張 楊，肖小君，張明月，熊 芹，黃作喜

（內(nèi)江師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，四川內(nèi)江641199）

蠶蛹蟲草人工培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)

張 楊，肖小君，張明月，熊 芹，黃作喜＊

（內(nèi)江師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，四川內(nèi)江641199）

為蠶蛹蟲草的規(guī)?；a(chǎn)提供技術(shù)支撐，以野生北冬蟲夏草菌種為接種材料，以家養(yǎng)的活體桑蠶蛹為寄主，研究了蠶蛹蟲草菌種制備、接種、發(fā)菌至出草的人工培養(yǎng)條件。結(jié)果表明：接種前削去蠶繭后放置2d，可有效去除病蛹及生命體征弱的蠶蛹，能在源頭上控制污染；接種的蠶蛹蟲草液體菌絲的活度越高，接種后的蠶蛹僵化越快；接種部位選擇蠶蛹翼翅正后方與第3環(huán)節(jié)交叉點(diǎn)，易操作且蠶蛹體液和菌液不易溢出；菌絲完成營養(yǎng)生長后，給予300lx光照和10℃溫差刺激（300lx光照22℃培養(yǎng)14h，黑暗13℃培養(yǎng)10h為周期）培養(yǎng)7～10d能有效促進(jìn)蠶蛹蟲草菌絲轉(zhuǎn)色和子座的形成，在此條件下出草率達(dá)98.5%，蟲草平均鮮重達(dá)1.25g。

蠶蛹蟲草；人工培養(yǎng)；出草率；鮮重

蛹蟲草為子囊菌亞門、麥角菌目、麥角菌科、蟲草屬的模式種，其真菌學(xué)名為Cordyceps militaris，又名北冬蟲夏草、北蟲草等，世界性分布，天然資源數(shù)量很少［1］。中醫(yī)認(rèn)為，蛹蟲草的蟲草酸（D－甘露糖醇）入肺腎二經(jīng)，能滋肺陰、補(bǔ)腎陽，主治腎虛、陽痿遺精、腰膝酸痛、病后虛弱、久咳虛弱、勞咳痰血、自汗盜汗等癥，是一種能同時平衡調(diào)節(jié)陰陽的中藥。用活體蠶蛹接種生產(chǎn)蛹蟲草［2］，可連同蠶蛹采收、食用，營養(yǎng)價值高，味道鮮美，屬于高檔滋補(bǔ)品，在歐美及亞洲的韓國、日本等地倍受人們喜愛［3］，其經(jīng)濟(jì)價值是銷售蠶繭的20～30倍，蠶蛹蟲草規(guī)模化生產(chǎn)已成為蠶桑業(yè)增產(chǎn)創(chuàng)收的新途徑［4－5］。為蠶蛹蟲草的規(guī)模化生產(chǎn)提供技術(shù)支撐，筆者進(jìn)行了蠶蛹預(yù)處理消毒、接種部位篩選和光溫刺激等影響蠶蛹僵化率和出草率試驗。

1 材料與方法

1.1 菌株

供試菌株為野生北冬蟲夏草菌種，從廣東微生物實驗研究所采購。蠶蛹由內(nèi)江市東興區(qū)桑蠶養(yǎng)殖戶提供。

1.2 液體培養(yǎng)基的制備

準(zhǔn)確稱量馬鈴薯200g、葡萄糖20g、磷酸二氫鉀1.5g、硫酸鎂1.0g、檸檬酸銨2.0g、VB150mg和蛋白胨10g［6－7］。將馬鈴薯去皮后切塊，加純凈水1 000mL煮汁20min，用3～4層紗布過濾，濾液中加入上述試劑攪拌溶化，用純凈水定容至1 000mL，用250mL錐形瓶分裝后密封滅菌，靜置備用［8］。

1.3 培養(yǎng)接種菌液

在超凈工作臺上將試管菌株內(nèi)的菌種用接種鉤鉤出，用解剖刀將其切成米粒大小菌塊，接4～5塊于液體培養(yǎng)基中，25℃靜置24h后置于搖床內(nèi)，在22℃條件下120r／min搖菌［9－11］3d、4d、5d、6d、7d、8d、9d、10d、11d和12d。所得菌液用2層無菌紗布過濾，濾液備用。

1.4 蠶蛹的優(yōu)選、清洗和消毒

一般選擇化蛹2～4d的蠶蛹，接種前蛹體表面用棉花蘸取少許75%酒精迅速擦洗消毒，再用無菌水洗去殘留酒精［12］。從頂部破開蠶繭后分別放置0d、1d、2d、3d和4d，每組300頭蠶蛹，觀察期間徹底剔除病蛹、弱蛹，然后進(jìn)行接種試驗。

1.5 接種

在超凈工作臺上采用注射法接種，用1mL注射器給每只蠶蛹注射0.1mL左右菌液，以菌液不溢出為宜，以免體表滋生雜菌、引起交叉感染。注射部位選取頭部、背部第3環(huán)節(jié)處、腹部第3環(huán)節(jié)處、尾部、翼翅正后方與第3環(huán)節(jié)交叉點(diǎn)（圖1）。翼翅正后方與第3環(huán)節(jié)交叉點(diǎn)接種時注射器針頭插入蛹體表層1mm左右，然后讓針頭與蛹體平行，向前推進(jìn)3mm左右，注入菌液，迅速抽出針頭即可，其余接種部位僅需直接插入蛹體表層1mm左右，注入菌液即可。蠶蛹接種后放在玻璃培養(yǎng)皿中，每盤150只，每處理2盤。

圖1 蠶蛹蟲草接種部位Fig.1 Inoculation position of C.militaris

1.6 培養(yǎng)

將接種的蠶蛹放入培養(yǎng)箱，前期不加蓋，地面不補(bǔ)濕，空氣濕度保持在60%～65%，22℃黑暗密閉培養(yǎng)，培養(yǎng)3～5d后蛹體開始出現(xiàn)僵化現(xiàn)象，及時剔除未被蠶蛹蟲草菌感染和未僵化的蠶蛹；7～10d后氣門處可見白色菌絲，菌絲完成營養(yǎng)生長后立即給予光照和溫差刺激，用熒光燈均勻光照（300lx），22℃條件下培養(yǎng)14h，黑暗條件下13℃培養(yǎng)10h，以此為周期培養(yǎng)7～10d，以促進(jìn)菌絲轉(zhuǎn)色和原基的形成，地面全程補(bǔ)濕，空氣濕度保持在85%～90%，全程通微風(fēng)。子座完全形成后進(jìn)入出草階段，此時全天進(jìn)行300lx光照（散射光照應(yīng)置于蠶蛹蟲草的正上方，避免蠶蛹蟲草由于趨光性彎曲生長，以保證蟲草有良好的品質(zhì)），溫度22℃，地面全程補(bǔ)濕，空氣濕度保持在90%，全程通微風(fēng)［13］。在光照和溫差刺激菌絲轉(zhuǎn)色和蠶蛹蟲草子座形成的過程中，采用200lx、300lx、400lx光照和5℃、7℃、10℃、12℃溫差的培養(yǎng)條件進(jìn)行交互試驗。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

統(tǒng)計僵化率、出草率、子實體平均枚數(shù)和蟲草平均鮮重。僵化率是指蠶蛹接種3～5d后僵化的蠶蛹與接種蠶蛹總數(shù)的比值；出草率是指僵化后長出子實體的蠶蛹與僵化蠶蛹總數(shù)的比值；子實體平均枚數(shù)為蛹體上長出的子實體總數(shù)與出草蠶蛹總數(shù)的比值；蟲草平均鮮重是指蠶蛹蟲草的總鮮重與出草蠶蛹總數(shù)的比值。

2 結(jié)果與分析

2.1 破繭不同放置時間的接種效果

從表1可知，破繭不同放置時間對優(yōu)選蠶蛹及接種后的僵化率、出草率有明顯影響。破繭后蠶蛹當(dāng)天接種，由于病蛹、弱蛹剔除未盡，其僵化率、出草率分別為79.7%和93.3%。破繭后放置2d，可剔除破繭當(dāng)天不易發(fā)現(xiàn)的病蛹及生命體征弱的蠶蛹，還可保證蠶蛹的生命體征處于良好狀態(tài)，降低污染率，從源頭上有效地抑制污染以及交叉感染（病蛹、弱蛹不能及時僵化而產(chǎn)生霉菌，霉菌四處擴(kuò)散造成交叉污染），其僵化率、出草率分別達(dá)99.3%和99.2%。破繭后放置4d，雖然可以完全剔除陸續(xù)出現(xiàn)的病蛹及弱蛹，但此時蠶蛹的生命體征很弱，未等到蟲草菌種在其體內(nèi)建立起種群優(yōu)勢即死去，蠶蛹會腐爛發(fā)臭［14］，其僵化率、出草率分別為72.7%和79.6%，在相對封閉的培養(yǎng)箱中，對后續(xù)出草生長也有嚴(yán)重的負(fù)面影響。

表1 破繭不同放置時間的接種效果Table 1 Inoculation effect of silkworm cocoons after different cocoon－break preparation days

2.2 不同搖菌培養(yǎng)時間接種液體菌種的效果

用搖菌培養(yǎng)3d的液體菌種注射接種，其僵化天數(shù)較長，且僵化率較低，出草后的子實體品質(zhì)低（圖2－1），可能因為菌種搖菌培養(yǎng)時間過短，菌液中菌絲球少、濃度低，接種后蠶蛹體內(nèi)的菌絲量太少，與原有寄居的微生物不能形成競爭優(yōu)勢。培養(yǎng)8d，菌液中菌絲球量多，濃度較高，菌絲生長迅速，腐敗變質(zhì)的蛹體少，接種后的僵化率、出草率分別達(dá)99.2%和98%（圖3），子實體長而粗壯（圖2－2）。培養(yǎng)10d，菌液中的菌絲球濃度更高，但由于培養(yǎng)時間較長，菌液中營養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗殆盡，菌種也開始老化，生命力降低，將其接入蠶蛹后的侵染力下降，蛹體的僵化時間延長，僵化率和出草率也大幅降低，蟲草子實體短小，品質(zhì)低劣（圖2－3）。表明，液體菌種的搖菌培養(yǎng)時間對蠶蛹的僵化率、出草率均有明顯影響。

圖2 不同搖菌培養(yǎng)時間菌液接種蠶蛹蟲草的長勢Fig.2 Growth vigor of inoculated C.militaris after different shaking culture days under the liquid culture pattern

圖3 不同搖菌培養(yǎng)時間菌液接種蠶蛹蟲草的僵化率和出草率Fig.3Rigid rate and germination rate of inoculated C.militaris after different culture days under the shaking culture pattern

2.3 不同接種部位蠶蛹蟲草的生長效果

在蠶蛹的頭部進(jìn)行注射接種，蛹體僵化時間最短，但蛹體很快失去生命體征，導(dǎo)致其他菌類對蠶蛹蟲草菌的生長產(chǎn)生抑制，出現(xiàn)污染的同時對出草率產(chǎn)生較大影響。在蛹體的背部第3環(huán)節(jié)處、腹部第3環(huán)節(jié)處和尾部進(jìn)行注射接種，蠶蛹體液和注射菌液容易溢出，僵化時間稍長，培養(yǎng)過程中易發(fā)霉污染，并導(dǎo)致交叉感染。在蛹體翼翅正后方與第3環(huán)節(jié)交叉點(diǎn)進(jìn)行接種，易注射，且蠶蛹體液和注射菌液均不易溢出，可有效避免交叉感染，其接種的效果最好（表2），與柴建萍等［15］的研究結(jié)果相似。表明，在翼翅正后方與第3環(huán)節(jié)交叉點(diǎn)進(jìn)行注射接種的效果較好。

表2 蠶蛹不同部位接種的蟲草生長效果Table 2 Growth effect of inoculated C.militaris on different inoculation position of silkworm cocoons

表3 不同光照及溫差培養(yǎng)蠶蛹蟲草的生長效果Table 3 Growth effect of inoculated C.militaris under different light intensity and temperature difference

2.4 不同光照及溫差刺激下蠶蛹蟲草的生長效果

從表3可知，蠶蛹蟲草在300lx較強(qiáng)光照和10℃溫差刺激后，出草率和子實體品質(zhì)均較高，與冉翠香等［16］的研究結(jié)果相似。待蠶蛹蛹體完全僵化后7～10d，菌絲完成營養(yǎng)生長，在空氣濕度60%、光照300lx和溫度22℃條件下培養(yǎng)14h，將溫度降低至13℃黑暗培養(yǎng)10h，然后循環(huán)7～10d，能促進(jìn)菌絲轉(zhuǎn)色和子座的形成，其出草率和蟲草平均鮮重均較高，長勢旺盛（圖3－1），與李用芳等［17］的研究結(jié)果相似。光照弱不利于子座的形成，蟲草子實體細(xì)短（圖3－2），影響蟲草的品質(zhì)和產(chǎn)量；光照過強(qiáng)，子座形成緩慢且形成率低，降低出草率的同時蟲草子實體向四周散射生長且倒伏（圖3－3），也會影響到蟲草的品質(zhì)和產(chǎn)量［18］。溫差過小，刺激不夠，子座形成困難；溫差過大或低溫會導(dǎo)致蠶蛹蟲草菌生長停滯［19－20］。

圖3 不同光照及溫差培養(yǎng)蠶蛹蟲草的長勢Fig.3 Growth vigor of inoculated Cordyceps militaris under different light intensity and temperature difference

3 結(jié)論

1）試驗結(jié)果表明，蠶蛹破繭后放置2d再接種，有利于剔除后續(xù)出現(xiàn)的病蛹、弱蛹，且用于接種蠶蛹的生命體征處于良好狀態(tài)，可從源頭上抑制污染以及大面積交叉感染。液體菌種搖菌培養(yǎng)8d，培養(yǎng)菌液呈混濁狀態(tài)，微淺褐色，菌絲球量多，濃度較高，菌絲生長迅速，用于接種后蛹體的僵化時間縮短至3d，僵化率、出草率分別達(dá)99.2%和98%。

2）蠶蛹蟲草為營養(yǎng)滋補(bǔ)性中藥，為保證其可食用性，試驗過程選擇75%酒精涂抹消毒蛹體表面，然后用無菌純凈水沖去酒精，以達(dá)到消毒的目的，同時又不會殘留任何對人體有毒的物質(zhì)。接種部位以蛹體的翼翅正后方與第3環(huán)節(jié)交叉點(diǎn)最好，易注射，且蠶蛹體液和注射菌液均不易溢出，可有效避免交叉感染，其接種效果好。

3）在培養(yǎng)過程中，當(dāng)蠶蛹蟲草菌絲完成營養(yǎng)生長后，立即以光照強(qiáng)度300lx、溫度22℃條件培養(yǎng)14h，13℃黑暗條件培養(yǎng)10h為周期培養(yǎng)7～10d，即經(jīng)光照強(qiáng)度300lx和10℃溫差刺激有利于蠶蛹蟲草菌絲的轉(zhuǎn)色和子座的形成，在此條件下出草率達(dá)98.5%，蟲草平均鮮重達(dá)1.25g。

［1］王毅忱，郭文場.吉林左家自然保護(hù)區(qū)蛹蟲草資源的分布與利用［J］.特種經(jīng)濟(jì)動植物，2013（3）：34－36.

［2］王乃紅，靳月琴，蘆 成.柞蠶蛹蟲草的研究進(jìn)展［J］.中國蠶業(yè)，2014，35（1）：8－10.

［3］貢成良，彭國平，吳友良，等.家蠶蛹蟲草的人工培育及其成份分析［J］.中國食用菌，1993（4）：21－23.

［4］王羽騁，張愛華.家蠶蛹蟲草研究進(jìn)展［J］.江蘇蠶業(yè)，2005（2）：4－6.

［5］曾宏彬，宋 斌，李泰輝.蛹蟲草研究進(jìn)展及其產(chǎn)業(yè)化前景［J］.食用菌學(xué)報，2011，18（2）：70－74.

［6］張飛翔，張 慶.蛹蟲草人工瓶栽技術(shù)要點(diǎn)［J］.中國食用菌，2001（4）：29－30.

［7］薛建娥，冉翠香.蛹蟲草人工栽培種的分離與復(fù)壯［J］.食用菌，2002（2）：17－18.

［8］張 穎，王海燕.不同培養(yǎng)基配方對野生蛹蟲草菌絲生長的影響［J］.中國食用菌，2013，32（4）：25－26.

［9］陳晉安，黃 浩，鄭忠輝.蛹蟲草液體發(fā)酵條件的研究［J］.集美大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2001，6（3）：219.

［10］蘇 濤，李玉花，韓 梅.北蟲草高產(chǎn)菌株在改良人工培養(yǎng)基生長的研究［J］.中國食用菌，2008，27（2）：23－24.

［11］王戰(zhàn)勇，張建東，李 瑩，等.北蟲草液體培養(yǎng)基的研究［J］.遼寧石油化工大學(xué)學(xué)報，2004，24（1）：20－22.

［12］溫 魯，張以儉，張?zhí)鞂?，?蠶蟲草人工培育研究［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004（1）：91－92.

［13］李亞潔，孟 楠，石理鑫，等.蛹蟲草高產(chǎn)栽培技術(shù)研究［J］.食用菌，2009（1）：34－35.

［14］陳 丹，楊淑芳，劉學(xué)家.為害蛹蟲草害螨調(diào)查與防治要點(diǎn)［J］.食用菌，2002（2）：39.

［15］柴建萍，白興榮，謝道燕.蛹蟲草菌深沉發(fā)酵培養(yǎng)基正交實驗［J］.云南農(nóng)業(yè)科技，2001（3）：26.

［16］冉翠香，王 莉，許智宏.人工培育蛹蟲草子實體原基的誘發(fā)形成［J］.中國食用菌，2001，23（4）：9－10.

［17］李用芳.影響蟲草子實體生長的因素探討［J］.微生物學(xué)雜志，2000，20（4）：51－54.

［18］趙仁發(fā)，黃森倫，劉暢慶，等.冬蟲草（子實體）優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)栽培技術(shù)研究［J］.江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2007，19（8）：113－114.

［19］朱芬娣，水漢英，王雪梅，等.蠶蟲草小規(guī)模生產(chǎn)技術(shù)研究［J］.廣西蠶業(yè)，2005，42（1）：14－17.

［20］潘中華，貢成良，朱軍貞，等.蠶蛹蟲草工廠化培育工藝及應(yīng)用［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002（3）：21－24.

（責(zé)任編輯：馮 衛(wèi)）

Key Technique for Artificial Rearing of Cordyceps militaris

ZHANG Yang，XIAO Xiaojun，ZHANG Mingyue，XIONG Qin，HUANG Zuoxi＊
（School of Life Sciences，Neijiang Normal College，Neijiang，Sichuan641199，China）

The artificial rearing conditions for strain preparation，inoculation，germination and fruiting body of C.militaris were discussed by using living silkworm pupae as hosts and wild C.militaris as an inoculation material to provide the technical support for large－scale production of C.militaris.Results：The broken silkworm cocoons for 2dpreparation before inoculation can efficiently eliminate silk pupae and poor life sign pupae and control contamination at source.The more the hyphal activity of inoculated C.militaris in the liquid medium is，the quicker the rigidity of inoculated silkworm pupae is.The optimum inoculation position is the intersection between the direct view behind wing and third link，which is easy operation and difficult slop over of silkworm cocoon body fluid and fungus fluid.The optimum culture conditions including 300lx light intensity，10℃temperature difference（300lx light intensity at 22℃for 14hand in dark at 13℃for 10h）and 7～10dculture can efficiently promote hyphal coloring and stroma formation of C.militaris after hyphae finish their vegetative growth.The germination rate and average fresh weight of C.militaris under the optimum culture conditions reaches 98.5%and 1.25g separately.

Cordyceps militaris；artificial rearing；germination rate；fresh weight

Q93

A

1001－3601（2016）07－0300－0065－04

2016－03－30；2016－05－31修回

四川省教育廳高?？蒲袆?chuàng)新團(tuán)隊“川西珍稀植物保護(hù)與利用”（14TD0025）；內(nèi)江師范學(xué)院2014年度大學(xué)生科研資助項目“蠶

蛹蟲草關(guān)鍵技術(shù)研究”（14NSD－38）

張 楊（1993－），男，在讀本科，專業(yè)：組培技術(shù)及應(yīng)用。E－mail：542222561＠qq.com

＊通訊作者：黃作喜（1966－），男，教授，碩士，從事植物資源與利用研究。E－mail：huangzx118＠126.com