李 紅，劉成倩，易建中

（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海201106）

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人類多效生長因子Pleiotrophin的原核表達

李 紅，劉成倩，易建中*

（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海201106）

摘 要：根據(jù)GenBank上公布的Ptn核苷酸序列設(shè)計1對引物，利用RT-PCR的方法擴增出人類Ptn基因，將其克隆到原核表達載體pET-30a上，得到重組質(zhì)粒pET-30a-Ptn。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞并進行表達條件優(yōu)化，經(jīng)SDS-PAGE電泳及Western Blotting分析表明，融合蛋白在0.5 mmol/L IPTG、37℃條件下誘導(dǎo)3 h表達量最高，其分子質(zhì)量約24.9 kD，表達產(chǎn)物主要以包涵體形式存在，且表達的融合蛋白能與His標(biāo)簽單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：Pleiotrophin；原核表達；條件優(yōu)化

Pleiotrophin（PTN）最早是1989年Bohlen等［1］從成體牛腦中分離純化出的一種可與肝素結(jié)合的蛋白質(zhì)，稱為多效生長因子。Ptn基因在牛、鼠、人和雞之間高度保守［2］，是目前已知的所有生長因子中最保守的一種基因。Ptn基因的表達產(chǎn)物是一種具有分泌性和多效生長因子作用的蛋白，在細(xì)胞的生長、分化及發(fā)育過程中均起重要作用［3］。研究表明，PTN具有刺激細(xì)胞增殖及遷移、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、促進血管生成、促進神經(jīng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化/軸突生長、腫瘤的生長、炎癥反應(yīng)、創(chuàng)傷修復(fù)、胚胎發(fā)育和參與骨發(fā)育等功能［4-9］。多種因子或化學(xué)物質(zhì)如：成纖維生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、血小板源生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）、激素、一氧化氮（NO）都可以調(diào)節(jié)PTN的表達。PTN表達也可被炎癥中的巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及缺血損傷部位的其他細(xì)胞上調(diào)［5］。外源Ptn基因?qū)肟墒筃IH3T3細(xì)胞、SW13細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。因此，PTN作為腫瘤治療的潛在分子靶點日益受到關(guān)注［10-11］。

甲型H1N1流感在全球肆虐至今，人獸共患傳染病的抗擊和防治再次成為公眾關(guān)注焦點。最早發(fā)現(xiàn)于牛腦的多效生長因子PTN雖然在動物中研究不多，但其基因的高度保守以及多功能性，啟發(fā)畜牧業(yè)科研人員對其功能進行探討。PTN在健康組織中很少表達，但在多種腫瘤組織及血清中表達量明顯增高。本試驗借助一個難得的實驗?zāi)Ｐ腿烁闻呒?xì)胞瘤細(xì)胞系HePG2，利用RT-PCR技術(shù)，構(gòu)建了表達人類PTN的原核載體，并對PTN重組蛋白的表達條件進行優(yōu)化，以期為深入研究PTN蛋白的結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1菌種、載體及主要試劑

人肝腫瘤細(xì)胞系HepG2、E.coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞及表達菌株E.coli（BL21）均由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所禽病研究室保存；質(zhì)粒小量提取試劑盒和膠回收試劑盒購自AXYGEN公司；T4連接酶、rTaq DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、KOD酶、DNA Marker、pMD18-T載體均由大連寶生物工程有限公司提供；限制性內(nèi)切酶BamHI、HindIII購自NEB公司；蛋白質(zhì)Marker和TRN-zol-A+總RNA提取試劑購自天根生化科技（北京）有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2引物設(shè)計

根據(jù)GenBank上公布的Pleiotrophin基因的全長序列，由Primer 5.0軟件設(shè)計出1對特異性引物，上游引物Pleiotrophin-F：5’-ATACGGGATCCATGCAGGCTCAACAGTACCA-3’（下劃線處為BamHI酶切位點），下游引物Pleiotrophin-R：5’-AGTGCAAGCTTTTAATCCAGCATCTTCTCCTGT-3’（下劃線處為HindIII酶切位點），由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.3RT-PCR擴增

提取HePG2細(xì)胞系的總RNA。cDNA合成反應(yīng)條件（10 μL）為：總RNA 4 μL，Pleiotrophin-R引物1 μL，dNTP 1 μL于PCR管中65℃5 min，冰上迅速冷卻2 min，離心。5×Prime Script Buffer 2 μL，Prime script RTase 0.5 μL，RNase Inhibitor 0.5 μL，H2O 1 μL，42℃水浴1 h，立即放到冰上冷卻。RT-PCR反應(yīng)條件（50 μL）為94℃5 min；94℃30 s，53℃30 s，72℃1 min，35個循環(huán)；72℃10 min。反應(yīng)結(jié)束后，使用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果?；厥誔CR產(chǎn)物，根據(jù)pMD18-T載體說明書連接獲得重組質(zhì)粒pMD18-T-Ptn。

1.4Ptn基因原核表達載體的構(gòu)建和鑒定

利用限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII分別對Ptn基因PCR產(chǎn)物和表達載體pET-30a進行雙酶切，將純化回收后的PCR產(chǎn)物與表達載體pET-30a連接，連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞。通過菌落PCR篩選出含有目的基因的重組菌落，將其命名為pET-30a-Ptn，此菌經(jīng)LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后送上海華大基因科技股份有限公司測序。

1.5PTN蛋白誘導(dǎo)表達

將測序正確的菌落pET-30a-Ptn抽提質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化Transetta（BL21）感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)過夜，挑取單菌落，接種于3 mL含Kam的LB液體培養(yǎng)基中，37℃活化過夜后，1∶100稀釋到含Kam的LB液體培養(yǎng)基中，37℃200 r/min振搖培養(yǎng)至對數(shù)生長期OD600為0.5—0.8，加入終物質(zhì)的量濃度為0.5—1.0 mmol/L的IPTG，37℃200 r/min振搖誘導(dǎo)培養(yǎng)3—7 h后收集菌體，用10%聚丙烯酰胺凝膠進行SDS-PAGE檢測。

1.6稀有密碼子及密碼子適應(yīng)指數(shù)CAI值分析

利用在線分析網(wǎng)站http://people.mbi.ucla.edu/sumchan/caltor.html及在線分析CAI值網(wǎng)站http://www.genscript.com/cgi-bin/tools/rare_codon_analysis分別對擴增的Ptn基因稀有密碼的個數(shù)及CAI值進行分析。

1.7重組蛋白可溶性分析

挑取陽性重組菌的單菌落，接種于3 mL含Kam的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，然后1∶100稀釋接種到100 mL含Kam的LB液體培養(yǎng)基中；37℃200 r/min振搖培養(yǎng)至對數(shù)生長期OD600為0.5—0.8，加入終物質(zhì)的量濃度為0.5 mmol/L的IPTG，37℃200 r/min振搖誘導(dǎo)培養(yǎng)3 h后收集菌體，將菌體用15 mL PBS洗2次，然后用PBS懸浮細(xì)菌，經(jīng)超聲波裂解，12 000 r/min離心15 min，沉淀也用15 mL PBS溶解，分別取適量超聲后上清和沉淀加5倍上樣緩沖液，煮沸裂解5 min，用10%聚丙烯酰胺凝膠進行SDS-PAGE檢測。

2　結(jié)果與分析

2.1HepG2細(xì)胞Ptn基因PCR擴增

以提取的總RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄，以Pleiotrophin-F/Pleiotrophin-R為引物進行PCR擴增，得到大小為529 bp的片段（圖1），與預(yù)期結(jié)果一致。

2.2重組原核表達載體的篩選與鑒定

pMD18-T-Ptn與原核表達載體pET-30a酶切連接后，挑取10個單菌落進行菌落PCR篩選。由圖2可知，挑取的10個菌落有7個是陽性，3個是陰性。取陽性菌落進行測序，序列沒有發(fā)生突變和移碼。

圖1　HepG2細(xì)胞Ptn基因擴增結(jié)果Fig.1 Amplification results of Ptn gene from HepG2 cells

圖2　pET-30a-Ptn菌落PCR篩選結(jié)果Fig.2 PCR results of pET-30a-Ptn

2.3Ptn基因稀有密碼子分析及CAI值分析

利用稀有密碼子在線分析網(wǎng)站http://people.mbi.ucla.edu/sumchan/caltor.html對Ptn基因進行分析，結(jié)果顯示：序列內(nèi)含有18個稀有密碼子，18個稀有密碼子于序列中分布比較均勻。通過在線分析軟件（http://www.genscript.com/cgi-bin/tools/rare_codon_analysis）進一步對Ptn基因序列進行分析，密碼子適應(yīng)指數(shù)CAI（codon adaptation index）值為0.65，CG含量為51.83%（圖3）。軟件提示CAI值大于1.0或CG含量30%—70%則利于基因的高效表達，Ptn基因雖然CAI值小于1.0，但CG含量為51.83%且稀有密碼子分布均勻，利于其蛋白的表達。

圖3　Ptn基因CAI和GC含量分析Fig.3 Analysis of codon adaptation index（CAI）and GC content of Ptn gene

2.4重組菌誘導(dǎo)表達及重組蛋白可溶性分析

重組菌pET-30a-Ptn誘導(dǎo)后，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，所得重組蛋白的分子質(zhì)量約為24.9 kD（圖4），與預(yù)期結(jié)果相同。IPTG為0.5 mmol/L和1.0 mmol/L對PTN蛋白質(zhì)誘導(dǎo)沒有太大差異。3 h、5 h和7 h分別誘導(dǎo)出目的蛋白，發(fā)現(xiàn)3 h表達量高一些。重組菌體pET-30a-Ptn超聲裂解后，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，目的蛋白主要在超聲后的沉淀中，表明此蛋白主要以包涵體形式存在。

2.5重組蛋白的Western Blotting分析

超聲后的菌體沉淀經(jīng)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜后，在24.9 kD處出現(xiàn)目的條帶（圖5），結(jié)果表明重組蛋白能與His標(biāo)簽單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。

圖4　PTN重組蛋白表達的SDS-PAGE檢測結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE results of PTN recombination protein

圖5　PTN重組蛋白Western Blotting分析結(jié)果Fig.5 Western Blotting results of PTN recombination protein

3　結(jié)論與討論

大腸桿菌原核表達系統(tǒng)適合多種原核基因以及一些真核基因的表達。然而，外源蛋白的表達水平與多種因素有關(guān)。其中，密碼子的使用頻率差異是影響外源蛋白表達效率的因素之一。Ptn基因雖然含有18個稀有密碼子，但由于稀有密碼子分布比較均勻，沒有連續(xù)出現(xiàn)，而對其表達影響不大。CAI值小于1.0時，不利于目的蛋白表達，但是目的基因GC含量在50%左右，則利于蛋白的表達。因此，目的蛋白要想成功表達，需考慮多個因素，可以借助生物信息學(xué)，通過實驗驗證，確立最佳表達條件。

本研究通過構(gòu)建Ptn基因的原核表達載體pET-30a-Ptn，實現(xiàn)其在E.coli（BL21）中的高效表達，并對融合蛋白重組表達的主要因素進行了優(yōu)化，確定了誘導(dǎo)表達的條件。誘導(dǎo)劑IPTG的用量、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時間等對PTN的表達量都有一定影響，融合蛋白在0.5 mmol/L IPTG、37℃條件下誘導(dǎo)3 h表達量最高。由于重組蛋白含有多聚組氨酸，可以與Ni-NTA瓊脂糖顆粒結(jié)合，因此可以利用Ni-NTA進行蛋白的親和純化。

PTN在胎兒分娩時表達達到高峰，之后，隨著組織器官發(fā)育成熟而逐漸降低［4］。成人僅在腦、舌及子宮中可檢測到［12］。但值得重視的是，PTN蛋白存在于多種腫瘤組織及血清中［13-14］。HepG2是一種分化好的人肝胚細(xì)胞瘤細(xì)胞系，保留了較完整的代謝酶及其活性［15］，為順利克隆Ptn基因提供了素材。Ptn基因作為一個原癌基因，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系緊密，其表達水平可以作為腫瘤診斷、治療、預(yù)防評價的指標(biāo)。Pleiotrophin基因在人、牛、雞和鼠之間高度保守，是目前細(xì)胞因子中氨基酸序列保守程度最高的蛋白，為此從HepG2細(xì)胞系中克隆此細(xì)胞因子對研究家禽畜牧業(yè)中雞腫瘤疾病有一定的啟發(fā)和促進作用。

本研究根據(jù)Ptn的基因序列，通過RT-PCR技術(shù)，獲得了HepG2細(xì)胞Ptn基因，并構(gòu)建了Ptn基因的原核表達載體pET30a-his-Ptn，優(yōu)化了其誘導(dǎo)條件，在大腸桿菌在實現(xiàn)了高效表達，成功純化了重組PTN蛋白。

參 考 文 獻

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（責(zé)任編輯：閆其濤）

Prokaryotic expression of human multieffect growth factor Pleiotrophin

LI Hong，LIU Cheng-qian，YI Jian-zhong*
（Institute of Animal Husbandry & Veterinary Science，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201106，China）

Abstract：According to the relevant sequence from GenBank，the specific primers were designed for amplifying Ptn gene by RT-PCR method.The Ptn gene was cloned into prokaryotic expression vector to construct the recombinant expression plasmid pET-30a-Ptn.The fusion protein was expressed in E.coli（BL21）and the induction conditions for expression were optimized.The high yield of fusion protein was achieved with 0.5 mmol/L IPTG，37℃for 3 hours.The 24.9 kD expressed protein of PTN was identified by SDS-PAGE and Western Blotting.The protein existed mainly in the form of inclusion body and could react specificly with His-tag monoclonal antibody.

Key words：Pleiotrophin；Prokaryotic expression；Optimization

中圖分類號：S85

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3924（2016）03-067-05

DOI：10.15955/j.issn1000-3924.2016.03.14

收稿日期：2015-09-14

基金項目：上海市科技人才計劃（14YF1414600）

作者簡介：李紅（1983—），女，博士，助理研究員，主要從事動物分子生物學(xué)和免疫學(xué)的研究。Tel：021-62204612，E-mail：lihong20061029 @163.com

*通信作者，Tel：021-62204612，E-mail：yijianzhong@yahoo.com