高 駿，倪麗菊，孫鳳萍，肖君華，周宇荀，李 凱*

（1東華大學化學化工與生物工程學院，上海201620；2上海市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，上海201106；3上海實驗動物研究中心，上海201203）

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基于微衛(wèi)星位點的中國4個野生東方田鼠群體的遺傳多樣性分析

高 駿1，2，倪麗菊3，孫鳳萍2，肖君華1，周宇荀1，李 凱1*

（1東華大學化學化工與生物工程學院，上海201620；2上海市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，上海201106；3上海實驗動物研究中心，上海201203）

摘 要：利用20個微衛(wèi)星位點，采用熒光-多重PCR分型技術，對4個野生東方田鼠群體（福建、湖南、寧夏、廣西）進行遺傳結構和遺傳分化檢測。結果表明：19個微衛(wèi)星位點顯示出高度多態(tài)性（PIC=0.83＞0.5），平均等位基因數(shù)、位點雜合度均顯示4個地區(qū)野生東方田鼠的遺傳多樣性豐富。F統(tǒng)計量表明：4個野生東方田鼠群體的遺傳差異有13.5%來自于群體間，86.5%的遺傳差異主要來源于個體間。遺傳距離與UPGMA聚類分析均表明，寧夏群體與廣西群體間的遺傳分化程度最大，湖南群體與廣西群體間的遺傳分化程度最小，這在STRUCTURE聚類圖分析時（K =2）同樣得到提示。分析認為，廣西群體與湖南群體間的遺傳分化較小，存在一定基因交流的原因是這兩個群體間較近的地理距離。

關鍵詞：東方田鼠；微衛(wèi)星位點；遺傳多樣性

東方田鼠（Microtus fortis）是我國一種重要的野生實驗動物資源，主要分布在我國中東部低海拔地區(qū)，以及和我國接壤的俄羅斯、朝鮮、蒙古等地區(qū)。東方田鼠具有獨特的、天然的抗血吸蟲特性［1-2］，是一種抗血吸蟲病機理研究不可多得的動物材料。近年來的研究表明，東方田鼠還能作為糖尿病、卵巢癌、非酒精性脂肪肝等研究的模型動物［3-5］。20世紀90年代初期，國內(nèi)的一些實驗動物研究機構（中國科學院長沙農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化研究所、上海實驗動物研究中心等）已將該物種引入實驗室進行飼養(yǎng)、凈化、繁育［6-7］，目標是將其培育成具有中國特色的一種實驗動物資源。目前，東方田鼠的亞種分類比較確定的是分布于湖南洞庭湖區(qū)的長江亞種（M.f.calamorum）和分布于寧夏地區(qū)的指名亞種（M.f.fortis），其他亞種的分類及地理分布區(qū)域一直存在較大的爭議［8-12］。同時，對于中國東方田鼠各地理群體的分子生物學信息、遺傳結構和多樣性水平一直未見深入的研究報道。這些都阻礙了東方田鼠實驗動物化進程的發(fā)展和資源的保護。

微衛(wèi)星也稱短串聯(lián)重復（short tandem repeats，STR）或簡單重復序列（simple sequence repeats，SSR），普遍分布于真核生物基因組中，廣泛應用于物種群體遺傳結構、親緣關系分析及遺傳資源評價等研究中［13-14］。本試驗利用前期的研究方法［15-16］篩選了20個東方田鼠微衛(wèi)星（STR）分子標記，并結合熒光多重PCR和分型方法和對我國4個地區(qū)野生東方田鼠群體的遺傳多樣性進行檢測，旨在揭示該物種野生群體的遺傳多樣性現(xiàn)狀，希望能夠從分子地理學角度對該物種的亞種分類、系統(tǒng)進化研究提供研究基礎，并為該物種的實驗動物資源開發(fā)和保護提供幫助。

1　材料與方法

1.1樣品采集

63個野生東方田鼠樣本（4個地理種群）分別采自寧夏（NX）、湖南（HN）、廣西（GX）、福建（FJ）（表1）。樣本通過形態(tài)學和部分基因序列測序鑒定。

表1　東方田鼠樣本采集信息Table 1 Sample collection information of M.fortis in China

1.2基因組總DNA的提取

取0.5—1 cm鼠尾，利用SDS/蛋白酶K裂解，酚氯仿提取總DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA質(zhì)量。利用NanoDrop ND-1000濃度儀測定濃度，稀釋至100 pmol/uL保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3東方田鼠微衛(wèi)星標記及其引物

本試驗選擇前期利用磁珠富集法［15］獲得的東方田鼠多態(tài)性良好的20個位點進行條件摸索和優(yōu)化。引物5’端標記有HEX或FAM熒光（表2），引物均由上海生工生物有限公司合成。

1.4多重PCR擴增及產(chǎn)物檢測

將20個STR基因座引物根據(jù)目的片段長度以及不同的熒光標記分成7組（Panel 1—7，表2）。通過多重PCR擴增試劑盒（TIANGEN BIOTECH，型號KT109）進行多重PCR擴增。PCR擴增總體積為12.5 μL：10×Multi HotStart Buffer 1.25 μL，Super Pure dNTPs（2.5 mmol/L）1 μL，Primer Mix 1 μL（各引物的終物質(zhì)的量濃度為1 pmol/μL），DNA Template 2 μL（10 ng/μL），Multi HotStart DNA Polymerase 0.25 μL（5 U/μL），ddH2O 7 μL，另加10 μL石蠟油防止揮發(fā)。多重PCR擴增在Mastercycler gradient梯度PCR儀上（Eppendorf公司）完成，95℃預變性15 min；94℃變性30 s，54—59℃退火90 s，72℃延伸60 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。反應結束后，將擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳抽檢后，在ABI3730自動測序儀上電泳分型，并利用GeneMapper v3.0軟件對分型后的數(shù)據(jù)進行采集處理。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

將分型后獲得的片段長度數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成個體的基因型數(shù)據(jù)，并利用CERVUS 3.0［17］和POPGENE v1.32軟件［18］統(tǒng)計各位點的等位基因數(shù)、期望雜合度（He）、觀測雜合度（Ho）、多態(tài)信息含量（PIC）、群體內(nèi)和群體間的遺傳分化系數(shù)、各位點的哈迪-溫伯格平衡情況、Nei氏遺傳距離以及基因流等。利用STRUCTURE v2.3.4［19］進行遺傳結構的分析，在混合模型下，K值取2—5，并利用Distruct 1.1程序［20］構建遺傳結構圖。

表2　微衛(wèi)星標記及其引物序列Table 2 Microsatellite markers and primers information

2　結果與分析

2.1群體遺傳學參數(shù)檢測

20個STR位點在4個東方田鼠野生群體63個樣本中的平均等位基因數(shù)為8.523個，其中MFBAC52-29和MFB41位點的有效等位基因數(shù)（Ne）最少，分別為1.772和2.729個；而MFBAC52-05、MFBAC67-34、MFA56、MFA178、MFA257、MFA184這6個位點的有效等位基因數(shù)（Ne）均大于10，且PIC值相對最高（0.903—0.922），表明在20個STR位點中，該6個位點的遺傳多樣性最高。在20個位點中，只有MFBAC52-29位點的PIC值為0.370，處于0.25—0.5，屬于中等多態(tài)性位點，其他19個位點的PIC值均大于0.5，表現(xiàn)為高度多態(tài)性位點（表3）。

表3　20個微衛(wèi)星（STR）座位的遺傳多樣性參數(shù)Table 3 Genetic diversity parameters of 20 microsatellite loci（STR）

2.2遺傳分化與基因流

通過POPGENE v1.32檢測東方田鼠各位點間的遺傳分化系數(shù)［21］與基因流（表4），種群內(nèi)的近交系數(shù)（Fis）值在-0.041—0.957，平均值為0.153。種群間的近交系數(shù)（Fit）值在0.023—0.964，平均值為0.267。其中MFBAC52-29位點的Fis和Fit值在所有20個位點中最高。種群間的遺傳分化系數(shù)（Fst）值在0.042—0.366，平均值為0.135。各位點的基因流（Nm）的平均值為1.604，20個位點中僅MFA300、MFA313、MFBAC57-07這3個位點的基因流數(shù)值低于1；17個位點的Nm＞1，表明各群體間還是保持了一定的基因流水平，較高的基因流水平能夠抑制種群的遺傳分化。

表4　東方田鼠各位點分化系數(shù)與基因流檢測Table 4 Differentiation coefficient and gene flow detection of 20 Loci of M.fortis

2.3哈迪-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium）檢測

對4個群體20個位點進行哈迪-溫伯格平衡檢測（表5），發(fā)現(xiàn)有8個位點（MFBAC52-05、MFBAC67-34、MFA8、MFB41、MFBAC107-05、MFBAC114-22、MFA56、MFA300）在4個群體中均處于平衡狀態(tài)（P＞0.05），有2個位點（MFA178、MFBAC52-29）在4個群體中處于不平衡的狀態(tài)（P＜0.05）。從4個群體的總體看，有32.5%位點處于非平衡狀態(tài)。

表5　20個位點的哈迪-溫伯格平衡檢測（P值）Table 5 P value of Hardy-Weinberg equilibrium test of 20 loci

2.4遺傳距離與聚類分析

通過POPGENE v1.32統(tǒng)計4個群體東方田鼠的Nei氏遺傳距離［22］與遺傳一致性系數(shù)（表5）顯示，寧夏群體（NX）與福建（FJ）、廣西（GX）群體之間的遺傳距離較遠，分別達到了0.983和1.044；而湖南（HN）與廣西（GX）、福建（FJ）群體之間的Nei氏遺傳距離較近，分別為0.643和0.690（表6）。根據(jù)Nei氏無偏差遺傳距離，構建了UPGMA聚類樹（圖1）。STRUCTURE程序推斷的群體間的系統(tǒng)發(fā)生關系（圖2）顯示：K =2時，東方田鼠63個樣本被分為2個類群，一類是包括寧夏（NX）群體的所有樣本，另一類是包含福建（FJ）、湖南（HN）、廣西（GX）群體的我國南方群體樣本；當K =3時，F(xiàn)J群體作為獨立的群，被從南方群體中細分出來；當K =4時，廣西與湖南群體被進一步得到細分；當K =5時，廣西群體顯示出復雜的基因組成，難以被清晰的劃分。

圖1　根據(jù)Nei氏遺傳距離構建的東方田鼠4個群體的UPGMA聚類樹Fig.1 UPGMA cluster tree of 4 populations of M.fortis based on Nei’s genetic distances

表6　東方田鼠Nei氏遺傳距離（下三角）與遺傳一致性系數(shù)（上三角）Table 6 Nei’s genetic distance（below diagonal）and genetic consistency coefficient（above diagonal）of M.fortis

圖2　STRUCTURE程序推斷的東方田鼠4個群體（K =2—5）的群體遺傳結構圖Fig.2 The population genetic structure of 4 population of M.fortis inferred by STRUCTURE program（K from 2 to 5）

3　討論

微衛(wèi)星序列的分類包括：完美型、非完美型和復合型序列［23］。所謂完美型是指由單一的重復單元所組成的序列，如（AC）n；而非完美型是指重復序列中有其他核苷酸夾雜其中，復合型是由2個或多個重復單元組成的序列。此次選擇的20個STR位點中，16個屬于完美型，其余的為復合型。本研究選用的20 個STR位點在4個東方田鼠群體樣本中表現(xiàn)出較高的遺傳多態(tài)性，其中19個位點屬于高度多態(tài)位點，平均多態(tài)信息量PIC =0.83＞0.5，這些STR位點能夠充分反映東方田鼠野生群體的遺傳多樣性信息。

F統(tǒng)計量的分析表明，從整體而言，4個野生東方田鼠群體存在明顯的群體遺傳分化，群體間的遺傳分化系數(shù)為Fst=0.135，表明群體間的遺傳差異有13.5%，而另外86.5%的遺傳差異主要來源于個體間的差異。群體內(nèi)的近交系數(shù)較高（Fit=0.153），可能是由于4個東方田鼠群體之間由于地理分布的局限性，導致群體間的基因交流受到一定程度的限制。哈迪-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium）檢測發(fā)現(xiàn)：在4個群體20個位點中，有32.5%的位點處于非平衡狀態(tài)，表明東方田鼠野生群體其遺傳結構并不穩(wěn)定，可能受到選擇、近交、群體規(guī)模偏小等因素的影響。其中有8個位點（MFBAC52-05、MFBAC67-34、MFA8、MFB41、MFBAC107-05、MFBAC114-22、MFA56、MFA300）在4個野生自然群體中均處于平衡狀態(tài)，表明這8個位點可能更適合應用于東方田鼠種群資源的遺傳檢測。

分析4個東方田鼠野生群體的Nei氏遺傳距離和基因流發(fā)現(xiàn)，寧夏群體（NX）與廣西群體（GX）之間的遺傳距離最遠（1.044），而廣西群體（GX）與湖南群體（HN）之間的遺傳距離最近（0.643）。在4個東方田鼠野生群體中，寧夏群體（NX）在地理位置上屬于我國北方的群體，而湖南、福建、廣西屬于我國南部地區(qū)的群體，從遺傳距離和聚類分析都表明，寧夏群體（NX）與3個南方群體間的遺傳分化程度較大。研究認為，湖南與廣西在地理距離上比較接近，有助于這兩個群體間的基因交流和個體的擴散。而寧夏屬于中國北方地區(qū)，中國存在較多東西走向的山脈和河流，形成了天然的地理屏障（如秦嶺-淮河地理分界線等），使得南北地區(qū)的物種種群產(chǎn)生明顯的遺傳分化。在STRUCTURE程序分析結果中也同樣提示（K=2），該4個群體被分為兩類，一類是以寧夏（NX）為代表的北方群體，而另3個群體（FJ、HN、GX）可以被劃分成南方群體。雖然4個東方田鼠野生群體間的分化程度均較高，但STRUCTURE分析（K =4、5）也表明在廣西群體與湖南群體之間存在一定的基因交流，分析認為這可能是因為兩個群體間相對較近的地理距離，使得這兩個種群在長期的進化過程中存在一定的擴散雜交。

我國是一個物種資源豐富的國家，許多獨特的物種蘊含著重要的生物學特性。東方田鼠擁有天然的抗血吸蟲感染的能力，使其醫(yī)學研究價值被得到重視。但是對于在自然環(huán)境下的野生東方田鼠群體的分子遺傳學研究較少，該物種的亞種分類一直存在較大爭議、系統(tǒng)地理學研究也處于起步階段。本研究所采用的20個STR位點在野生群體中表現(xiàn)出高度的遺傳多態(tài)性，可以作為今后東方田鼠遺傳檢測、分子育種有效的遺傳分子標記。本研究從基因組分子角度為今后中國東方田鼠亞種分類提供了一定的基因數(shù)據(jù)參考，為促進東方田鼠的實驗動物資源化提供了重要的基礎。

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（責任編輯：閆其濤）

Genetic diversity analysis of 4 wild Microtus fortis populations based on microsatellite loci

GAO Jun1，2，NI Li-ju3，SUN Feng-ping2，XIAO Jun-hua1，ZHOU Yu-xun1，LI Kai1*
（1Institute of Biological Sciences and Technology，Donghua University，Shanghai 201620，China；2Institute of Animal Husbandry and Veterinary Sciences，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201106，China；3Shanghai Laboratory Animals Research Center，Shanghai，201203 China）

Abstract：Based on 20 microsatellite loci，the genetic structure and genetic differentiation of 4 wild Microtus fortis populations（Fujian，Hunan，Guangxi and Ningxia）were detected by multiplex fluorescence PCR technique.The results indicated that 19 microsatellite loci showed high polymorphism（PIC =0.83＞0.5），and the average number of alleles and loci heterozygosity showed that the genetic diversity was abundant in 4 regions of M.fortis.F-statistic showed that the genetic difference among the populations was 13.5%，and 86.5%of genetic difference was mainly from individuals.Genetic distances and UPGMA cluster analysis showed that the degree of genetic differentiation between Ningxia population and Guangxi population was the largest，the degree of genetic differentiation between Hunan population and Guangxi population was the least，which was also prompted in STRUCTURE clustering graph analysis（K =2）.The genetic differentiation between Guangxi population and Hunan population was small，the reason for the existence of a certain gene exchange is the closer geographical distance between the two populations.

Key words：Microtus fortis；Microsatellite loci；Genetic diversity

中圖分類號：S865

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3924（2016）03-072-06

DOI：10.15955/j.issn1000-3924.2016.03.15

收稿日期：2015-04-15

基金項目：上海市科委項目（09140900101、09140900102）

作者簡介：高駿（1979—），男，博士，助理研究員，研究方向：動物分子遺傳

*通信作者，E-mail：likai@dhu.edu.cn