袁　娟，郭清泉，徐　勇

(1. 廣東省食品工業(yè)研究所，廣東 廣州 510308；2. 廣東工業(yè)大學(xué) 輕工化工學(xué)院，廣東 廣州 510006)

二氫楊梅素-銅配合物抗氧化活性的研究

袁娟1，郭清泉2，徐勇1

(1. 廣東省食品工業(yè)研究所，廣東 廣州 510308；2. 廣東工業(yè)大學(xué) 輕工化工學(xué)院，廣東 廣州 510006)

摘要:首先合成氫楊梅素-銅(DMY-Cu(Ⅱ))配合物，通過紫外光譜、紅外光譜、熱重-熱差分析(TG-DTA) 及元素分析對DMY-Cu(Ⅱ)金屬配合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征.結(jié)果表明，DMY易與Cu2+形成配合物，其組成為[C15H10O8Cu]·H2O.進(jìn)一步地研究了DMY-Cu(Ⅱ)金屬配合物對超氧陰離子自由基·)、羥基自由基(OH·)及DPPH 自由基(DPPH·)的清除作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DMY-Cu(Ⅱ)配合物對·和DPPH·具有顯著的清除效果，且清除效果比單獨(dú)配體DMY更強(qiáng).

關(guān)鍵詞:DMY-Cu(Ⅱ)配合物； 羥基自由基； 超氧陰離子自由基； DPPH自由基

二氫楊梅素(Dihydromyricetin，DMY) 是天然多酚羥基雙氫黃酮醇類化合物，為藤茶中的主要活性成分，在藤茶幼嫩的莖葉中含量很高，達(dá)38%以上[1].DMY在抗菌、抗氧化、降血糖、降血脂、增強(qiáng)免疫、保肝、抗癌等方面具有顯著的生理活性，其生理毒性較小.其中，在抗氧化方面DMY可抑制自由基對人體各組織器官的損害，且隨著DMY純度(60%～90%) 的增加，其抗氧化活性明顯增強(qiáng)[2-5].

1實(shí)驗部分

1.1儀器及試劑

VERTEX70型FTIR傅立葉紅外光譜儀(德國Bruker公司)；FluoroMax-4VPF-100型熒光分光光度計(法國HORIBAJobinYvon公司)；STA-409PC集合熱分析儀(德國耐馳儀器制造有限公司)(升溫速率為15 ℃/min，空氣氣氛，從室溫升至800 ℃)；VarioEL元素分析儀(德國Elementar公司)；DF-101S型定時恒溫磁力攪拌器(予華有限公司).

DMY(99%) 自制；1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH) (美國Sigma公司)；鄰苯三酚、醋酸銅、雙氧水等均為分析純試劑.

1.2實(shí)驗方法

1.2.1二氫楊梅素-銅配合物的制備

稱取0.920g(4.0mmol)DMY，置于160mL無水乙醇中，加熱、攪拌至完全溶解后，加入適量的無水醋酸鈉調(diào)節(jié)pH值至7.0～8.0，繼續(xù)攪拌1h，而后加入0.798g(4.0mmol) (CH3COO)2Cu·2H2O，在70 ℃下攪拌回流8h.然后待靜置析出紅褐色沉淀物后減壓抽濾，將抽濾得到的沉淀物依次用無水乙醇和水反復(fù)洗滌.最后干燥，得到的紅褐色粉狀固體即為DMY-Cu(Ⅱ)金屬配合物.

據(jù)文獻(xiàn)[12-13]取5mL50mmol/LTris-HCl緩沖液(pH為8.2)，加入無水乙醇和去離子水各1mL，混和均勻后在25℃的水浴中保溫20min.然后加入0.5mL濃度為3mmol/L的鄰苯三酚(用10mmol/LHCl配制)，空白組為10mmol/L的HCl溶液，迅速搖勻之后在波長320nm下每隔30s測定其吸光度，計算線性范圍內(nèi)1min吸光值的增加值A(chǔ)1即鄰苯三酚的自氧化速率.另外取5mL50mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH為 8.2)，在加入鄰苯三酚前先加入1mL的DMY-Cu(Ⅱ)金屬配合物溶液(無水乙醇溶解)，同樣方法操作，計算線性范圍內(nèi)每lmin吸光度的增加值A(chǔ)x即為加樣品后鄰苯三酚的自氧化速率.每個樣品平行操作3 次，求其平均值.清除率=[(A1-Ax)/A1]×100%.

1.2.3羥自由基OH·清除率的測定

根據(jù)Fenton方法[14]，H2O2與亞鐵離子可反應(yīng)生成OH·，OH·存活時間較短但具有很高的活性.OH·用水楊酸顯色能形成紅色物質(zhì)，該物質(zhì)在波長510nm處能被較強(qiáng)地吸收.由于其呈色與OH·量成正比，若在該體系中加入具有清除OH·功能的化合物，則會使有色物質(zhì)的濃度大為降低.本實(shí)驗采用Fenton方法研究DMY-Cu(Ⅱ)金屬配合物清除OH·的能力.取3.00mL2mmol/LFeSO4溶液，3.00mL6mmol/L水楊酸-乙醇溶液，3mL樣品液(DMY-Cu(Ⅱ)金屬配合物溶液)以及0.3mL0.3%H2O2溶液，混勻后在37℃的恒溫水下反應(yīng)40min，在510nm處測定其吸光度值A(chǔ)x.另外以0.3mL的蒸餾水代替0.3mL0.3%H2O2溶液，同樣方法操作，在510nm處測定其吸光度值A(chǔ)1.用3mL的蒸餾水代替3mL樣品液， 同樣方法操作， 測定吸光度值為A0.每個樣品平行操作3 次，求其平均值.清除率=[1-(Ax-A1) /A0]×100%.

1.2.4DPPH·清除能力測定

據(jù)文獻(xiàn)[15-16]取2mLDMY-Cu(Ⅱ)金屬配合物(無水乙醇溶解)，向其中加入2mL0.01mmol/LDPPH無水乙醇溶液，在室溫條件下避光反應(yīng)30min后，在波長 517nm處測量其吸光度Ax，用等體積的無水乙醇代替DPPH無水乙醇溶液作為空白組，在波長 517nm處測定其吸光度為 A1，直接用DPPH無水乙醇溶液作為對照組，測定其吸光度為A0.每個樣品平行操作3次，求其平均值.清除率=[1-( Ax-A1) /A0]×100%.

2結(jié)果與討論

2.1DMY-Cu(Ⅱ)金屬配合物的結(jié)構(gòu)表征

DMY及DMY-Cu(Ⅱ)金屬配合物的紫外光譜如圖1所示，圖1中DMY分別在200～230nm和280～310nm處有吸收峰.當(dāng)DMY與Cu2+螯合后DMY的吸收峰發(fā)生明顯的紅移，其紅移現(xiàn)象可能是由于DMY與Cu2+形成配合物后，DMY配體上-OH的氫電離導(dǎo)致苯環(huán)與氧原子的共軛作用加強(qiáng)，使共軛體系電子的離域性增大，躍遷的能量降低，則吸收峰的位置自然向低波數(shù)方向移動.由圖1表明DMY與Cu2+發(fā)生了螯合作用.

圖1　DMY-Cu(Ⅱ)金屬配合物及DMY的紫外光譜圖

采用KBr壓片法測定DMY-Cu(Ⅱ)金屬配合物與DMY的紅外吸收光譜(見圖2)，用元素分析儀分析配合物中C、O、H和Cu元素的含量，其實(shí)驗數(shù)據(jù)見表1.

圖2　DMY及DMY-Cu(Ⅱ)金屬配合物的紅外光譜圖

對比DMY與DMY-Cu(Ⅱ)金屬配合物紅外光譜可知，DMY-Cu(Ⅱ)金屬配合物在1 450～1 600cm-1處苯環(huán)骨架的吸收峰基本上無變化.同時C-O-C振動頻率也基本上無變化，這說明DMY與Cu2+發(fā)生螯合后其苯環(huán)結(jié)構(gòu)依然存在.在3 419.76cm-1出現(xiàn)-OH特征吸收峰，則說明DMY與Cu2+發(fā)生螯合后其-OH還存在.與DMY的紅外光譜相比，DMY的CO吸收峰在1 642cm-1，當(dāng)與Cu2+作用時其吸收峰紅移到1 584.82cm-1，此外配合物在649cm-1出現(xiàn)新的吸收峰，說明DMY與Cu2+發(fā)生了螯合作用并形成以Cu-O鍵結(jié)合的DMY-Cu(Ⅱ)金屬配合物.元素分析測得配合物中C、H、O和Cu元素的含量與理論計算的結(jié)果也相當(dāng).

表1　DMY-Cu(Ⅱ)配合物的元素分析數(shù)據(jù)

DMY-Cu(Ⅱ)金屬配合物的熱重分析結(jié)果如圖3所示.圖3中明顯看出DMY-Cu(Ⅱ)金屬配合物在100℃以下失重，其失重率約為4.23%，與失去1個水分子的量相當(dāng)(理論計算失重率為4.50%)，則說明此階段失重的水為配合物分子外的結(jié)晶水.在120～420 ℃的失重為配體的燃燒分解，當(dāng)溫度升至460℃后配合物基本上沒有失重，最后的殘余物為氧化銅19.48%(理論計算值為20.00%).從整個熱分解過程來看，DMY-Cu(Ⅱ)金屬配合物熱重的實(shí)驗值與理論計算值基本相吻合.另據(jù)紅外光譜的結(jié)果、元素分析及熱重分析可以推斷DMY易與Cu2+發(fā)生配合作用，其金屬配合物的組成為[C15Hl0O8Cu]·H2O.

2.2DMY-Cu(Ⅱ)配合物對自由基的清除作用

圖3　DMY-Cu(II) 配合物的TG-DTA 分析

2.2.2DMY及DMY-Cu(Ⅱ)配合物對OH·的清除DMY和DMY-Cu(Ⅱ)金屬配合物對OH·清除測試結(jié)果如圖5所示，其清除效果均隨濃度的增大而增大.在低濃度的情況下二者對OH·清除作用基本相近，無大差異.然而在質(zhì)量濃度大于60μg/mL后DMY-Cu(Ⅱ)配合物對OH·清除效果明顯優(yōu)于DMY，說明Cu2+與有機(jī)活性配體DMY協(xié)同作用可提高DMY抗OH·活性的能力.

圖5DMY及DMY-Cu(Ⅱ)配合物對OH·自由基的清除作用

Fig.5ScavengingeffectofDMYandDMY-Cu(Ⅱ)complexonOH·

2.2.3DMY及DMY-Cu(Ⅱ)配合物對DPPH·的清除從圖6可知，DMY和DMY-Cu(Ⅱ)金屬配合物對DPPH·均具有很好的清除作用，而且清除效果均隨濃度的增大而增大.當(dāng)DMY質(zhì)量濃度大于30μg/mL時，其清除率達(dá)到80%以上后，再隨著DMY濃度的增加，其清除率變化很小.而DMY-Cu(Ⅱ)配合物對DPPH·的清除率隨其濃度的增加呈線性增大，且相同濃度下DMY-Cu(Ⅱ)配合物對DPPH·的清除效果明顯優(yōu)于DMY，則說明Cu2+與有機(jī)活性配體DMY協(xié)同作用可提高DMY抗DPPH·活性的能力.

圖6DMY及DMY-Cu(Ⅱ)配合物對DPPH·的清除作用

Fig.6ScavengingeffectofDMYandDMY-Cu(Ⅱ)complexonDPPH·

3結(jié)論

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Study on Antioxidant Activities of the Complex of DMY-Cu(Ⅱ)

Yuan Juan1, Guo Qing-quan2, Xu Yong1

(1.GuangdongFoodIndustryResearchInstitute，Guangzhou510308,China;2.SchoolofChemicalEngineeringandLightIndustry，GuangdongUniversityofTechnology，Guangzhou510006，China)

Abstract:This paper characterizes the structure of metal complex DMY-Cu(Ⅱ)after its preparation through UV spectroscopy, IR spectroscopy, elemental analysis and thermogravimetry-differential thermal analysis (TG-DTA). The results indicate that DMY and Cu2+ion are easy to form complexes whose composition is [C15H10O8Cu]·H2O. It further studies the scavenging capacity of DMY-Cu(Ⅱ)on superoxide anion radical · ), hydroxyl radical (OH·) and DPPH radical(DPPH·). The finding of the investigation is that the complex DMY-Cu(Ⅱ) has a great cleaning effect on · and DPPH·, which outweighs the DMY ligand.

Key words:complex of DMY-Cu (Ⅱ); hydroxyl radical; superoxide anion radical; DPPH radical

收稿日期:2015-03-16

基金項目:廣東省部產(chǎn)學(xué)研合作項目(2012B091100187); 廣東省科技計劃項目(2013B090900007)

作者簡介:袁娟(1987-)，女，助理工程師，主要研究方向為天然產(chǎn)物化學(xué).

doi:10.3969/j.issn.1007-7162.2016.02.016

中圖分類號:TS 202.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1007-7162(2016)02-0081-04