馮艷琴　姚忠紅　秦雪琴（湖北省十堰市太和醫(yī)院湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北　十堰　442000）

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鹿瓜多肽注射液對(duì)脊柱椎體骨折康復(fù)過(guò)程中骨密度及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響

馮艷琴姚忠紅△秦雪琴
（湖北省十堰市太和醫(yī)院湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北十堰442000）

【摘要】目的觀察鹿瓜多肽注射液對(duì)脊柱椎體骨折愈合過(guò)程中骨折椎體骨密度及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）表達(dá)的影響。方法將204例患者按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組及治療組，每組102例，對(duì)照組電針夾脊穴，配合血海、足三里、陽(yáng)陵泉三穴電針刺激20 min，治療組在此基礎(chǔ)上穴位注射鹿瓜多肽注射液。采用圖像分析法測(cè)定患者治療前后骨折椎體骨密度，采用免疫組化染色測(cè)定患者血清VEGF、VEGF mRNA陽(yáng)性表達(dá)，比較總有效率，評(píng)價(jià)穴位注射鹿瓜多肽注射液對(duì)脊柱椎體骨折臨床療效。結(jié)果與對(duì)照組比較，圖像分析顯示治療組患者骨密度明顯提高，血清VEGF及VEGF mRNA陽(yáng)性表達(dá)均明顯增強(qiáng)，總有效率90.19%明顯高于對(duì)照組的73.52%（均P＜0.05）。結(jié)論鹿瓜多肽注射液對(duì)增加骨鈣沉積、促進(jìn)骨折椎體骨痂形成及椎體骨折愈合過(guò)程中VEGF的合成分泌，促使骨折椎體局部組織血管內(nèi)皮新生，增加局部骨折組織血液供應(yīng)，調(diào)節(jié)椎間盤組織細(xì)胞代謝并維持平衡等具有明顯的作用。

【關(guān)鍵詞】鹿瓜多肽注射液脊柱椎體骨折骨密度血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子總有效率

脊柱壓縮骨折（OVCF）是以骨質(zhì)疏松為病理基礎(chǔ)，患者成骨、破骨細(xì)胞分解與合成代謝平衡失調(diào)，以成骨細(xì)胞合成增殖減少，破骨細(xì)胞合成增殖提高，尤其以脊柱椎體骨格鈣、磷代謝紊亂而造成骨質(zhì)疏松，在外力的作用下，易導(dǎo)致脊柱壓縮骨折，且以L1～5腰椎椎體壓縮骨折多見，嚴(yán)重可造成癱瘓而影響患者生活質(zhì)量［1］。流行病學(xué)調(diào)查顯示脊柱椎體壓縮骨折以50歲以上的絕經(jīng)老年婦女多見，發(fā)生率在15%左右［2］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）具有增加微、小靜脈血管的通透性、促使血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖及誘導(dǎo)血管再生等作用［3］。受此啟發(fā)，在治療脊柱壓縮骨折上取得不少新成果，如利用中醫(yī)促進(jìn)骨折局部血液循環(huán)，增加局部組織VEGF合成。VEGF與最先發(fā)現(xiàn)的血管通透性因子（VPF）的結(jié)構(gòu)功能一致［4］，具有促進(jìn)多種血管活性物質(zhì)合成、血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移及再生、參與骨折部位動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)形成的調(diào)節(jié)［5］，是一種高度特異性的促血管生長(zhǎng)因子，故VEGF在臨床上常作為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)功能的重要指標(biāo)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證實(shí)，維持正常骨鈣代謝、正常的骨密度對(duì)穩(wěn)定脊柱椎體結(jié)構(gòu)起到至關(guān)重要的作用。故本研究以VEGF的分泌及骨密度等指標(biāo)來(lái)觀察分析穴位注射鹿瓜多肽注射液對(duì)椎體壓縮性骨折的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　資料與方法

1.1病例選擇診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照1999年《中國(guó)人原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥診斷標(biāo)準(zhǔn)（試行）》［6］有以下之一者可確診為骨質(zhì)疏松脊柱壓縮骨折病。1）患者年齡大于6歲，有明顯的全身乏力、骨痛及腰背痛等臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重患者出現(xiàn)駝背體癥，自述或家屬證實(shí)有輕微外傷史，CT片顯示1～2個(gè)胸椎和/或腰椎壓縮性骨折，確定為輕微外傷導(dǎo)致的脊柱骨折。2）X線骨密度儀（型號(hào)為DEXA，OSTEOCORE-3，法國(guó)）檢查骨密度低于＜M-2SD，即骨密度檢測(cè)為陽(yáng)性患者。3）CT片顯示壓縮性骨折不超過(guò)椎體的1/4的患者，或嚴(yán)重脊柱后突畸形的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)［7］：1）患者檢查合并有嚴(yán)重心、肝、腎、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病者；2）CT片顯示椎體有3個(gè)以上的壓縮性骨折；3）患者既往臨床資料不全等影響療效者，或未按規(guī)定治療方案導(dǎo)致無(wú)法判斷療效；4）X線骨密度儀檢測(cè)骨密度示骨質(zhì)疏松，但CT又無(wú)壓縮性骨患者；5）患者CT片顯示壓縮性骨折超過(guò)椎體的1/4的。

1.2臨床資料湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院脊柱外科2013年11月至2015年6月收治的骨質(zhì)疏松脊柱壓縮骨折住院患者204例，按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組與治療組各102例。對(duì)照組中男性33例，女性69例；平均年齡（69.31±7.84）歲；平均病程（37.50± 3.25）d。治療組中男性35例，女性67例；平均年齡（71.17±8.94）歲；平均病程（36.97±3.52）d。兩組病例在年齡、性別比例、病程等方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），且無(wú)病例脫落。

1.3治療方法對(duì)照組男性患者靜滴降鈣素7 d。女性患者采用激素代替療法7周，靜滴降鈣素等常規(guī)治療7 d。參照高樹中著《針灸治療學(xué)》［9］，根據(jù)不同病情痛點(diǎn)循經(jīng)選穴電針治療。選脊柱兩側(cè)夾脊穴，針刺入2～4 cm，行導(dǎo)氣手法，旁開2～3 cm配穴，以?shī)A脊穴齊刺點(diǎn)為正極，配穴為負(fù)極，配合胃俞、脾俞、氣海俞、腎俞，接G6805-2A型電針治療儀，連續(xù)波，頻率10 Hz，電針刺激20 min，刺激強(qiáng)度以患者可以耐受為度，治療期間減少活動(dòng)量，疼痛部位加用超短波理療30 min，TDP照射骨折局部皮膚20 min。電針刺激治療每日1次，每周治療6次休息1 d，7 d為1療程，治療8個(gè)療程。治療組在對(duì)照組治療基礎(chǔ)上，根據(jù)病情循經(jīng)選穴，也可選擇痛點(diǎn)阿是穴2～3個(gè)部位，定點(diǎn)后注射鹿瓜多肽注射液（黑龍江江世藥業(yè)有限公司，規(guī)格2 mL/4 mg，批號(hào)H20061211）1 mL，每周注射5次，間歇2 d，7 d為1療程，治療8個(gè)療程。

1.4療效標(biāo)準(zhǔn)參照2002年《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則（試行）標(biāo)準(zhǔn)》［8］評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)患者臨床治愈、顯效、有效、無(wú)效病例數(shù)，計(jì)算總有效率，總有效率=（治愈例數(shù)+顯效例數(shù)）/總病例數(shù)×100%。臨床治愈：疼痛消失，駝背等被動(dòng)體位基本消失，骨質(zhì)密度明顯增加。顯效：疼痛基本消失，駝背等被動(dòng)體位略有好轉(zhuǎn)，骨密度檢查骨質(zhì)密度有一定的增強(qiáng)。有效：疼痛略有好轉(zhuǎn)，駝背及骨質(zhì)密度無(wú)明顯好轉(zhuǎn)和增加。無(wú)效：治療前后體癥及骨密度檢查無(wú)變化。

1.5檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)［10］。CT影像檢查骨折椎體骨密度采用免疫組化染色及圖像分析法測(cè)定骨折椎體VEGF、VEGF mRNA陽(yáng)性表達(dá)。采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)兩組患者血清VEGF、VEGF-mRNA蛋白等表達(dá)。采用雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定VEGF蛋白表達(dá)的光密度（OD）值。分別抽取患者治療前后靜脈血并分別編號(hào)置于-20℃冰凍待查。檢測(cè)時(shí)將標(biāo)本3000 r/min轉(zhuǎn)離心30 min，取上清液（待測(cè)樣本），將標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣本加入到預(yù)先包被的VEGF單克隆抗體透明酶標(biāo)包被板中，37℃溫育30 min，洗滌后再加入酶標(biāo)工作液，再于37℃下溫育30 min后洗滌除去未結(jié)合的成分，依次加入底物A、B，底物在辣根過(guò)氧化物酶催化下轉(zhuǎn)化為藍(lán)色產(chǎn)物，在酸的作用下變成黃色，顏色的深淺與樣品VEGF濃度呈正比，用SP-Max 3500FL型多功能熒光酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定VEGF的OD值。VEGF mRNA測(cè)定方法參照文獻(xiàn)［11］，標(biāo)本進(jìn)行RNA提取，采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）測(cè)定VEGF mRNA表達(dá)水平。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以（±s）表示，兩組間的均數(shù)檢驗(yàn)采用多因素方差分析，組間構(gòu)成比差異檢驗(yàn)采用Χ2檢驗(yàn)，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1兩組臨床療效比較見表1。治療組總有效率明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）。

表1　兩組臨床療效比較（n）

2.2兩組治療前后VEGF、VEGF mRNA表達(dá)及骨密度比較如表2。對(duì)照組VEGF、VEGF mRNA治療后有一定的增強(qiáng)，但治療前后比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；治療后治療組VEGF、VEGF mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。X線骨密度儀示對(duì)照組骨密度在治療后增大（P＜0.05）。治療組骨密度顯著升高，與治療前及對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。

表2　兩組治療前后VEGF、VEGF mRNA表達(dá)及骨密度比較（±s）

表2　兩組治療前后VEGF、VEGF mRNA表達(dá)及骨密度比較（±s）

與本組治療前比較，*P＜0.05；與對(duì)照組治療后比較，△P＜0.05。

組別　時(shí)間　骨密度（g/cm2）（n＝102）　治療后　2.91±0.15*治療組　治療前　1.83±0.11 （n＝102）　治療后　3.89±0.19*△對(duì)照組　治療前　1.87±0.12 VEGF（Pg/mL）VEGF mRNA 23.57±2.89　0.75±0.09 19．24±1．87　0.68±0.05 44．02±4.14*△　1.75±0.11*△21．50±2．03　0.67±0.05

2．3不良事件治療組所有患者穴位注射鹿瓜多肽注射液治療無(wú)嚴(yán)重并發(fā)癥發(fā)生。

3　討論

鹿瓜多肽注射液是從鹿科動(dòng)物梅花鹿的骨骼和葫蘆科植物甜瓜的干燥成熟種子中提取的多肽注射液類生物活性因子合成的一種復(fù)方滅菌注射液，富含骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）等多種骨誘導(dǎo)多肽類因子。鹿瓜多肽注射液中含有的骨誘導(dǎo)多肽類生物因子具有調(diào)節(jié)骨代謝，刺激成骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)新骨形成，能有效刺激軟骨和成骨細(xì)胞的分化及增長(zhǎng)、促進(jìn)骨痂形成及骨折修復(fù)愈合［12］。鹿瓜多肽注射液中的甜瓜籽提取物中有多種游離氨基酸和有機(jī)鈣、磷，并具降低骨折局部毛細(xì)血管通透性，減少炎性浸潤(rùn)及滲出，調(diào)節(jié)鈣磷代謝，增加骨鈣沉積；防止骨質(zhì)疏松以及抗炎鎮(zhèn)痛抗風(fēng)濕等作用［13］。近年來(lái)鹿瓜多肽用于治療脊柱椎體骨折、強(qiáng)直性脊柱炎、各種類型骨折、創(chuàng)傷修復(fù)及腰腿疼痛等取得了一定成效［14］，本文采用穴位注射鹿瓜多肽注射液治療脊柱椎體骨折，旨在挖掘中醫(yī)藥治療脊柱椎體骨折優(yōu)勢(shì)，探討其作用機(jī)制，以期研究聯(lián)合治療的鎮(zhèn)痛消炎作用機(jī)制，為臨床提供安全可靠的治療方案。

觀察發(fā)現(xiàn)，治療組患者骨密度明顯提高，血清VEGF及VEGF mRNA陽(yáng)性表達(dá)均明顯增強(qiáng)，總有效率明顯高于對(duì)照組，療效明顯優(yōu)于對(duì)照組。分析認(rèn)為，在本臨床研究中，對(duì)照組在治療后，骨密度提高，說(shuō)明男性患者靜滴降鈣素7 d及女性患者采用激素代替療法7周的治療方案對(duì)促進(jìn)骨鈣沉積、骨痂形成及骨折修復(fù)愈合有一定的作用，其VEGF蛋白質(zhì)及VEGF mRNA陽(yáng)性表達(dá)有不同程度提高，說(shuō)明椎體椎體骨折創(chuàng)傷可在一定程度上刺激機(jī)體VEGF的分泌，但針灸及其他常規(guī)治療不能有效提高VEGF蛋白質(zhì)及VEGF mRNA陽(yáng)性表達(dá)。而治療組在肌肉注射鹿瓜多肽注射液治療21 d后，VEGF蛋白質(zhì)及mRNA陽(yáng)性表達(dá)明顯增強(qiáng)，提示鹿瓜多肽注射液具有促進(jìn)椎體損傷時(shí)VEGF的分秘的作用，這與彭昊研究鹿瓜多肽注射液誘導(dǎo)缺骨折愈合過(guò)程中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)，促進(jìn)骨折局部組織血管再生，促進(jìn)受損血管內(nèi)皮修復(fù)的功能一致［15］。治療組骨密度明顯增強(qiáng)，這是由于鹿瓜多肽注射液具有多種生物活性，其骨誘導(dǎo)多肽類生物因子促進(jìn)了機(jī)體內(nèi)影響骨形成和吸收的骨源性生長(zhǎng)因子的合成，包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）及FGF等，這些成分可促進(jìn)骨折部位細(xì)胞有絲分裂、分化及趨化作用。BMPs可誘導(dǎo)骨折局部組織血管周圍游動(dòng)的間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為不可逆性的骨系細(xì)胞，增加軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的活動(dòng)力，降低破骨細(xì)胞分化從而誘導(dǎo)新骨及骨痂形成，進(jìn)而達(dá)到促進(jìn)骨折修復(fù)的目的。FGF可刺激成骨的細(xì)胞增值和分化，促進(jìn)骨膠原蛋白及非膠原蛋白的趨向移動(dòng)、增加骨鈣素的合成，BMPs還可通過(guò)與TGF-β和FGF相互之間的協(xié)調(diào)作用調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)而誘導(dǎo)新骨形成，故治療組患者骨密度較對(duì)照組明顯增強(qiáng)。有研究表明，在促進(jìn)骨折早期愈合過(guò)程中，甜瓜籽提取物與BMPs、FGF等骨誘導(dǎo)多肽生物因子可促進(jìn)骨原性生長(zhǎng)因子合成，為骨細(xì)胞合成BMPs、FGF等骨源性生物因子提供原料，具有明顯的協(xié)同作用［16］，可促進(jìn)骨源性生物因子的合成及鈣磷代謝，維持骨容量，增加骨鈣含量，增強(qiáng)骨密度。

綜上所述，鹿瓜多肽注射液可促進(jìn)椎體骨折愈合過(guò)程中VEGF及VEGFmRNA的表達(dá)，促使骨折椎體血管內(nèi)皮新生，增加局部骨折組織血液供應(yīng)，降低骨折局部毛細(xì)血管通透性，減少炎性浸潤(rùn)及滲出，降低破骨細(xì)胞分化從而誘導(dǎo)新骨及骨痂形成而達(dá)到促進(jìn)骨折修復(fù)的作用。穴位注射鹿瓜多肽治療脊柱壓縮骨折療效顯著，充分發(fā)揮中西醫(yī)結(jié)合治療優(yōu)勢(shì)，有一定的臨床推廣價(jià)值。

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The Effect of Deer Melon Polypeptide Injection on Bone mineral Density and Expression of Vascular Endothelial Growth Factor During Rehabilitation of Vertebral Fracture

FENG Yanqin，YAO Zhonghong，QIN Xueqin.Shiyan Taihe Hospital of Hubei province，Hubei Medical College，Hubei，Shiyan 442000，China.

【Abstract】Objective：To observe the effect of Deer melon polypeptide Injection on bone mineral density and expression of vascular endothelial growth factor during rehabilitation of vertebral fracture.Methods：204 patients were randomly divided into the control group and treatment group，each group of 102 cases.Control group were treated with electric acupuncture.Treatment group were treated with point injection of Deer melon polypeptide Injection on the basis of control group.The bone density of patients with bone density was measured by image analysis method.The expression of VEGFmRNA and VEGF was detected by immunohistochemical staining，and the total effective rate was compared.Results：The bone mineral density in treatment group was significantly were higher than that in the treatment group.Compared with control group，the positive expression of serum VEGF and VEGFmRNA were significantly enhanced.And the total effective rate of treatment group was 90.19%，which was higher than that of control group（P＜0.05）.Conclusion：Deer melon polypeptide Injection has a a good effect on Increasing bone calcium precipitation，promoting the formation of bone callus，promoting VEGF secretion during rehabilitation of vertebral fracture，increasing the blood supply of local bone tissue，adjusting the cell metabolism and maintain balance.

【Key words】Deer melon polypeptide injection；Vertebral fracture；Bone mineral density；Vascular endothelial growth factor

中圖分類號(hào)：R274.15

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：1004-745X（2016）04-0699-04

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.04.044

*基金項(xiàng)目：湖北省科技廳項(xiàng)目（B20122418）

通信作者△（電子郵箱：FengYanqin163163@126.com）

收稿日期（2015-11-03）