王法章 張春梅

摘要：以核桃葉片為試材，探討了不同培養(yǎng)基種類和某些培養(yǎng)基成分對(duì)其離體培養(yǎng)褐變的影響。結(jié)果表明：核桃葉片外植體在MS紙橋培養(yǎng)基上培養(yǎng)10天發(fā)生褐變率較低，1/2MS次之，MS、B5和N6培養(yǎng)基外植體褐變率最高。添加200～500毫克/升檸檬酸可有效減輕外植體褐變；添加2000～2500毫克/升活性炭對(duì)褐變有作用但沒(méi)有檸檬酸效果好；而抗壞血酸對(duì)減輕外植體褐變無(wú)顯著作用。

關(guān)鍵詞：核桃；外植體；褐變；培養(yǎng)基

基金項(xiàng)目：甘肅省高校河西走廊特色資源利用省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（項(xiàng)目號(hào)XZ1003）

中圖分類號(hào)： S664.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A DOI編號(hào)： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.01.031

核桃（Juglans regia）是世界四大干果之一。目前世界核桃年產(chǎn)量92萬(wàn)噸，我國(guó)年產(chǎn)30萬(wàn)噸，占世界三分之一 [1]。核桃味甘、性溫，可補(bǔ)腎、固精強(qiáng)腰、溫肺定喘、破血祛瘀、潤(rùn)燥滑腸、補(bǔ)虛強(qiáng)體，提供營(yíng)養(yǎng)、消炎殺菌，養(yǎng)護(hù)皮膚、防癌抗癌、補(bǔ)腦。植物組織培養(yǎng)技術(shù)在眾多植物良種繁育上的成功應(yīng)用為核桃良種的快速繁殖提供了一條有效途徑[2，3]。王娟[4]等認(rèn)為適當(dāng)縮短轉(zhuǎn)瓶周期可抑制金薄香核桃莖段外植體褐變的發(fā)生。章鐵[5]等采用褐變抑制劑能明顯抑制大別山山核桃不同樹(shù)齡及不同部位的莖尖褐變。張小紅[6]等在培養(yǎng)基中加入核桃硫代硫酸鈉能防止褐變，并提高該種基因型核桃外植體萌芽率和新梢率。許傳俊[7]等認(rèn)為不同類型培養(yǎng)基對(duì)外植體的分化會(huì)產(chǎn)生不同的影響。尚旭嵐[8]等認(rèn)為采用液體培養(yǎng)基可有效克服鶴望蘭外植體褐變。梅興國(guó)[9]認(rèn)為培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽含量越低，外植體發(fā)生褐變程度越低，培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽濃度過(guò)高，可導(dǎo)致細(xì)胞褐變。

利用組織快繁技術(shù)，加速良種及其砧木無(wú)性苗的繁育，具有很高的商業(yè)價(jià)值。然而在核桃組織培養(yǎng)中，外植體一般在接種后就出現(xiàn)褐變，最后導(dǎo)致外植體褐變死亡，因此難以建立無(wú)性繁殖體系[10，11]。因而，在核桃離體培養(yǎng)中，防止外植體褐變死亡是其能否培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。本試驗(yàn)以核桃葉片為研究對(duì)象，研究培養(yǎng)基的種類及成分對(duì)核桃葉片褐變的影響，為核桃快速繁殖和組培提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1供試材料

參試核桃葉片采摘于甘肅河西學(xué)院。試驗(yàn)于2013年9月至2014年12月在河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院植物組織培養(yǎng)室進(jìn)行。

1.2外植體的滅菌

先用流水沖洗30分鐘，再用75%的酒精浸泡10分鐘，然后用0.1%的升汞浸泡3分鐘，最后再用無(wú)菌水沖洗3～5次后，放在無(wú)菌水中備用。

1.3培養(yǎng)基種類對(duì)外植體褐變的影響

分別配制MS、1/2MS、MS紙橋培養(yǎng)基、B5和N6培養(yǎng)基。以MS為對(duì)照。每種培養(yǎng)基接種數(shù)為50個(gè)，每天觀察外植體情況，記錄開(kāi)始發(fā)生褐變的外植體數(shù)以及褐變程度。外植體的褐變率（%）= 褐變的外植體數(shù)/總外植體數(shù)×100。

1.4抗氧化劑和吸附劑的作用

配制以下培養(yǎng)基：MS；MS + 200毫克/升檸檬酸；MS + 500毫克/升檸檬酸；MS + 1000毫克/升檸檬酸；MS + 5毫克/升抗壞血酸；MS + 10毫克/升抗壞血酸；MS + 20毫克/升抗壞血酸；MS + 1500毫克/升活性炭；MS + 2000毫克/升活性炭；MS + 2500毫克/升活性炭。

2 結(jié)果與分析

2.1培養(yǎng)基種類對(duì)核桃葉片外植體褐變的影響

表1 不同培養(yǎng)基對(duì)核桃葉片外植體褐變的影響

由表1可見(jiàn)，核桃葉片外植體用MS紙橋培養(yǎng)基培養(yǎng)的褐變率最低，培養(yǎng)10天尚未發(fā)生褐變，褐變率為0；在1/2MS培養(yǎng)基的褐變率次之，培養(yǎng)10天后34個(gè)發(fā)生褐變，褐變率為68%；而在MS、B5和N6培養(yǎng)基的外植體褐變率最高，培養(yǎng)10天全部發(fā)生褐變，褐變率為100%。

2.2抗氧化劑和吸附劑對(duì)核桃葉片外植體褐變的影響

表2 抗氧化劑和吸附劑對(duì)核桃葉片外植體褐變的影響

由表2可見(jiàn)，核桃葉片外植體在添加了抗壞血酸培養(yǎng)基中培養(yǎng)，褐變發(fā)生與對(duì)照沒(méi)有明顯差別，培養(yǎng)10天外植體基本全部褐變。培養(yǎng)基中添加活性炭，外植體出現(xiàn)黃化，培養(yǎng)10天也大部分褐變，但濃度為2000毫克/升或高于2000毫克/升時(shí)，可以較明顯地減輕褐變的發(fā)生。與對(duì)照相比，培養(yǎng)基加入檸檬酸，外植體褐變減輕。

3 討論與結(jié)論

3.1培養(yǎng)基類型對(duì)核桃葉片外植體褐變的影響

不同類型培養(yǎng)基對(duì)外植體的褐變程度會(huì)產(chǎn)生不同的影響。本研究結(jié)果表明，核桃葉片外植體在 MS、B5和N6培養(yǎng)基上的褐變發(fā)生均較為嚴(yán)重，而在1/2MS培養(yǎng)基上外植體褐變較輕，可能與1/2MS無(wú)機(jī)鹽濃度較低有關(guān)。這與前人的研究結(jié)果一致，有人認(rèn)為過(guò)高無(wú)機(jī)鹽濃度會(huì)引起某些植物外植體中酚類物質(zhì)氧化[12，13]。在桑樹(shù)組培中，1/2 MS培養(yǎng)基，降低無(wú)機(jī)鹽濃度能減輕褐化現(xiàn)象，降低褐化率[14]。油棕用MS培養(yǎng)基容易引起外植體的褐變，而用降低了無(wú)機(jī)鹽濃度的改良MS培養(yǎng)基時(shí)則可減輕褐變，并可誘導(dǎo)出愈傷組織和胚狀體[15]。紙橋培養(yǎng)基可以很好地抑制外植體的褐變，證實(shí)了尚旭嵐[16]的觀點(diǎn)，可能是由于濾紙吸附了有害的酚類物質(zhì)。

3.2培養(yǎng)基成分變化對(duì)核桃葉片外植體褐變的影響

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MS培養(yǎng)基缺乏微量元素或只加倍Fe鹽用量時(shí)，外植體褐變嚴(yán)重；若只加倍MS培養(yǎng)基中大量元素含量，褐變也較嚴(yán)重。本結(jié)果表明，培養(yǎng)基中的瓊脂含量降低，外植體褐變嚴(yán)重。這與前人的研究結(jié)果一致，李樹(shù)麗[17]認(rèn)為在一定范圍內(nèi)（瓊脂 5.0～6.5克/升），瓊脂用量越大，培養(yǎng)基硬度越大，褐變?cè)捷p。這可能是培養(yǎng)基的硬度影響了酚類物質(zhì)的擴(kuò)散速度的緣故。

3.3抗氧化劑和吸附劑對(duì)核桃葉片外植體褐變的影響

為了防止外植體褐變，通常在培養(yǎng)基中添加抗氧化劑或吸附劑，諸如抗壞血酸、檸檬酸和活性炭等。張衛(wèi)芳[18]認(rèn)為在培養(yǎng)基中加入抗氧化劑可減輕褐變。本實(shí)驗(yàn)中，檸檬酸能較好地抑制核桃葉片外植體褐變，而活性炭和抗壞血酸都不能有效地阻止核桃外植體褐變；這與前人的研究結(jié)果不一致，抑制銀杏愈傷組織褐變效果最好的抗氧化劑是抗壞血酸，其次是PVP [19]。但是活性炭在濃度為2000毫克/升或高于2000毫克/升對(duì)核桃外植體褐變也起一定的作用，但效果沒(méi)有檸檬酸好。結(jié)果表明，這些抗褐變劑對(duì)不同品種效果不同，說(shuō)明它們?cè)诜乐雇庵搀w褐變中的作用有一定局限性。因此，在對(duì)不同的材料進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)要選擇適宜的抗氧化劑或吸附劑。

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作者簡(jiǎn)介：王法章，河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，本科生在讀，研究方向：種子科學(xué)與工程。

通訊作者：張春梅，博士，河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，教授，研究方向：組織培養(yǎng)。