朱文浩，　駱　翔 ，　黃曉江，　王　偉△，　周匡果

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院 1神經(jīng)內(nèi)科，2血液內(nèi)科，武漢430030

基于高通量芯片和生物信息學(xué)探索肌萎縮側(cè)索硬化發(fā)病相關(guān)基因*

朱文浩1，駱翔1，黃曉江1，王偉1△，周匡果2

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院1神經(jīng)內(nèi)科，2血液內(nèi)科，武漢430030

摘要：目的從分子水平揭示肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)的發(fā)病機(jī)制，為臨床診療提供新工具。方法在GEO中檢索ALS患者芯片數(shù)據(jù)，使用BRB-Array Tools、GSEA、GOEAST、TOPPGENE等生物信息學(xué)工具進(jìn)行統(tǒng)合分析。結(jié)果對GSE56808和GSE26276兩個(gè)樣本集進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，發(fā)現(xiàn)6個(gè)共同差異表達(dá)基因，并進(jìn)行樣本層次聚類，功能富集主要集中在氧化應(yīng)激、鈣代謝障礙、炎癥反應(yīng)、血管生成、線粒體代謝、其它神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病、PI3K/AKT通路、P38MAPK通路、NOTCH通路等模塊上。利用多種分類預(yù)測工具構(gòu)建出一個(gè)包含6個(gè)特征基因的最優(yōu)化分類器，基本可用于區(qū)分ALS患者和健康對照組。結(jié)論利用多種生物信息學(xué)方法從不同的角度定義了ALS患者分子發(fā)病機(jī)制的表達(dá)特征，為進(jìn)一步的生物學(xué)探索提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：肌萎縮側(cè)索硬化；差異表達(dá)；基因芯片；生物信息學(xué)

肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是一種病情呈進(jìn)行性發(fā)展的致死性的神經(jīng)退行性病變，主要累及大腦皮質(zhì)、腦干、脊髓前角等處的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，可導(dǎo)致患者肌肉萎縮、癱瘓、甚至死亡。目前該病尚缺乏特效治療，預(yù)后不良，中位生存期僅為3～5年。研究發(fā)現(xiàn)ALS的神經(jīng)退行性變是多方面的，涉及到神經(jīng)元細(xì)胞和非神經(jīng)元細(xì)胞。根據(jù)發(fā)病特征，可將ALS分為有家族遺傳史的家族性ALS和無家族遺傳史的散發(fā)性ALS，家族性ALS具有明顯的遺傳傾向，已發(fā)現(xiàn)其相關(guān)基因有SOD1、TARDBP等；而剩下的90%～95%的ALS為散發(fā)性，與家族遺傳無相關(guān)性，被認(rèn)為是一種復(fù)雜性疾病，對于該病的發(fā)病機(jī)制目前尚無定論[1]。因此，在散發(fā)性ALS患者的早期診斷及治療、延長生存時(shí)間和提高生存質(zhì)量等方面，我們?nèi)悦媾R巨大的挑戰(zhàn)。高通量基因芯片是一種信息量大、靈敏度較高的工具，為研究散發(fā)性ALS發(fā)病機(jī)制提供了一種新的途徑。本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)，通過對2組散發(fā)性ALS患者基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)的統(tǒng)合分析，克服了個(gè)別芯片或單個(gè)實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)存在的不足，深入挖掘ALS相關(guān)基因功能和通路的變化，為該病診斷，藥物研發(fā)及治療等的探索提供了依據(jù)，為轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)提供新的研究思路。

1材料與方法

1.1基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)

在美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)下的基因表達(dá)匯編(Gene Expression Omnibus，GEO)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行芯片樣本篩選，樣本需滿足下列篩選標(biāo)準(zhǔn)：①ALS患者標(biāo)本，而非動(dòng)物模型；②散發(fā)性；③有原始的高通量芯片數(shù)據(jù)。歸類整理后發(fā)現(xiàn)，由Raman等[2]提交的GSE56808樣本集和由Shtilbans等[3]提交的GSE26276樣本集滿足以上要求。多項(xiàng)研究表明ALS患者皮膚纖維母細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組改變可代表ALS患者疾病進(jìn)程[4-5]，GSE56808正是利用的ALS患者與健康對照人群的纖維母細(xì)胞進(jìn)行芯片研究的，它滿足樣本篩選標(biāo)準(zhǔn)共有12個(gè)，包括6個(gè)來源于ALS患者，6個(gè)來源于健康對照，采用的芯片分析平臺(tái)為GPL570，即Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0類型。而GSE26276中滿足上述標(biāo)準(zhǔn)共6個(gè)，其中ALS標(biāo)本有3個(gè)，健康對照3個(gè)，來源于各自的骨骼肌樣本，采用的芯片分析平臺(tái)為GPL6244，即Affymetrix Human Gene 1.0 ST Array類型。

1.2差異基因的篩選和樣本聚類

將GSE56808和GSE26276兩組芯片分別導(dǎo)入軟件BRB-Array Tools 4.4[6]中進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制。采用中位值的方法將數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，質(zhì)量控制時(shí)要求：①截?cái)嘈盘?hào)強(qiáng)度大于10 000的值；②基因中位數(shù)值至少發(fā)生1.5倍改變，且不少于20%的樣本數(shù)；③對數(shù)化后的基因表達(dá)量變異P值小于0.01；④數(shù)據(jù)缺失值不超過50%?；蜻^濾之后，再將樣本分成兩組表型(ALS患者與健康對照組)篩選差異基因。分別對兩組數(shù)據(jù)集GSE56808和GSE26276進(jìn)行非配對樣本t檢驗(yàn)，差異基因需滿足：①P<0.05；②倍數(shù)變化> 2或者<0.5，倍數(shù)變化> 2為上調(diào)基因，<0.5為下調(diào)基因；③FDR<0.25。然后再交叉比較所獲得的差異基因，從而克服單個(gè)芯片數(shù)據(jù)或單個(gè)實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)存在的缺陷，更加全面地從整體上對疾病進(jìn)行研究。在GSE56808和GSE26276中，分別根據(jù)各樣本基因表達(dá)情況，判別樣本之間的距離，采用中心相關(guān)和平均距離的方法進(jìn)行層級聚類。

1.3差異基因功能分析和基因集富集分析

利用GOEAST(http：//omicslab.genetics.ac.cn/GOEAST/tools.php)和TOPPGENE(https：//toppgene.cchmc.org/enrichment.jsp)在線分析工具進(jìn)行GO(Gene Ontology)本體和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析。利用Expression console軟件將兩組基因表達(dá)數(shù)據(jù)整理成芯片表達(dá)數(shù)據(jù)文件和表型數(shù)據(jù)文件，上傳至GSEA(Gene Set Enrichment Analysis)分析平臺(tái)中(http：//www.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)，研究ALS相關(guān)基因表達(dá)與已定義的生物學(xué)過程功能模塊相比，是否有一致的表達(dá)趨勢。生物學(xué)過程相關(guān)的功能模塊從分子標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫(Molecular Signatures Database，MSigDB)獲得。

1.4分類預(yù)測工具尋找特征基因

為了研究ALS患者疾病相關(guān)的特征基因表達(dá)模式，本研究利用多種分類預(yù)測工具對兩組患者樣本進(jìn)行判別分析，并將GSE56808和GSE26276兩組數(shù)據(jù)集互相做交叉驗(yàn)證，通過創(chuàng)建分類器來判斷某一樣本究竟屬于哪個(gè)分類(ALS患者組或?qū)φ战M)，從而尋找ALS患者的分子標(biāo)簽。選擇最佳組合且盡量少數(shù)目的特征基因作為標(biāo)簽，可能會(huì)在生物學(xué)意義方面更易解釋，在臨床實(shí)踐上更方便應(yīng)用。分類預(yù)測工具包括混合協(xié)變量分類器(Compound Covariate Predictor)、對角線線性判別分析(Diagonal Linear Discriminant Analysis)、最近鄰分類器(Nearest Neighbor Predictor)、最近鄰質(zhì)心分類器(Nearest Centroid Predictor)和支持向量機(jī)(Support Vector Machines)。

2結(jié)果

2.1差異基因的篩選和樣本聚類

經(jīng)過嚴(yán)格的數(shù)據(jù)過濾和篩選，GSE56808數(shù)據(jù)集中滿足條件的差異基因有128個(gè)，其中在ALS患者中上調(diào)基因69個(gè)，下調(diào)基因有59個(gè)。GSE26276數(shù)據(jù)集中差異基因有154個(gè)，在ALS患者中上調(diào)基因114個(gè)，下調(diào)基因有40個(gè)。統(tǒng)合兩組差異基因，共同差異基因有6個(gè)，分別為：CPNE8、CRY1、DCLK1、NPR3、S100A10、WSB1(圖1A)。并利用6個(gè)共同差異基因分別在GSE56808(圖1B)和GSE26276(圖1C)樣本中進(jìn)行層次聚類，其中“0”表示健康對照組，“1”表示ALS患者樣本。

2.2差異基因功能分析和基因集富集分析

對GSE56808和GSE26276兩個(gè)樣本集分別進(jìn)行功能富集注釋，并進(jìn)行相互比較，重合的GO本體功能富集注釋見表1，重合的GSEA基因集富集結(jié)果見表2。主要集中在凋亡、氧化應(yīng)激、鈣代謝障礙、炎癥反應(yīng)、血管生成、線粒體代謝、其它神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病、PI3K/AKT通路、P38MAPK通路、NOTCH通路等功能模塊上(圖2、3)。

A：維恩圖顯示各個(gè)研究隊(duì)列差異基因的數(shù)目及交集；B、C：利用6個(gè)共同差異基因分別在GSE56808(B)和GSE26276(C)樣本中層次聚類圖圖1　共同差異基因及樣本聚類Fig.1 Common differential expression genes and sample clustering

2.3分類預(yù)測工具尋找特征基因

本研究用多種分類預(yù)測工具構(gòu)建出一個(gè)包含6個(gè)特征基因的最優(yōu)化分類器，即CRY1、S100A10、CPNE8、WSB1、KLF9、NPR3，用于預(yù)測某一未知樣本是ALS患者還是健康對照患者。各個(gè)預(yù)測方法的特異度、靈敏度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值如表3所示，“1”表示百分之百地正確判斷哪些樣本是ALS患者，“0”則為沒有一個(gè)樣本被預(yù)測正確?？梢钥闯鼋^大多數(shù)的樣本可以被正確地預(yù)測，說明這6個(gè)特征基因基本可以用于區(qū)分ALS患者和健康對照組。

表1　GSE56808和GSE26276重合的GO本體功能富集注釋

表2　GSE56808和GSE26276重合的GSEA分析

在樣本集GSE26276中，GSEA顯示ALS患者較健康對照者來說，在有關(guān)凋亡(A)，G2M細(xì)胞周期調(diào)節(jié)點(diǎn)(B)，炎癥反應(yīng)(C)，PI3K-AKT-MTOR信號(hào)通路(D)等模塊上存在功能富集變化圖2　GSE26276的GSEA富集分析Fig.2 GSEA of GSE26276

在樣本集GSE56808中，GSEA顯示ALS患者較健康對照者來說，在有關(guān)血管生成(A)，凋亡(B)，線粒體代謝(C)，有關(guān)帕金森通路(D)等模塊上存在功能富集變化圖3　GSE56808的GSEA富集分析Fig.3 GSEA of GSE56808

樣本集參數(shù) 混合協(xié)變量分類器對角線線性判別分析最近鄰分類器最近鄰質(zhì)心分類器支持向量機(jī)GSE56808靈敏度0.920.830.920.921特異度0.920.830.920.921陽性預(yù)測值0.860.750.860.861陰性預(yù)測值0.860.750.860.861GSE26276靈敏度11111特異度11111陽性預(yù)測值11111陰性預(yù)測值11111

3討論

ALS是一種以腦運(yùn)動(dòng)皮層、腦干和脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元進(jìn)行性破壞為特征的致命的遲發(fā)性神經(jīng)退行性疾病，發(fā)病后逐漸出現(xiàn)軸索變性、肌肉萎縮、肌肉癱瘓及死亡。迄今尚無公認(rèn)能顯著改善癥狀或逆轉(zhuǎn)病程的有效治療手段，ALS患者大多起病隱匿，臨床表現(xiàn)多種多樣，且缺乏絕對的生物學(xué)確診指標(biāo)，故對該病的早期診斷較為困難。利用多項(xiàng)國際合作計(jì)劃建立的免費(fèi)公共數(shù)據(jù)庫，通過生物信息學(xué)探索高通量測序或基因芯片蘊(yùn)藏的信息，可能為ALS分子發(fā)病機(jī)制研究提供了一種新的解決途徑，從而為ALS靶向藥物的研發(fā)及個(gè)性化治療等更深入的探索提供了依據(jù)。

目前研究結(jié)果認(rèn)為ALS的發(fā)病機(jī)制是多種因素相互交織的，而非單因素造成，它們或互為因果或互為協(xié)同關(guān)系影響著疾病的發(fā)生發(fā)展。主要包括氧化應(yīng)激、興奮性氨基酸毒性、細(xì)胞凋亡、線粒體功能障礙、軸突運(yùn)輸障礙、自身免疫機(jī)制、鐵代謝和鈣穩(wěn)態(tài)障礙等[1]。本研究通過2個(gè)芯片樣本集的差異基因功能分析和基因集富集研究提示，ALS引起的差異基因主要集中在凋亡、氧化應(yīng)激、鈣代謝障礙、炎癥反應(yīng)、血管生成、線粒體代謝、其它神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病、PI3K/AKT通路、P38MAPK通路、NOTCH通路等功能模塊上。例如：P38MAPK通路的活化，可促進(jìn)IL-1及TNF-α的合成，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，導(dǎo)致神經(jīng)元的變性凋亡[7]；PI3K/AKT信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元的突觸可塑性、神經(jīng)傳導(dǎo)、蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)及應(yīng)激反應(yīng)[8]；血管生成障礙可直接引起缺血缺氧以及與神經(jīng)變性病相關(guān)的毒性產(chǎn)物堆積，從而導(dǎo)致對神經(jīng)元的損害等[9]。有趣的是，通過GSEA功能富集分析，我們發(fā)現(xiàn)ALS患者疾病功能模塊竟富集到帕金森、阿爾茨海默病等疾病涉及的功能模塊上，這點(diǎn)與流行病學(xué)資料也是相吻合的，5%～17%的ALS伴有帕金森病，而ALS患者中帕金森病的發(fā)病率比健康對照組高[10-11]。表明ALS可能不是一種獨(dú)立的疾病，ALS與其它神經(jīng)變性病在基因、病理生理、發(fā)病機(jī)制、臨床表現(xiàn)等方面表現(xiàn)出部分重疊。在時(shí)間、環(huán)境和遺傳因素等綜合作用下，ALS可伴有其它神經(jīng)系統(tǒng)變性病，表現(xiàn)出多系統(tǒng)疾病的相似性。

同時(shí)，本研究還通過GSE56808和GSE26276差異基因統(tǒng)合分析，發(fā)現(xiàn)有6個(gè)在ALS中共同變化的基因(分別為：CPNE8、CRY1、DCLK1、NPR3、S100A10、WSB1)，其中不乏包括一些值得關(guān)注的，且已知與神經(jīng)退行性變發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因。例如：DCLK1被認(rèn)為是參與神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育、遷移、凋亡、軸突發(fā)生、鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)過程[12]；CPNE8作為一種鈣依賴的膜蛋白，目前已表明其異常表達(dá)在帕金森神經(jīng)退行性變中起重要作用[13]；而NPR3則主要參與大腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞及骨骼肌的代謝和生長相關(guān)等[14]。這些基因可能為治療ALS提供一些新的靶點(diǎn)。此外，本研究通過分類預(yù)測工具尋找特征基因，并將GSE56808和GSE26276兩組數(shù)據(jù)集互相做交叉驗(yàn)證，構(gòu)建了6個(gè)特征基因構(gòu)成的分類器，基本可區(qū)分絕大多數(shù)的ALS患者和健康對照，可能會(huì)為早期診斷ALS提供一種新思路，在臨床實(shí)踐上更易應(yīng)用。

綜上，本研究綜合利用多種生物信息學(xué)手段，對兩組不同來源的芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)合。充分挖掘與分析公共數(shù)據(jù)庫內(nèi)基因芯片內(nèi)蘊(yùn)藏的信息，尋找ALS相關(guān)的分子標(biāo)簽、差異表達(dá)基因和功能模塊及通路的變化，從不同的角度定義了ALS患者分子發(fā)病機(jī)

制的表達(dá)特征，為進(jìn)一步的生物學(xué)驗(yàn)證的探索提供了依據(jù)，并有可能成為未來神經(jīng)退行性疾病診斷和治療的新靶點(diǎn)。

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(2016-01-11收稿)

Analysis of Amyotrophic Lateral Sclerosis Associated Genes Based on High-throughput Microarray and Bioinformatics

Zhu Wenhao，Luo Xiang，Huang Xiaojiangetal

DepartmentofNeurology，TongjiHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China

AbstractObjectiveTo explore the molecular pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis(ALS)，and provide novel tools for clinical diagnosis and treatment of ALS.MethodsGene expression profiles were obtained from GEO database.A set of bioinformatics tools，such as BRB-Array Tools，GSEA，GOEAST，TOPPGENE，were used to accomplish the data mining.ResultsBy combining the results of two independent samples GSE56808 & GSE26276，six common differentially expressed genes were identified，which were used to generate hierarchical clustering.Network and functional enrichment showed that ALS related genes were closely associated with oxidative stress，calcium metabolism disorders，inflammation，angiogenesis，mitochondrial metabolism，other neurodegenerative disorders and etc.They played essential roles in some important signal pathways such as PI3K/Akt，P38 MAPK，NOTCH，etc.The optimal six-gene classifier constructed by multiple prediction tools for classification could differentiate the ALS patients from healthy control subjects.ConclusionData Mining and Bioinformatics analysis can help to investigate the molecular pathogenesis of ALS in various perspectives，which provides the basis for further biological investigations on ALS.

Key wordsamyotrophic lateral sclerosis；differential expression；microarray；bioinformatics

中圖分類號(hào)：R744.8

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.03.002

*國家自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目(No.81400122)

朱文浩，男，1983年生，主治醫(yī)師，博士研究生，E-mail：whzhu@tjh.tjmu.edu.cn

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：wwang_tjh@126.com