮可穩(wěn)定保存48h?；谝巴鈿夂蚍矫婵紤]，四川作為主要分布區(qū)域其棲息地屬于以亞熱帶季風(fēng)氣候為基帶的山地氣候，年均氣溫約0.8—13℃[38]。因此，我們選擇13±2℃的模擬溫度，或許對野外大熊貓的類固醇激素了解具有一定的參考意義。當(dāng)然，野外環(huán)境天氣多變，以及食物的不同、季節(jié)的不同等等因素，這些都會使得糞便中類固醇代謝物的濃度發(fā)生變化。

盡管如此，利用非損傷性手段進(jìn)行瀕危野生瀕危動物的研究也越來越多[39]，然而，目前研究對于糞便樣品采集，特別對于野外環(huán)境下，其樣品采集的隨機性較大，僅根據(jù)經(jīng)驗來判斷[40]。我們就發(fā)現(xiàn)隨著放置時間的增加，大熊貓的皮質(zhì)醇、孕酮的平均測定值與冷凍保存的0h對照樣間均出現(xiàn)了顯著差異，說明皮質(zhì)醇和孕酮在測定時應(yīng)嚴(yán)格控制樣品時間。究其原因，可能與動物的排泄物中含有大量的胃腸細(xì)菌，以及外界的微生物將會分解糞便樣品所含的類固醇激素的代謝產(chǎn)物有關(guān)[41,42]。但野外動物的新鮮糞便的獲得卻并不容易，即便像全國大熊貓數(shù)量調(diào)查這樣大型的大熊貓野外調(diào)查活動，獲取的糞便大部分為陳舊糞便和并不是很新鮮的樣品[43]，因此，充分利用采集到的樣品進(jìn)行實驗分析也是十分重要的。

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ResearchontheEffectiveStoragePeriodandSampleQuantityforFecalSteroidsofGiantPandas

BIWenlei1,YANGZhisong2,CHENPeng1,CHENChao1,FENGFeifei1,JACOBROwens1,HOURong1,ZHANGZhihe1,LIMingxi1,QIDunwu1

(1.ChengduResearchBaseofGiantPandaBreeding,Chengdu610081,China;2.CollegeofLifeSciences,ChinaWestNormalUniversity,NanchongSichuan637009,China)

Abstract:Monitoring fecal steroid metabolites helps us understand the breeding ecology of wildlife,and,as a result,can improve the conservation and management of endangered species.However,the precision of the analyses used to detect-and the effective storage period of-fresh fecal steroids remain unclear.To determine the influence of sample mass on the results of steroid metabolite analyses,we compared between samples of 0.2 g and 0.5 g.To test the influence of time on the results,we collected feces from 25 pandas at the Chengdu Research Base of Giant Panda Breeding,which we studied under simulated field conditions(13±2℃),and tested steroid hormone daily for 360 hours.Our results showed that there were significantly different cortisol values between the 0.2g and 0.5g subsamples (p=0.000),and that the 0.5 g subsamples were more stable.The results of the fecal age sampling analysis indicate that the cortisol of the male panda was viable for 48 hours,however testosterone did not change significantly over the 360-hour period(F=0.813，P>0.05).For females,cortisol was viable for 72 hours(F=5.96，p<0.05),while progesterone remained stable for 48 hours(F=2.365，P<0.05).However,for the not fresh samples,we should detect the fecal steroid hormone in the effective period.

Keywords：giant panda feces;steroids;field conditions;effective storage period;precision

文章編號：1673-5072(2016)02-0131-06

收稿日期：2015-10-27

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(31101649；31372223)；成都大熊貓繁育基金會項目(CPF 2013-17CPF2014-11,CPF 2014-03)；成都市科技局項目(2015-HM01-00265-SF)

作者簡介：畢溫磊(1988—)，男，內(nèi)蒙赤峰人，碩士研究生，主要從事瀕危動物生理生態(tài)學(xué)研究。 通訊作者：齊敦武(1978—)，男，山東菏澤人，研究員，主要從事動物生態(tài)學(xué)方面研究。E-mail:qidunwu@163.com

中圖分類號：Q955；Q959.838

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.16246/j.issn.1673-5072.2016.02.002