蔣 穎，吳石平，陳小均＊

（1.遵義市農(nóng)委，貴州遵義563000；2.貴州省植物保護(hù)研究所，貴州貴陽(yáng)550006）

植物保護(hù)·土壤肥料·微生物

貴州馬鈴薯炭疽病的診斷及病原鑒定

蔣 穎1，吳石平2，陳小均2＊

（1.遵義市農(nóng)委，貴州遵義563000；2.貴州省植物保護(hù)研究所，貴州貴陽(yáng)550006）

為準(zhǔn)確鑒別馬鈴薯炭疽病癥狀及病原菌種類，采用形態(tài)學(xué)觀察、ITS序列分析鑒定和分子系統(tǒng)學(xué)相結(jié)合的方法對(duì)貴州省內(nèi)馬鈴薯炭疽病病株進(jìn)行病原菌的分離與鑒定。結(jié)果表明：該病原菌為球炭疽菌（Colletotrichum coccodes）。目前，在省內(nèi)是首次對(duì)該病原進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定和報(bào)道。

馬鈴薯炭疽病；診斷；病原鑒定；貴州

馬鈴薯（Solannm tuberosumL）是貴州省重要糧經(jīng)作物，全省馬鈴薯種植面積約66.66萬hm2，僅次于水稻和玉米，在貴州農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占重要地位。馬鈴薯炭疽病又稱黑點(diǎn)病，是由半知菌亞門真菌球炭疽菌〔Colletotrichum coccodes（Wallr.）Hughes〕侵染引起，主要通過種薯和土壤傳播，能夠侵染馬鈴薯的塊莖、根、根莖部和葉片。在包括中國(guó)在內(nèi)的世界50多個(gè)國(guó)家均有發(fā)生［1－2］。該病是馬鈴薯種植區(qū)的一種具毀滅性且普遍發(fā)生的病害，條件適宜時(shí)迅速繁殖并大面積傳播。Tsror等［3－4］研究發(fā)現(xiàn)，該病對(duì)馬鈴薯產(chǎn)量及品質(zhì)影響極大，可致減產(chǎn)22%～30%。近年來，由于引種導(dǎo)致國(guó)內(nèi)部分地區(qū)發(fā)現(xiàn)與該病害相似的疑似病。為此，筆者采用形態(tài)學(xué)觀察與ITS序列分析鑒定相結(jié)合的方法對(duì)貴州省內(nèi)部分縣市馬鈴薯不同品種的馬鈴薯炭疽病疑似病株進(jìn)行病原菌的分離與鑒定，以期準(zhǔn)確識(shí)別并為該病害防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 病株 馬鈴薯品種為費(fèi)烏瑞它，其病株采自修文縣扎佐鎮(zhèn)和威寧縣麻乍鄉(xiāng)。

1.1.2 試劑75%酒精、1%次氯酸鈉溶液、PDA培養(yǎng)基、PDB培養(yǎng)基、液氮、無菌水、OMEGA柱式真菌DNA提取試劑盒，硫酸鏈霉素。

1.1.3 儀器與設(shè)備TOMY SX－500型高壓蒸汽滅菌器、科偉DNP－9052電熱恒溫培養(yǎng)箱、BIORAD C1000型PCR儀、水浴鍋、Thermo離心機(jī)、培養(yǎng)皿（d＝90mm）、三角瓶。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌的分離培養(yǎng) 將田間感病的馬鈴薯植株采回洗凈后，將根莖部先后用75%酒精和1%次氯酸鈉溶液表面消毒1min和3～5min，無菌水洗3次后切取小塊置于PDA（加入3mg／kg的硫酸鏈霉毒素霉抑制細(xì)菌）培養(yǎng)基上28℃黑暗培養(yǎng)，3～5d后在菌落邊緣挑取菌絲進(jìn)行純化備用［5］，菌株編號(hào)為GZIPP2.1001和GZIPP2.1002。

1.2.2 病原菌的回接與再分離 回接試驗(yàn)將采取菌土法和灌根法進(jìn)行。1）菌土法。用麥麩固體培養(yǎng)基在三角瓶培養(yǎng)出大量的病原微菌核后，將培養(yǎng)物與土壤混勻，混菌比例為5g／100g干土，將馬鈴薯的塊莖種植在菌土中。2）灌根法。將病原菌菌塊轉(zhuǎn)接于裝有PDB培養(yǎng)基的三角瓶中，置于250r／min的搖床上培養(yǎng)，待產(chǎn)生大量的黑色微菌核后，用此培養(yǎng)液對(duì)馬鈴薯植株進(jìn)行灌根，10mL／株。2種處理方法分別接種馬鈴薯10株，另設(shè)空白對(duì)照10株。待馬鈴薯植株感病后對(duì)病原進(jìn)行再次分離驗(yàn)證。

1.2.3 病原菌的形態(tài)特征觀察 將對(duì)再次分離純化后的病原菌接種到PDA上置于28℃培養(yǎng)，逐日觀察并記錄其形態(tài)特征，并測(cè)量分生孢子盤和分生孢子的大小。

1.2.4 病原菌的分子生物學(xué)鑒定1）DNA基因組提取。在PDB中進(jìn)行培養(yǎng)并收集菌絲體，取0.1g菌絲于液氮中迅速研磨成粉末，然后快速轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，并按OMEGA柱式真菌DNA提取試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行。2）PCR產(chǎn)物擴(kuò)增。采用多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的方法擴(kuò)增核糖體RNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）基因，ITS基因擴(kuò)增使用的引物為V9G［6］和ITS－4［7］。PCR產(chǎn)物由北京諾塞基因有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

對(duì)測(cè)序結(jié)果在核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank （http：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi）中進(jìn)行序列搜索，比較測(cè)試菌株與數(shù)據(jù)庫(kù)中相應(yīng)序列的同源程度。并結(jié)合病原菌的形態(tài)學(xué)觀察及致病性測(cè)定，最終確定病原菌種類。

2 結(jié)果分析

2.1 病原菌的形態(tài)特征

分離與再分離的菌株形態(tài)特征極為相似。病原菌在PDA平板生長(zhǎng)較為緩慢，24h、48h、72h和96h菌落直徑分別為1～2mm、16～18mm、30～32mm和38～41mm。菌落圓形，邊緣整齊，菌絲最初為白色，逐漸變成肉紅色，最終變成黑色。72h后在菌落4mm處開始產(chǎn)生微菌核。培養(yǎng)1周后，這些黑色微菌核密集形成塊狀的菌核布滿整皿（d＝90mm），有時(shí)呈扇型分布。在這些微菌核上聚生著黑色分生孢子盤（圖1），在分生孢子盤上著生有隔的剛毛，黑褐色。分生孢子長(zhǎng)橢圓形或紡錘形，中間部有縊縮，平均大小為5.575μm×19.85μm，2個(gè)油球在孢子的兩端。形態(tài)與魏周全等［8］的研究結(jié)果基本一致。因此，初步鑒定為C.coccodes。

圖1 馬鈴薯炭疽病的田間癥狀及病原特征Fig.1 Field symptom and pathogeny characteristics of potato black dot

2.2 病原回接后植株的發(fā)病癥狀

2種方法接種均能使植株感病，空白對(duì)照生長(zhǎng)正常，無任何病癥。感病后的馬鈴薯植株頂部葉片開始變黃、隨之?dāng)U展到中部和基部，甚至整株死亡；根莖部變黑至腐爛，濕度較大時(shí)在根莖部及內(nèi)腔產(chǎn)生大量點(diǎn)狀黑色的菌核，經(jīng)顯微觀察，這些小黑點(diǎn)上著生剛毛。與田間的癥狀表現(xiàn)一致。

2.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序所得序列與GenBank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行Blast分析的結(jié)果（圖2）表明，該序列與已報(bào)道的C.coccodes序列同源性最高，相似性達(dá)99%。通過分子系統(tǒng)學(xué)分析，在馬鈴薯病株上分離的2個(gè)菌株GZIPP2.1001和GZIPP2.1002與模式菌株C.coccodes CBS369.75和C.coccodes CPOS1聚在一支，支持率為99%。并與近緣種C.liriopes CBS122747、C.liriopes CBS119444、C.spaethianumCBS102642和C.spaethianumCBS167.49形成姊妹支，支持率為99%。因此，從分子系統(tǒng)學(xué)的角度確定該分離物為球炭疽菌（C.coccodes）。

圖2 馬鈴薯炭疽病病原菌及相關(guān)菌株的分子系統(tǒng)樹Fig.2 Polygenic molecular phylogenetic tree of pathogenic bacteria of potato black dot and related strains

3 結(jié)論與討論

1）綜合病原菌形態(tài)特征、回接植株發(fā)病癥狀和分子生物學(xué)鑒定技術(shù)，確定該病原菌為球炭疽菌（C.coccodes）。目前，在貴州馬鈴薯主栽區(qū)均有該病害的發(fā)生，可能發(fā)展成為馬鈴薯的一種主要真菌性病害，應(yīng)引起重視。

2）馬鈴薯炭疽病田間表現(xiàn)癥狀多樣，從根、地下莖和匍匐莖的腐爛，到地上部葉片的變黃和萎蔫，該癥狀極可能與其他病原菌引起的土傳病害癥狀相混淆。如，葉片發(fā)黃至枯萎癥狀與輪枝菌黃萎病和鐮刀菌枯萎病相似；地下莖和匍匐莖上的病斑也與馬鈴薯絲核菌相類似。因此，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)該病害癥狀識(shí)別、病原診斷和傳播途徑的了解。

3）馬鈴薯炭疽病在1997年發(fā)布的“中華人民共和國(guó)進(jìn)境植物檢疫潛在危險(xiǎn)性病、蟲、雜草名錄（試行）的通知”中被列為具有潛在危害的病害，說明，該病害對(duì)馬鈴薯生產(chǎn)帶來的影響極大。因此，在全國(guó)各省市應(yīng)加強(qiáng)對(duì)該病害的檢疫，避免病害的傳播與危害。

4）馬鈴薯炭疽病的病原主要以微菌核在塊莖、作物病殘?bào)w和土壤中越冬，作為初侵染源很容易進(jìn)行傳播［9］，且該病菌在土壤中存活長(zhǎng)達(dá)13年［10］，具有潛在危害特性。在防控方面應(yīng)加強(qiáng)檢疫，與其他非茄科作物的輪作時(shí)間至少以5年以上，在播種前對(duì)土壤進(jìn)行溴甲烷熏蒸，可以有效降低馬鈴薯炭疽發(fā)病率。

致謝：研究?jī)?nèi)容在貴州省植物保護(hù)研究所植病課題實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成，特此致謝！

［1］Johnson D A，Miliczky E R.Distribution and development of black dot，Verticillium wilt，and powdery scab on Rusot Burbank Potatoes in Washington State ［J］.Plant Dis，1993，77：74－79.

［2］中華人民共和國(guó)動(dòng)植物檢疫局.“中華人民共和國(guó)進(jìn)境植物檢疫潛在危險(xiǎn)性病、蟲、雜草名錄（試行）的通知”〔動(dòng)植檢植字（1997）33號(hào)〕［EB／OL］.（1997－01－01）［2016－04－30］http：／／www.aqsiq.gov.cn／zwgk／flgz／dzwjg／zw／200610／t20061027＿16851.htm.

［3］Tsror（Lahkim）L，Edich O.Hazanovsky M.Effect of Colletotrichum coccodes on potato yield，tuber quality，and stem colonization during spring and autumn［J］.Plant Disease，1999，83：561－565.

［4］Pacliata A，Kerr E D.Blank dot of potato caused by Colletotrichum coccodes in Nebraska［J］.Plant Dis，1992，76：1077.

［5］方中達(dá).植病研究方法［M］.3版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1998：124－343.

［6］Hoog G S，Ende A.Molecular diagnostics of clinical strains of filamentous Basidiomycetes［J］.Mycoses，1998，41：183－189.

［7］White T J，Bruns T，Lee S.PCR protocols：aguide to methods and applications［M］.San Diego：Academic Press，1990.

［8］魏周全，陳愛昌，駱得功，等.甘肅省馬鈴薯炭疽病病原分離與鑒定［J］.植物保護(hù)，2012，38（3）：113－115.

［9］Cullen D W，Lees A K，Totll I K，et al.Detection of Colletotrichum coccodes from soil and potato by conventional and quantitalive real－time PCR［J］.Plant Pathology，2002，51：281－292.

［10］Dillard H R，Cobb A C.Survival of Colletotrichum coccodes ih infected tomato tissue and in soil［J］.Plant Disease，1998，82：235－238.

（責(zé)任編輯：王 海）

Diagnosis and Identification of Potato Black Dot in Guizhou

JIANG Ying1，WU Shiping2，CHEN Xiaojun2＊
（1.Zunyi Agricultural Commission，Zunyi，Guizhou 563000；2.Guizhou Institute of Plant Protection，Guiyang，Guizhou550006）

In order to provide references for actually identify the symptom and pathogenic bacteria species of potato black dot，the pathogenic bacteria were isolated and identified by using methods of morphological observation，ITS sequence analysis and molecular systematics.Results：The pathogen was Colletotrichum coccodes，which was firstly identified and reported in Guizhou.

potato black dot；diagnosis；pathogen identification；Guizhou

S436.32

A

1001－3601（2016）07－0292－0033－03

2015－05－03；2016－06－14修回

蔣 穎（1980－）男，農(nóng)藝師，碩士，從事農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣工作。E－mail：89039720＠qq.com

＊通訊作者：陳小均（1979－），男，副研究員，碩士，從事植物病理及防治技術(shù)研究。E－mail：240255044＠qq.com