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        濾紙SERS基底的制備及其在精漿分析中的應(yīng)用

        2016-06-30 03:00:56曹剛黃祖芳孫艷杜生榮林金勇林居強(qiáng)馮尚源雷晉萍林宏心陳榮
        光散射學(xué)報(bào) 2016年2期
        關(guān)鍵詞:精漿濾紙

        曹剛,黃祖芳*,孫艷,杜生榮,林金勇,林居強(qiáng),馮尚源,雷晉萍,林宏心,陳榮

        (1.醫(yī)學(xué)光電科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福州 350007;2.福建省婦幼保健院,福州 350001)

        濾紙SERS基底的制備及其在精漿分析中的應(yīng)用

        曹剛1,黃祖芳1*,孫艷2,杜生榮2,林金勇1,林居強(qiáng)1,馮尚源1,雷晉萍1,林宏心1,陳榮1

        (1.醫(yī)學(xué)光電科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福州350007;2.福建省婦幼保健院,福州350001)

        摘要:本文介紹浸泡法制備基于濾紙的SERS基底,并分析濾紙SERS基底表面銀納米粒子(AgNP)的分布與浸泡時(shí)間的關(guān)系。以精漿為檢測(cè)對(duì)象,相比于514 nm波長(zhǎng)激發(fā),785 nm激發(fā)可獲得更好的光譜數(shù)據(jù),同時(shí)還比較了該波長(zhǎng)激發(fā)下精漿的常規(guī)拉曼光譜與SERS光譜。更為重要的是,通過(guò)采用精漿中654 cm-1譜峰強(qiáng)度評(píng)估不同浸泡時(shí)間下(6 h,12 h,24 h)濾紙SERS基底的增強(qiáng)性能和測(cè)量結(jié)果的重復(fù)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,12 h浸泡獲得的濾紙SERS基底表面具有均勻的AgNP分布,在785 nm波長(zhǎng)激發(fā)下,紙基SERS基底可提供增強(qiáng)效果及光譜重復(fù)性俱佳的精漿SERS光譜。

        關(guān)鍵詞:表面增強(qiáng)拉曼散射;濾紙;銀納米顆粒;精漿

        1引言

        表面增強(qiáng)拉曼散射(surface-enhanced Raman scattering,SERS)現(xiàn)象于1974年由英國(guó)科學(xué)家Fleischmann等人[1]在吡啶的電化學(xué)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),由于其不僅克服了常規(guī)拉曼光譜存在的信號(hào)弱、易受干擾等缺點(diǎn);同時(shí)還兼具高檢測(cè)靈敏度等優(yōu)點(diǎn),因而引起人們的廣泛關(guān)注。近幾十年來(lái),SERS光譜技術(shù)已發(fā)展成為生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域強(qiáng)有力的工具之一[2-4]。增強(qiáng)基底既是檢測(cè)物的承載基底,同時(shí)又影響著檢測(cè)信號(hào)的增強(qiáng),其研究進(jìn)展很大程度上決定了SERS光譜技術(shù)的發(fā)展。獲得穩(wěn)定、重現(xiàn)性好的SERS光譜信號(hào)是SERS研究領(lǐng)域的重要目標(biāo)和現(xiàn)實(shí)挑戰(zhàn)。目前,金屬溶膠由于其增強(qiáng)效果好、穩(wěn)定性高、容易制備等優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)成為實(shí)驗(yàn)室及相關(guān)檢測(cè)常用的SERS增強(qiáng)基底[5-7],然而金屬膠體會(huì)隨著放置時(shí)間增加產(chǎn)生無(wú)序聚集,容易影響光譜的重復(fù)性,更不適合定量測(cè)量;采用電子束光刻[8]、熱沉降[9]等方法制備的SERS基底,雖可獲得高重復(fù)性的光譜數(shù)據(jù),但基底造價(jià)通常比較昂貴,并且固體基底堅(jiān)硬易碎的缺點(diǎn)會(huì)降低樣品的收集效率,因此有必要發(fā)展廉價(jià)、易用同時(shí)兼具高靈敏性的SERS基底。

        近幾年來(lái),基于濾紙制備的SERS基底研究廣獲關(guān)注。濾紙質(zhì)地柔軟多孔,便宜易得,且具有強(qiáng)親水的特性,因而是適合應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域檢測(cè)研究的一種多功能載體。Yu等人[10]利用打印機(jī)在纖維素紙上打印AgNP,從而獲得快速、簡(jiǎn)單制備的SERS基底;此外,Qu[11]等人采用絲網(wǎng)印刷(screen painting)的方式快速制備出重復(fù)性較好的一次性SERS基底;相比之下,利用浸泡法將金或銀膠體粒子組裝在濾紙上,從而制備出性能良好的SERS基底也有報(bào)道[12-14]。浸泡法可獲得更好的增強(qiáng)效果[12-13],然而浸泡法制備所需時(shí)間較長(zhǎng)(1~2天),且目前這些研究通常主要關(guān)注于增強(qiáng)性能的評(píng)估,鮮見(jiàn)針對(duì)人體體液的檢測(cè)研究報(bào)道。

        基于拉曼技術(shù)的精液檢測(cè)分析以及精液質(zhì)量評(píng)估[15],法醫(yī)學(xué)上犯罪現(xiàn)場(chǎng)體液樣品的區(qū)分鑒別[16]已獲得初步的研究結(jié)果,體現(xiàn)了拉曼檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn),使用濾紙SERS基底進(jìn)行精液SERS光譜檢測(cè)未見(jiàn)報(bào)道。濾紙?jiān)诮Y(jié)構(gòu)和材料上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)使得濾紙SERS基底兼具濾紙的高樣品收集率和SERS基底的高檢測(cè)靈敏度的優(yōu)點(diǎn),有望為體液的檢測(cè)分析提供簡(jiǎn)單、高效的新方法。

        因此,本文采用將濾紙浸泡于濃縮的銀膠溶液中進(jìn)而制備出濾紙SERS基底,并對(duì)基底表面AgNP的分布狀況隨時(shí)間變化的關(guān)系做了詳細(xì)的研究。另外還通過(guò)精漿樣品的SERS光譜檢測(cè),比較了兩種激發(fā)波長(zhǎng)(514 nm和785 nm)在這種基底上的測(cè)試效果,初步探討了濾紙SERS基底相關(guān)檢測(cè)參數(shù)的優(yōu)化,及用于精漿體液檢測(cè)的前期可行性研究。

        2實(shí)驗(yàn)部分

        2.1試劑

        硝酸銀(AgNO3)購(gòu)自上海試劑一廠,鹽酸羥胺(HONH3Cl)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,氫氧化鈉(NaOH)購(gòu)自天津市永大化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)中所用試劑均為分析純。配制溶液和實(shí)驗(yàn)中均使用超純水(Milli-Q,電阻率18.2 MΩ·cm)。

        2.2銀膠和樣品的準(zhǔn)備

        銀膠的制備參照Leopold和Lendl[17]文獻(xiàn)的方法,即采用鹽酸羥胺還原硝酸銀的方法制備。制備好的膠體在離心機(jī)以10000 r/min速度離心10 min,使銀膠分層,移液槍吸棄95%的上層清液,獲得20倍濃縮的銀溶膠,室溫下避光保存?zhèn)溆?。透射電鏡統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,該方法制備的AgNP粒徑為34±5 nm。

        人體精液樣品由福建省立醫(yī)院檢驗(yàn)科提供,待精液液化后,精液樣品以3000 g離心力離心10 min,吸取上層精漿樣品裝入容量為1.5 mL的離心管內(nèi),置于-80℃冰箱冷藏備用。

        2.3紙基SERS基底的制備

        實(shí)驗(yàn)中所用濾紙為英國(guó)GE醫(yī)療有限公司的Whatman 3# 濾紙。首先將濾紙剪成直徑2 cm的圓紙片,再將圓紙片分別放入裝有1.5 mL濃縮銀溶膠的培養(yǎng)皿中浸泡不同時(shí)間(6 h、12 h、24 h),隨后用干凈鑷子把浸泡后的濾紙夾到吸水紙上,快速吸走多余的水分和濾紙表面不固定的AgNP,將獲得的SERS基底在室溫下晾干20 min備用。

        2.4實(shí)驗(yàn)測(cè)試

        為了詳細(xì)表征和評(píng)估AgNP在濾紙基底表面的分布狀況,我們使用JEOL JSM-7500F場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(filed emission scanning electron microscopy,FE-SEM)分別測(cè)得不同處理?xiàng)l件下的濾紙SERS基底10000倍放大的電鏡圖。

        SERS光譜測(cè)試時(shí),吸取10μL精漿樣品滴加在SERS基底上并于室溫下干燥10 min。測(cè)試所用儀器為裝配有785 nm和514 nm兩種波長(zhǎng)的激光器的英國(guó)Renishaw公司Invia型共聚焦顯微拉曼光譜系統(tǒng),光譜的測(cè)量范圍是600~1800 cm-1,20倍物鏡,積分時(shí)間為10 s,曝光1次。儀器自帶的WiRE 3.4軟件測(cè)得的原始光譜數(shù)據(jù)先使用Zhao[18]等人提出的方法進(jìn)行基線(xiàn)校正,然后在600~1800 cm-1的光譜范圍內(nèi)進(jìn)行歸一化處理。

        3結(jié)果與討論

        實(shí)驗(yàn)中選用濾紙制備SERS基底一方面是由于濾紙的主要成分是纖維素,與其他種類(lèi)的紙相比,濾紙只有很弱的背景信號(hào)[10],更重要的是,濾紙質(zhì)地柔軟多孔并且具有很強(qiáng)的親水性,這種結(jié)構(gòu)對(duì)金屬納米粒子的吸附以及對(duì)含水樣品的快速吸收和濃縮具有非常重要的作用。濾紙?jiān)诮萦跐饪s的銀溶膠前為白色,隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng),濾紙顏色逐漸變?yōu)樯罨疑?這意味著有更多的AgNP吸附在濾紙上,在圖1(A)的掃描電鏡圖中可以看出,濾紙纖維呈現(xiàn)出一種互相纏繞的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),正是這種結(jié)構(gòu)為金屬納米粒子的擴(kuò)散和固定提供了很大的表面積和毛細(xì)作用力支持,而且這種形態(tài)有利于AgNP形成層內(nèi)和層間的等離子體耦合,而后者對(duì)SERS信號(hào)的增強(qiáng)起到了極大地作用[13]。在圖1(B~D)中可以看到,隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng),AgNP在濾紙上分布越來(lái)越密集和均勻,這種結(jié)構(gòu)往往有利于得到重復(fù)性良好的SERS光譜。

        Fig.1 FE-SEM images of filter paper after dipping into concentrated silver colloids for(A)0 h(B)6 h(C)12 h(D)24 h

        鑒于濾紙基底具備的良好結(jié)構(gòu)特性,我們以體液中常見(jiàn)的精漿為檢測(cè)對(duì)象評(píng)估這種基底的增強(qiáng)效果。雖然之前的研究表明常規(guī)拉曼光譜可用于精液、精漿的質(zhì)量分析和法醫(yī)學(xué)上犯罪現(xiàn)場(chǎng)體液樣品的識(shí)別[15-16],然而精液中的大蛋白分子容易對(duì)拉曼信號(hào)產(chǎn)生干擾,因而常規(guī)拉曼的原始光譜信號(hào)較弱,信噪比較低,SERS技術(shù)可以克服常規(guī)拉曼測(cè)試的不足,提供更高的檢測(cè)靈敏度。圖2所示為785 nm的激發(fā)光在同一測(cè)試條件下原始精漿樣品的常規(guī)拉曼光譜(A)與濾紙基底上測(cè)量獲得的SERS光譜(B)的比較,圖3比較了經(jīng)過(guò)基線(xiàn)校正和歸一化處理后的兩種拉曼光譜。可以看出,精漿樣品在SERS基底上的拉曼信號(hào)獲得顯著的增強(qiáng),而精漿的常規(guī)拉曼信號(hào)較弱,譜峰較少,熒光背景強(qiáng)。而在濾紙SERS基底上進(jìn)行SERS檢測(cè)時(shí),類(lèi)似于血漿與AgNP的相互作用[7],精漿中的生化成分與AgNP相互作用,使得其拉曼信號(hào)獲得了極大地增強(qiáng)。在圖3中的SERS光譜可以觀察到數(shù)條主要的譜峰,包括654,724,956,1131,1212,1327,1455,1572,1649 cm-1等,根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)的結(jié)果[3,15,19],表1列出了這些主要峰位對(duì)應(yīng)的的譜峰歸屬,可見(jiàn),光譜輪廓及譜峰位置與之前的研究結(jié)果[3]類(lèi)似,而譜峰強(qiáng)度的差異主要是由于樣品中不同物質(zhì)成分濃度變化造成的。值得注意的是,滴加在濾紙基底上的精漿會(huì)由于濾紙的吸水作用而很快變干,這種擴(kuò)散作用使得樣品得到快速濃縮并且使樣品分子可以與AgNP充分接觸,從而獲得更好的測(cè)試結(jié)果;從這方面考慮,濾紙SERS基底進(jìn)行體液SERS測(cè)試比傳統(tǒng)固體SERS基底更高效。

        Fig.2 Raw Raman spectra of seminal plasma(A)Normal;(B)SERS

        Fig.3(A)Normal Raman spectrum of seminal plasma;(B)SERS spectrum of seminal plasma based on paper SERS substrate

        Tab.1 SERS peak positions and their tentative peak assignments

        為了比較濾紙基底在不同激發(fā)波長(zhǎng)下的測(cè)試效果,實(shí)驗(yàn)中分別使用波長(zhǎng)為514 nm和785 nm的激發(fā)光進(jìn)行精漿樣品的SERS光譜檢測(cè)。圖4所示為濾紙SERS基底分別在514 nm和785 nm激發(fā)下的背景信號(hào);由圖可見(jiàn),基底在600~1800 cm-1的區(qū)域內(nèi)無(wú)拉曼干擾信號(hào),只為熒光背景,這表明濾紙SERS基底在生物信息豐富的“指紋”區(qū)域(600~1800 cm-1)對(duì)樣品測(cè)試幾乎不存在影響。圖5為在兩種激發(fā)波長(zhǎng)下獲得的精漿樣品原始SERS光譜圖,比較A(514 nm激發(fā))和B(785 nm激發(fā))兩條譜線(xiàn)可以看出,主要譜峰基本一致,但是514 nm激發(fā)光下的精漿SERS光譜顯示出很強(qiáng)的熒光背景干擾,這表明波長(zhǎng)514 nm的激發(fā)光在光譜測(cè)量過(guò)程中膠體并沒(méi)有充分地淬滅熒光背景信號(hào);相比之下,785 nm波長(zhǎng)的激發(fā)光可獲得背景干擾小,譜峰更為豐富的SERS光譜數(shù)據(jù),因而波長(zhǎng)為785 nm的激發(fā)光更適合進(jìn)行精漿SERS光譜的測(cè)量。

        掃描電鏡的觀察雖可提供濾紙于不同浸泡時(shí)間下AgNP在濾紙表面的客觀分布情況,然而為了全面和有效的評(píng)估精漿樣品在不同時(shí)間浸泡處理后的濾紙上的SERS光譜表現(xiàn),實(shí)驗(yàn)中我們選取精漿SERS光譜中最強(qiáng)譜峰654 cm-1的強(qiáng)度來(lái)表征和比較浸泡不同時(shí)間的SERS基底的增強(qiáng)效果。具體實(shí)驗(yàn)操作如下:激光功率為2.2 mW,每個(gè)測(cè)試樣品的中心區(qū)域選取三個(gè)不同位置點(diǎn)分別測(cè)量獲得三條光譜。將獲得的光譜數(shù)據(jù)統(tǒng)一扣除熒光背景后,計(jì)算獲得654 cm-1峰位光譜強(qiáng)度的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。如圖6所示,654 cm-1譜峰強(qiáng)度值隨浸泡時(shí)間的增加呈明顯的遞增趨勢(shì),在浸泡24 h時(shí)強(qiáng)度達(dá)到最大,這與掃描電鏡下AgNP顆粒在24 h處具有最大的密度分布相符,同時(shí)從標(biāo)準(zhǔn)差值可以看出654 cm-1譜峰強(qiáng)度的相對(duì)誤差逐漸減小,這主要是由于浸泡時(shí)間的增加使濾紙上的AgNP密度增加,同時(shí)總體上分布更為均勻。值得一提的是,我們發(fā)現(xiàn)浸泡時(shí)間為24 h比12 h的標(biāo)準(zhǔn)差稍大一些,可能是隨著浸泡時(shí)間的增加,局部區(qū)域AgNP粒子密度分布增加的同時(shí),形成一定厚度的聚集。因而雖然“熱點(diǎn)”數(shù)量增加,但是局部分布不均勻,進(jìn)而導(dǎo)致信號(hào)強(qiáng)度在不同位置點(diǎn)的變化的增大。本文所采用的方法獲得了與Hasi等人[14]報(bào)道的類(lèi)似結(jié)果,SERS基底表面具有相似均勻度的銀納米粒子分布,據(jù)估算浸泡12 h后,濾紙SERS基底的增強(qiáng)因子可以達(dá)到104~105數(shù)量級(jí)。更為重要的是,通過(guò)測(cè)量滴加在12 h浸泡的濾紙SERS基底上的精漿SERS光譜,以精漿SERS譜峰中最強(qiáng)譜峰654 cm-1的強(qiáng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)算獲得的相對(duì)誤差僅為8%,因而浸泡12 h處理的濾紙SERS基底足以確保獲得重復(fù)性較高的精漿SERS光譜。

        Fig.4Background signal of filter paper-based SERS substrates under different excitation wavelengths(A:514 nm,B:785 nm)

        Fig.5Raw SERS spectra obtained from seminal plasma sample under different excitation wavelengths(A:514 nm,B:785 nm)

        值得注意的是,在進(jìn)行SERS光譜測(cè)試時(shí),體液樣品在濾紙基底上大范圍的擴(kuò)散有可能會(huì)影響光譜測(cè)試時(shí)信號(hào)的收集效率,另外,采用浸泡法制備SERS基底的時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng),制備出的基底會(huì)由于AgNP被氧化而降低SERS活性[20]。因此,尋找一種既能縮短基底制備的時(shí)間又能確保高增強(qiáng)效率的濾紙SERS基底的制備方法,以及控制樣品在基底上的擴(kuò)散范圍將是接下來(lái)主要開(kāi)展的工作。

        Fig.6Comparison of Raman peak intensity at 654 cm-1using 785 nm excitation laser

        4結(jié)論

        本文初步研究了浸泡法制備基于濾紙的SERS基底其表面AgNP的分布狀況與浸泡時(shí)間的關(guān)系,從電鏡圖中可以看出,隨著浸泡時(shí)間的增加,AgNP的密度也隨之增加。浸泡法提供了一種便捷的方式來(lái)制備出簡(jiǎn)單有效并具有較好SERS活性的基底,通過(guò)對(duì)比785 nm和514 nm兩種不同激發(fā)光激發(fā)的精漿SERS光譜發(fā)現(xiàn),785 nm激發(fā)可獲得更好的精漿SERS光譜,與傳統(tǒng)拉曼光譜相比,這種紙基SERS基底具有很好的增強(qiáng)效果,并且使用濾紙SERS基底可以獲得重復(fù)性較好的SERS光譜。通過(guò)對(duì)濾紙基底上精漿SERS光譜的檢測(cè),并進(jìn)一步優(yōu)化濾紙基底的性能,進(jìn)而有望將濾紙SERS基底拓展到其它體液如血液、尿液等的臨床檢測(cè)分析??梢灶A(yù)見(jiàn)這種基于濾紙制備的SERS基底有望在將來(lái)應(yīng)用于犯罪現(xiàn)場(chǎng)體液的原位檢測(cè)以及臨床上基于體液的疾病快速檢測(cè)。

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        Preparation of Filter Paper-Based Surface-Enhanced Raman Scattering(SERS)Substrate and Its Application for Seminal Plasma Analysis

        CAO Gang1,HUANG Zu-fang1*,SUN Yan2,DU Sheng-rong2,LIN Jin-yong1,LIN Ju-qiang1,FENG Shang-yuan1,LEI Jin-ping1,LIN Hong-xin1,CHEN Rong1

        (1.KeyLaboratoryofOptoElectronicScienceandTechnologyforMedicine,MinistryofEducation,FujianNormalUniversity,Fuzhou350007,China;2.FujianMaternalandChildHealthHospital,Fuzhou350001,China)

        Abstract:This article introduced a filter paper-based SERS substrate through soaking method,and investigated the relationship between the distributions of silver nanoparticles(AgNPs)on the filter paper with soaking time in detail.SERS spectra of seminal plasma under different excitation wavelengths(514 nm and 785 nm)were compared,and the latter was confirmed to demonstrate better SERS signals.SERS and normal Raman spectra of seminal plasma using 785 nm excitation laser was compared as well.More importantly,the intensity of the strongest peak(654 cm-1)from SERS spectra of seminal plasma was used to evaluated the enhancement effects and signal reproducibility with filter paper SERS substrates under different soaking time(6 h,12 h,24 h).Our results indicated that the AgNPs on the paper substrate soaked with concentrated AgNP colloid presented a relatively uniform distribution at the soaking time of 12 h and the substrate demonstrated high Raman signal enhancement and good signal reproducibility as well.

        Key words:surface-enhanced Raman scattering;filter paper;silver nanoparticles;seminal plasma

        文章編號(hào):1004-5929(2016)02-0106-06

        收稿日期:2015-06-15; 修改稿日期:2015-09-12

        基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(61308113);福建省自然科學(xué)基金(2013J01225,2014J01399)

        作者簡(jiǎn)介:曹剛(1990-),男,碩士,主要從事表面增強(qiáng)拉曼散射基底的制備及性能研究。E-mail:caogang0648@163.com 通訊作者:黃祖芳,E-mail:zfhuang@fjnu.edu.cn

        中圖分類(lèi)號(hào):O433.4

        文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

        doi:10.13883/j.issn1004-5929.201602002

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