羅潤(rùn)波，王　剛，云旦平措，益西旺扎，貢　嘎，索朗斯珠（西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，西藏林芝860000）

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西藏林芝地區(qū)藏豬源大腸桿菌耐藥表型及耐藥基因檢測(cè)

羅潤(rùn)波，王剛，云旦平措，益西旺扎，貢嘎，索朗斯珠*
（西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，西藏林芝860000）

摘要：本文采集西藏林芝地區(qū)藏豬養(yǎng)殖場(chǎng)和散養(yǎng)藏豬腹瀉物，采用細(xì)菌學(xué)方法分離鑒定藏豬源大腸桿菌后，檢測(cè)抗菌藥物的敏感性及耐藥基因。結(jié)果顯示：林芝地區(qū)藏豬源大腸桿菌分離菌株對(duì)各種抗生素存在不同程度的耐藥性，其中對(duì)諾氟沙星、阿奇霉素、復(fù)方新諾明極敏感；對(duì)氯霉素、頭孢唑林、鏈霉素、丁胺卡那霉素、四環(huán)素、慶大霉素、頭孢西丁高度敏感；呋喃妥因中度敏感；而對(duì)萬古霉素、青霉素、紅霉素耐藥。并檢測(cè)出P基因，其檢出率為100%。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提出了科學(xué)用藥措施，為西藏林芝地區(qū)藏豬養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：大腸桿菌；藏豬；耐藥性基因

1　材料與方法

1.1材料

本項(xiàng)目于2013年1月～2013年12月期間，以滅菌棉簽蘸取采集西藏林芝地區(qū)不同藏豬養(yǎng)殖場(chǎng)及散養(yǎng)藏豬腹瀉物，作為細(xì)菌分離病料。

1.2藥品試劑

表1　大腸桿菌藥敏表型及耐藥基因檢測(cè)藥品

1.3儀器設(shè)備

表2　大腸桿菌藥敏表型及耐藥基因檢測(cè)儀器設(shè)備

2　方法

2.1細(xì)菌分離培養(yǎng)

將采集的腹瀉物樣品無菌接種于普通瓊脂培養(yǎng)基，而后挑去單菌落依次接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h，觀察結(jié)果。

2.2藥敏試驗(yàn)

吸取分離后細(xì)菌普通肉湯培養(yǎng)基100 μl涂布于普通瓊脂平板上，將獸醫(yī)臨床常用的14種敏紙片，每3個(gè)藥敏紙片等距離貼于一個(gè)瓊脂平板表面，倒置平皿37℃培養(yǎng)20 h觀察、記錄結(jié)果。

2.3抑菌結(jié)果的判定

抑菌結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)見表3。

表3　藥物敏感實(shí)驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)

2.416SrRNA甲基化酶的基因檢測(cè)

2.4.1模板DNA的提取用質(zhì)粒提取試劑盒提取純培養(yǎng)物DNA，水煮作為模板待用。采用Primer 5設(shè)計(jì)16S rRNA甲基化酶基因1對(duì)特異性引物：rmtA。

2.4.216S rRNA甲基化酶［1］基因PCR檢測(cè)方法PCR反應(yīng)總體系為50 μl，其中包括ddH2O 36.5 μl、10× Buffer 5 μl、dNTP 4 μl、Easy Taq酶0.5 μl、上下游引物各1 μl、模板2 μl。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸45 s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后，取6 μl PCR產(chǎn)物，用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

3　結(jié)果

3.1分離培養(yǎng)與鑒定

在普通瓊脂平板上經(jīng)過37℃培養(yǎng)20 h，生長(zhǎng)良好，圓形突起、光滑、濕潤(rùn)、半透明灰白色單個(gè)菌落明顯［2］。見圖1。

圖1　腹瀉物接種于普通瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落

挑取普通瓊脂平板上典型的單個(gè)菌落分別接種到麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)20 h，在麥康凱瓊脂平板及伊紅美藍(lán)瓊脂平板上分別形成紅色菌落和帶金屬閃光的菌落［2］?？膳卸榇竽c桿菌。見圖2、圖3。

圖2　麥康凱培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落

圖3　伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落

挑取麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的單個(gè)、紅色菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中進(jìn)行純培養(yǎng)，置于空氣浴震蕩培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)20 h。見圖4。

圖4　肉湯培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)結(jié)果

3.2藥敏試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)過藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，本次分離的大腸桿菌對(duì)諾氟沙星、阿奇霉素、復(fù)方新諾明極敏感；對(duì)氯霉素、頭孢唑林、鏈霉素、丁胺卡那霉素、四環(huán)素、慶大霉素、頭孢西丁高度敏感；呋喃妥因中度敏感；而對(duì)萬古霉素、青霉素、紅霉素耐藥。見圖5、圖6。

圖5　藏豬源大腸桿菌對(duì)常用藥物耐藥表型結(jié)果

圖6　藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3.3生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)藏豬源細(xì)菌經(jīng)生化試驗(yàn)鑒定，參考5種埃希菌的生化反應(yīng)［3］，可確定兩株藏豬源細(xì)菌是埃希氏菌屬大腸桿菌。見表4。

表4　藏豬源分離細(xì)菌生化試驗(yàn)結(jié)果

3.4基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

檢測(cè)所用的引物中，全部檢測(cè)出P基因，檢出率100%。豬源大腸桿菌對(duì)氨基糖苷類藥物不敏感，存在耐藥基因。見圖7。

圖7　藏豬源大腸桿菌P基因電泳圖

4　討論

4.1藏豬源大腸桿菌的耐藥性

目前，濫用抗生素問題在人類使用上得到了一定的控制，但是在動(dòng)物身上大量使用抗生素的情況依然非常嚴(yán)重，特別是大動(dòng)物、家畜，對(duì)人類健康的威脅不容小視［4］。共生菌株耐藥性逐漸引起公眾的關(guān)注，因?yàn)檫@類耐藥菌株能夠不斷擴(kuò)散，將耐藥基因從動(dòng)物傳播給人［5，6］，關(guān)于大腸桿菌對(duì)抗生素的耐藥性問題，早已在世界范圍內(nèi)引起了重視［7，8］。

所分離得到的菌株均表現(xiàn)出了耐藥，這說明在藏區(qū)藏豬臨床上也存在大量使用抗生素、或不規(guī)范使用抗生素的現(xiàn)象。并在基因檢測(cè)中全部檢驗(yàn)出P基因，所以確定其存在耐藥基因。在臨床上應(yīng)分離病原并開展藥敏試驗(yàn)，以針對(duì)性地選擇藥物，從而減少或延緩細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。

4.2避免耐藥性的產(chǎn)生建議

4.2.1改善飼養(yǎng)管理、優(yōu)化環(huán)境衛(wèi)生腸道中的大腸桿菌大多為正常菌群，屬于條件致病菌。所以必須加強(qiáng)藏豬的飼養(yǎng)管理。比如，加強(qiáng)通風(fēng)換氣，減少藏豬圈舍內(nèi)的有害氣體等。

空氣、飲水、飼料均是大腸桿菌的主要傳播媒介，應(yīng)優(yōu)化環(huán)境衛(wèi)生，比如對(duì)糞便的及時(shí)定期消毒等。特別是豬大腸桿菌病引起的仔豬黃痢、仔豬白痢和豬水腫?。?］等的糞便及圈舍的處理。處理方法有很多種，如：生物熱消毒或使用新潔爾滅、百毒殺等。同時(shí)，加強(qiáng)對(duì)藏豬圈舍外環(huán)境的消毒，比如，對(duì)進(jìn)出養(yǎng)殖場(chǎng)的設(shè)備、車輛、人員的控制、消毒，以及定期滅鼠、滅蠅、滅蚊。對(duì)于散養(yǎng)藏豬還可以采取一定的隔離措施，比如，建立柵欄。

4.2.2減少用藥導(dǎo)致的耐藥性產(chǎn)生若藏豬已經(jīng)發(fā)生大腸桿菌病，應(yīng)該采用多種抗生素交叉、聯(lián)合使用，按照相關(guān)規(guī)定合理使用抗生素，以達(dá)到提高療效降低毒性、延緩和避免抗藥性產(chǎn)生的目的［10］。

4.2.3加強(qiáng)鄉(xiāng)鎮(zhèn)一級(jí)基層獸醫(yī)工作人員的培訓(xùn)基層獸醫(yī)工作人員是牲畜疾病預(yù)防及生病牲畜的直接用藥指導(dǎo)。因此加強(qiáng)基層獸醫(yī)工作人員對(duì)相關(guān)知識(shí)的學(xué)習(xí)，普及相關(guān)醫(yī)療知識(shí)，合理使用抗菌藥。以及用藥時(shí)嚴(yán)格掌握適應(yīng)癥、適當(dāng)?shù)膭┝亢童煶?，?yán)格按照相關(guān)藥品使用說明書使用藥物，是減少大腸桿菌耐藥性產(chǎn)生的一個(gè)重要途徑。

4.2.4加強(qiáng)藥政管理相關(guān)行政管理部門必須根據(jù)相應(yīng)法律法規(guī)加強(qiáng)抗生素生產(chǎn)、銷售、廣告、使用的管理，控制新抗菌藥的標(biāo)準(zhǔn)，加強(qiáng)抗菌藥物的質(zhì)量監(jiān)督，大力整頓獸藥市場(chǎng)。大腸桿菌耐藥性是一個(gè)復(fù)雜的、持續(xù)進(jìn)化的過程，必須長(zhǎng)期與此做斗爭(zhēng)。

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（編輯：高真貞）

中圖分類號(hào)：S858.28

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1006- 799X（2016）05- 0073- 03

基金項(xiàng)目：由西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新性試驗(yàn)項(xiàng)目，西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)科建設(shè)資助。

作者簡(jiǎn)介：羅潤(rùn)波（1991-），男，四川宜賓人，在讀碩士，主要從事高原動(dòng)物傳染病相關(guān)工作。

通訊作者：索朗斯珠*