王林，劉冬云，李佳琦

（1.河北農(nóng)業(yè)大學園林與旅游學院，河北保定071000；2.河北旅游職業(yè)學院，河北承德067000）

生理生化·耕作栽培

野罌粟和禿瘡花花粉生活力的測定

王林1，劉冬云1，李佳琦2

（1.河北農(nóng)業(yè)大學園林與旅游學院，河北保定071000；2.河北旅游職業(yè)學院，河北承德067000）

為野罌粟和禿瘡花的雜交育種研究提供參考依據(jù)，以野罌粟（Papaver nudicarule）花粉和禿瘡花（Dicranostigma leptopodum）花粉為試驗材料，采用離體萌發(fā)法測定2種花粉的生活力，從而研究不同濃度的蔗糖、硼酸、氯化鈣培養(yǎng)液對野罌粟和禿瘡花花粉萌發(fā)率的影響。結(jié)果表明：離體萌發(fā)法測定野罌粟花粉生活力的最佳觀測時間為5h，最佳培養(yǎng)液組合為蔗糖80g／L＋硼酸40mg／L＋氯化鈣40mg／L，該培養(yǎng)組合萌發(fā)率為33.7%；離體萌發(fā)法測定禿瘡花花粉生活力的最佳觀測時間為5h，最佳培養(yǎng)液組合為蔗糖70g／L＋硼酸30mg／L＋氯化鈣30mg／L，該培養(yǎng)組合萌發(fā)率為33.1%。

野罌粟；禿瘡花；花粉；生活力；離體萌發(fā)法

野罌粟（Papaver nudicarule）和禿瘡花（Dicranostigma leptopodum）同屬罌粟科。野罌粟屬罌粟屬多年生草本植物，葉基生，有長柄，花瓣4片，橘黃色，倒卵形，花單生，稍下垂［1］；花期5—7月，花色艷麗，主要觀賞其黃色的花朵，有很高的觀賞價值，其群體花期較長，作為園林觀賞植物具有較大的開發(fā)價值［2］；分布于東北、內(nèi)蒙古、河北、山西、寧夏、新疆和西藏等地，在園林上應用廣泛，適宜植于草地、林緣，非常適宜作為觀花地被。禿瘡花（Dicranostigma leptopodum）屬禿瘡花屬兩年生草本植物［3］，高25～80cm；莖多數(shù)，綠色，具白粉，上部具多數(shù)分枝；基生葉叢生，葉片狹倒披針形；花瓣4，倒卵形或圓形，黃色，子房狹圓柱形；花期3—5月，果期6—7月；花期內(nèi)觀賞價值很高，在園林中具有較大的開發(fā)價值。

目前，對野罌粟和禿瘡花花粉生活力的研究鮮有報道，魏玉杰等［4］研究表明：紅花罌粟花粉萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基是瓊脂20g＋蔗糖110g／L＋硼酸110mg／L＋200mg／L Ca2＋＋80mg／LGA3。筆者采用離體萌發(fā)測定法測定對罌粟科的野罌粟和禿瘡花花粉的生活力，考察不同濃度蔗糖、硼酸和氯化鈣的培養(yǎng)液對野罌粟和禿瘡花花粉萌發(fā)率的影響，以確定最佳觀測時間和最合適的培養(yǎng)液，旨在為野罌粟和禿瘡花的雜交育種研究提供參考依據(jù)，以期培育出適合在園林上應用的具有觀賞價值和抗性強的優(yōu)良品種。

1 材料與方法

1.1 材料

以種植于河北農(nóng)業(yè)大學西校區(qū)野罌粟（Papaver nudicarule）和禿瘡花（Dicranostigma leptopodum）花粉為試驗材料。試驗于2015年4月中下旬在河北農(nóng)業(yè)大學園林與旅游學院基礎(chǔ)部301實驗室進行。

1.2 花粉的采集、培養(yǎng)

于當日清晨選取生長健壯的植株，并選擇即將開放或開放不久的花朵，用鑷子輕輕將2種花的花藥取出后分別放在鋪有硫酸紙的培養(yǎng)皿中。帶回實驗室散粉，在室溫條件下陰干后待用。

培養(yǎng)方法采用懸滴法［5－6］，滴1滴預先配制的培養(yǎng)液于載玻片的凹槽中，將收集的花粉用解剖針散在其上，并混勻，用鑷子輕輕蓋上蓋玻片，然后將載玻片放入帶有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，再將培養(yǎng)皿置于25℃恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，及時向培養(yǎng)皿中補充蒸餾水以保持濾紙濕潤，防止液滴蒸發(fā)。

1.3 最佳觀測時間及最適蔗糖濃度的確定

采用離體萌發(fā)法測定野罌粟和禿瘡花花粉的萌發(fā)率，根據(jù)前期預試驗配制0、50g／L、100g／L、150g／L和200g／L 5個濃度梯度的蔗糖培養(yǎng)液，向不同濃度的培養(yǎng)液中都添加10mg／L硼酸。每種濃度的培養(yǎng)液3次重復，每隔1h用光學顯微鏡觀測記錄，測定不同時間和不同濃度的萌發(fā)率。當萌發(fā)率不增加時即為最佳觀測時間，萌發(fā)率較大時的蔗糖濃度區(qū)域即為最適蔗糖濃度區(qū)域。

1.4 花粉萌發(fā)的觀測和統(tǒng)計

將培養(yǎng)皿從光照培養(yǎng)箱中取出，取下載玻片置于光學顯微鏡下觀測，先用10倍鏡找到花粉區(qū)域，再換成40倍鏡觀察，每個載玻片觀測3個視野，每個視野的花粉總數(shù)30個以上，記錄每個視野的花粉總數(shù)和萌發(fā)花粉數(shù)，計算每個視野的花粉萌發(fā)率［7］，取3個視野的平均萌發(fā)率作為該載玻片的萌發(fā)率。當花粉管長度大于花粉直徑時視為已萌發(fā)花粉［8］?；ǚ勖劝l(fā)率的計算公式［9］：

花粉萌發(fā)率＝（視野內(nèi)萌發(fā)的花粉數(shù)／視野內(nèi)的花粉總數(shù)）×100%

1.5 最佳培養(yǎng)液中單因素的確定

1.5.1蔗糖 根據(jù)1.3試驗結(jié)果確定的最適蔗糖濃度區(qū)域，將蔗糖的濃度梯度降低，配制50g／L、60g／L、70g／L、80g／L、90g／L、100g／L、110g／L、120g／L、130g／L、140g／L和150g／L的蔗糖培養(yǎng)液，每種培養(yǎng)液中添加10mg／L硼酸，采用離體培養(yǎng)法對野罌粟和禿瘡花花粉進行培養(yǎng)，培養(yǎng)至5h后，觀測花粉萌發(fā)情況并記錄數(shù)據(jù)以計算萌發(fā)率，萌發(fā)率最大時濃度即為蔗糖最適濃度。

1.5.2 硼酸 根據(jù)1.5.1測定的適宜野罌粟花粉萌發(fā)的最適蔗糖培養(yǎng)液濃度和禿瘡花花粉萌發(fā)的最適蔗糖培養(yǎng)液濃度，并分別加上一定濃度梯度的硼酸配制成蔗糖和硼酸培養(yǎng)液。硼酸選擇0、10mg／L、20mg／L、30mg／L、40mg／L和50mg／L 6個濃度梯度，相同的方法進行培養(yǎng)，培養(yǎng)至5h后，分別觀測花粉萌發(fā)情況并記錄數(shù)據(jù)計算萌發(fā)率，萌發(fā)率最大時的硼酸濃度即為硼酸的最適濃度。1.5.3氯化鈣 根據(jù)1.5.2測定的適宜野罌粟萌發(fā)的最適蔗糖、硼酸培養(yǎng)液濃度和適宜禿瘡花萌發(fā)的最適蔗糖、硼酸培養(yǎng)液濃度，分別再加上一定濃度梯度的氯化鈣配制成蔗糖、硼酸和氯化鈣培養(yǎng)液，氯化鈣選擇0、10mg／L、20mg／L、30mg／L、40mg／L和50mg／L 6個濃度梯度，相同的方法進行培養(yǎng)，培養(yǎng)至5h后，觀測花粉萌發(fā)情況并記錄數(shù)據(jù)計算萌發(fā)率，萌發(fā)率最大時的氯化鈣濃度即為氯化鈣的最適濃度。

1.6 最適培養(yǎng)液中蔗糖、硼酸、氯化鈣的濃度

根據(jù)1.5中測定的最適蔗糖、硼酸和氯化鈣濃度將蔗糖的濃度梯度進一步降低，野罌粟的蔗糖濃度選擇70g／L、75g／L、80g／L、85g／L和90g／L 5個濃度梯度，禿瘡花的蔗糖濃度選擇60g／L、65g／L、70g／L、75g／L和80g／L 5個濃度梯度，用相同的方法進行培養(yǎng)，培養(yǎng)至5h后，觀測花粉萌發(fā)情況并記錄數(shù)據(jù)計算萌發(fā)率。最終得出最適培養(yǎng)液中蔗糖、硼酸和氯化鈣的濃度及萌發(fā)率。

1.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用微軟EXCEL軟件［10］和SPSS數(shù)據(jù)處理軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 野罌粟與禿瘡花花粉的最佳觀測時間及最適蔗糖濃度

由圖1可見，野罌粟和禿瘡花花粉在25℃恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h后未萌發(fā)，2h后開始萌發(fā)，但萌發(fā)率很低且花粉管長度很短，隨著培養(yǎng)時間的延長，花粉萌發(fā)率逐漸提高，花粉管也逐漸加長，5h后萌發(fā)率達最大，7h后的萌發(fā)率幾乎不再增加，說明5h后花粉的萌發(fā)率趨于平穩(wěn)。在蒸餾水中培養(yǎng)的2種花粉最大萌發(fā)率分別為12.6%和10.5%，而在100g／L的蔗糖培養(yǎng)液中培養(yǎng)的花粉最大萌發(fā)率分別為20.9%和23.5%，說明野罌粟和禿瘡花花粉萌發(fā)需要消耗能量。當蔗糖濃度為150g／L和200g／L時花粉萌發(fā)率較低，說明蔗糖濃度過高抑制花粉萌發(fā)。由此確定，離體萌發(fā)法測定野罌粟和禿瘡花花粉生活力的最佳觀測時間為培養(yǎng)5h后，蔗糖的最適濃度為50～150g／L。

圖1 不同培養(yǎng)時間及蔗糖濃度野罌粟與禿瘡花的花粉萌發(fā)率Fig.1 Pollen germination rate of P.nudicarule and D.leptopodumwith different cultivation time and sucrose concentration

2.2 不同培養(yǎng)液濃度下野罌粟及禿瘡花花粉的萌發(fā)率

2.2.1 蔗糖濃度 由圖2可見，野罌粟蔗糖濃度為80g／L時花粉的萌發(fā)率最大，達26.3%，且80g／L處理與其他濃度差異顯著；禿瘡花的蔗糖濃度為70g／L時萌發(fā)率最大，達24.6%，且70g／L處理與80g／L處理無顯著差異，與其他處理差異均顯著。隨著蔗糖濃度的增大，萌發(fā)率逐漸降低，說明高濃度的蔗糖抑制花粉萌發(fā)。故離體萌發(fā)法測定野罌粟和禿瘡花花粉生活力的最適蔗糖濃度分別為80g／L和70g／L。

圖2 不同蔗糖濃度野罌粟與禿瘡花花粉的萌發(fā)率Fig.2 Pollen germination rate of P.nudicarule and D.leptopodumwith different sucrose concentration

2.2.2 硼酸濃度 由圖3可見，野罌粟在蔗糖濃度為80g／L時，不添加硼酸時的萌發(fā)率為26.3%，隨著硼酸濃度增大花粉萌發(fā)率也逐漸增大，當硼酸的濃度為40mg／L時，花粉的萌發(fā)率最大，達27.7%。硼酸濃度為50mg／L時，花粉萌發(fā)率降低，為24.3%，硼酸濃度為0時，與其他處理差異顯著。禿瘡花在蔗糖濃度為70g／L時，硼酸濃度為10mg／L時的萌發(fā)率為24.6%，硼酸濃度為30g／L時，與其他處理差異顯著。隨著硼酸濃度增大花粉萌發(fā)率也逐漸增大，當硼酸的濃度為30mg／L時，花粉的萌發(fā)率最大，達30.8%。硼酸的濃度為40mg／L和50mg／L時，花粉萌發(fā)率降低，分別為28.4%和24.3%。說明，硼酸作為微量元素對花粉萌發(fā)和花粉管伸長具有促進作用，但超出一定濃度會產(chǎn)生抑制作用。

圖3 不同硼酸濃度野罌粟和禿瘡花的花粉萌發(fā)率Fig.3 Pollen germination rate of P.nudicarule and D.leptopodum with different boric acid concentration

圖4 不同氯化鈣濃度野罌粟與禿瘡花花粉的萌發(fā)率Fig.4 Pollen germination rate of P.nudicarule and D.leptopodumwith different calcium chloride concentration

2.2.3 氯化鈣 由圖4可知，禿瘡花花粉在蔗糖濃度為70g／L，硼酸濃度為30mg／L，不添加氯化鈣時萌發(fā)率為30.8%。在此培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上加氯化鈣，且設置濃度梯度，當氯化鈣濃度為40mg／L時野罌粟花粉萌發(fā)率最大，為33.7%；當氯化鈣濃度為30mg／L時禿瘡花花粉的萌發(fā)率最大，為32.6%。不同濃度氯化鈣培養(yǎng)液培養(yǎng)的花粉萌發(fā)率差異顯著。說明，氯化鈣能促進野罌粟和禿瘡花花粉萌發(fā)，但當氯化鈣濃度再升高時萌發(fā)率下降，說明氯化鈣濃度過高反而抑制其花粉的萌發(fā)。

2.3 最適培養(yǎng)液下野罌粟和禿瘡花花粉的萌發(fā)率

由圖5可知，當野罌粟培養(yǎng)液硼酸和氯化鈣濃度分別為40mg／L和40mg／L時，隨著蔗糖濃度的變化，花粉的萌發(fā)率呈單峰變化趨勢，蔗糖濃度為80g／L時的萌發(fā)率最大。當硼酸、氯化鈣濃度一定時，野罌粟花粉在不同濃度蔗糖培養(yǎng)液下的萌發(fā)率的差異顯著。故離體萌發(fā)法測定野罌粟花粉生活力的最適培養(yǎng)液為蔗糖80g／L＋硼酸40mg／L＋氯化鈣40mg／L，其花粉萌發(fā)率為33.7%。禿瘡花培養(yǎng)液硼酸和氯化鈣濃度分別為30mg／L、30mg／L時，隨著蔗糖濃度的變化，花粉的萌發(fā)率呈單峰變化趨勢，蔗糖濃度為70g／L時的萌發(fā)率最大。當硼酸、氯化鈣濃度一定時，禿瘡花花粉在不同濃度蔗糖培養(yǎng)液下萌發(fā)率差異顯著。因此，離體萌發(fā)法測定禿瘡花花粉生活力的最適培養(yǎng)液為蔗糖70g／L＋硼酸30mg／L＋氯化鈣30mg／L，其花粉萌發(fā)率為33.1%。

圖5 最適培養(yǎng)液野罌粟與禿瘡花花粉的萌發(fā)率Fig.5 Pollen germination rate of P.nudicarule and D.leptopodumwith the optimum culture solution

3 結(jié)論與討論

本試驗研究證明，離體萌發(fā)法測定野罌粟花粉生活力的最佳觀測時間為5h，最佳培養(yǎng)液濃度為蔗糖80g／L＋硼酸40mg／L＋氯化鈣40mg／L，其花粉萌發(fā)率為33.7%。離體萌發(fā)法測定禿瘡花花粉生活力的最佳觀測時間為5h，最佳培養(yǎng)液濃度為蔗糖70g／L＋硼酸30mg／L＋氯化鈣30mg／L，其花粉萌發(fā)率為33.1%。

本試驗結(jié)果顯示，在不同培養(yǎng)條件下，野罌粟與禿瘡花花粉的萌發(fā)率差異顯著。關(guān)于花粉離體培養(yǎng)的最佳時間，不同植物品種的差異較大，有的培養(yǎng)24h即可觀察，有的則培養(yǎng)0.5h即可觀察統(tǒng)計［11］。本試驗結(jié)果表明，野罌粟和禿瘡花花粉在培養(yǎng)5h后，花粉管的長度一般為花粉粒直徑的4～7倍，此時比較容易統(tǒng)計數(shù)目。如果培養(yǎng)的時間過長，雖然花粉的萌發(fā)率仍呈上升趨勢，但此時花粉管太長，相互纏繞在一起，給統(tǒng)計數(shù)目帶來一定困難，并且易導致統(tǒng)計結(jié)果不準確。而且，在最初這5h中萌發(fā)的花粉證明生活力很強，極可能是雜交育種過程中真正起作用的花粉。因此，在進行花粉萌發(fā)率的觀察時，培養(yǎng)5h后進行鏡檢統(tǒng)計最合適。

蔗糖一方面為花粉萌發(fā)和花粉管的生長提供營養(yǎng)，另一方面起著維持花粉與培養(yǎng)液之間滲透平衡、避免花粉及花粉管的破裂作用。本試驗結(jié)果表明，不同濃度蔗糖對野罌粟和禿瘡花花粉萌發(fā)率的影響差異顯著。野罌粟花粉的萌發(fā)率隨蔗糖濃度增大而升高，當蔗糖濃度為80g／L時，花粉萌發(fā)率最高，蔗糖濃度＞80g／L時，萌發(fā)率隨著蔗糖的濃度增大而下降。供試禿瘡花花粉的萌發(fā)率隨蔗糖濃度增大而升高，當蔗糖濃度為70g／L時，花粉萌發(fā)率最高，蔗糖濃度＞70g／L時，萌發(fā)率隨著蔗糖的濃度增大而下降。這可能因蔗糖能維持花粉與培養(yǎng)液之間的滲透壓，蔗糖濃度太低，花粉的細胞壁會破裂；濃度過高，造成質(zhì)壁分離，抑制花粉的萌發(fā)生長［12］。

硼在植物體內(nèi)含量很低，并且分布不均勻，以花中含量最高，且又以柱頭和子房最多。硼酸在一定程度上能促進花粉的萌發(fā)和花粉管的伸長，在花粉培養(yǎng)過程中雖然需要量少，但卻是花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)液的主要成分，其對糖的吸收和代謝都有促進作用，與糖結(jié)合能顯著地提高花粉的萌發(fā)率，并且增加氧氣的含量和吸收，參與果膠物質(zhì)的合成［12］。本試驗結(jié)果表明，有硼酸比無硼酸的培養(yǎng)液培養(yǎng)的花粉萌發(fā)率高，在一定范圍內(nèi)，隨著硼酸濃度的增大，萌發(fā)率也隨著增大，但當硼酸濃度到一定數(shù)值后，花粉的萌發(fā)反而受到抑制。因此，最適合野罌粟花粉萌發(fā)的培養(yǎng)液中硼酸濃度為40mg／L，最適合禿瘡花花粉萌發(fā)的培養(yǎng)液中硼酸濃度為30mg／L。

鈣離子是影響花粉萌發(fā)的很重要的一個因子［13］。高濃度的鈣離子對花粉管內(nèi)細胞骨架的生理活動有很大影響，在花粉管頂端形成較厚的管壁，影響花粉管的生長。有研究表明，外源鈣離子可通過花粉管上的鈣離子通道調(diào)節(jié)花粉管內(nèi)的動態(tài)影響花粉管的生長［14］，尤其在花粉管的極性、頂端和定向生長過程中，當鈣離子過高時，由于牽拉型的鈣離子通道受到傷害，致使花粉管生長受到抑制［15］。在本研究中，也得到了相似的結(jié)論，適合野罌粟花粉萌發(fā)和花粉管生長的氯化鈣的最佳濃度為40mg／L，適合禿瘡花花粉萌發(fā)和花粉管生長的最佳濃度為30mg／L。

目前，對于野罌粟和禿瘡花花粉生活力的研究尚處于起步階段，本試驗有針對性的用離體萌發(fā)法測定2種花粉的生活力，對雜交育種來說，進行同種植物間的雜交或在野罌粟科植物中進行遠緣雜交還有待于進行深入研究。

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（責任編輯：劉忠麗）

Determination on Pollen Viability of Papaver nudicarule and Dicranostigma leptopodum

WANG Lin1，LIU Dongyun1，LI Jiaqi2
（1.College of Landscape and Tourism，Hebei Agricultural University，Baoding，Hebei 071000；2.Hebei Tourism Career Academy，Chengde，Hebei 067000，China）

By using the pollen from P.nudicaruleand D.leptopodumas material，the authors determined the pollen viability with the method of in vitro Kgermination，so as to provide references for studying on hybrid breeding of P.nudicarule and D.leptopodum.The authors made a study of the influence of different concentrations of sucrose，boric acid and calcium chloride on pollen germination.Results：The best observation time was 5hour and the optimum germination medium with the method of vitro germination of P.nudicarule pollen was a medium supplemented with sucrose 80g／L＋boric acid 40mg／L＋calcium chloride 40mg／L and the D.leptopodumpollen was a medium supplemented with sucrose 70g／L＋boric acid 30mg／L＋calcium chloride 30mg／L.The pollen germination of P.nudicarule in the optimum germination medium was 33.7%and that of D.leptopodumwas 33.1%.

Papaver nudicarule；Dicranostigma leptopodum；pollen；viability；in vitro germination method

S602.1

A

1001－3601（2016）07－0288－0018－04

2015－12－09；2016－06－30修回

河北省科技廳項目“京津冀地區(qū)節(jié)約型鄉(xiāng)土地被植物資源的搜集與利用”（15227534）

王 林（1979－），男，講師，從事植物應用研究。E－mail：linwang79525＠sina.com