宣偉軍丁大連，　蔣海燕楊琨韋瑀龍陳壯唐俊波廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院耳鼻咽喉頭頸外科2廣西中醫(yī)藥大學(xué)瑞康醫(yī)學(xué)院耳鼻咽喉頭頸外科 Center for hearing deafness，the State University of New York at Buffalo，USA廣西中醫(yī)藥大學(xué)瑞康醫(yī)學(xué)院制藥廠

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復(fù)方健耳劑對(duì)C57BL/6J小鼠AHL毛細(xì)胞的保護(hù)作用

宣偉軍1，2丁大連1，2，3蔣海燕3楊琨3韋瑀龍4陳壯4唐俊波1
1廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院耳鼻咽喉頭頸外科
2廣西中醫(yī)藥大學(xué)瑞康醫(yī)學(xué)院耳鼻咽喉頭頸外科
3 Center for hearing deafness，the State University of New York at Buffalo，USA
4廣西中醫(yī)藥大學(xué)瑞康醫(yī)學(xué)院制藥廠

【摘要】目的探討老年性耳蝸毛細(xì)胞損害與中藥復(fù)方健耳劑兩種喂藥方法干預(yù)的作用。方法選擇1月齡C57BL/ 6J小鼠22只用于本實(shí)驗(yàn)，其中4只小鼠每日飲用自來水直到出生后3個(gè)月作為幼齡對(duì)照組；6只小鼠每日飲用自來水直到出生后7個(gè)月作為老年性聾對(duì)照組；6只小鼠每日自動(dòng)飲用中藥復(fù)方健耳劑直到出生后7個(gè)月；另6只小鼠每日自動(dòng)飲用同樣中藥至4個(gè)月后改用每日人工灌服直到出生后7個(gè)月。各組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)到期終止后，取耳蝸進(jìn)行全耳蝸基底膜鋪片，將全耳蝸內(nèi)、外毛細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果輸入計(jì)算機(jī)并應(yīng)用耳蝸圖軟件進(jìn)行耳蝸毛細(xì)胞密度對(duì)比分析，其中選擇基底膜上重要的病變區(qū)間的毛細(xì)胞密度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果3月齡對(duì)照組小鼠耳蝸外、內(nèi)毛細(xì)胞缺損僅僅出現(xiàn)在耳蝸底回鉤端區(qū)域；7月齡對(duì)照組外、內(nèi)毛細(xì)胞缺損從底回基底膜起始端擴(kuò)展到距離耳蝸頂端約40％區(qū)域；7月齡中藥灌服組和自動(dòng)飲用組動(dòng)物的內(nèi)、外毛細(xì)胞缺損范圍和程度相似，均顯著比7月齡對(duì)照組為輕（P＜0.001）。結(jié)論中藥復(fù)方健耳劑能夠有效延緩C57BL/6J小鼠老年性耳蝸毛細(xì)胞損害的發(fā)生和發(fā)展，兩種喂藥方式所起作用相同（P＞0.05），其藥理機(jī)制可能與其改善微循環(huán)，清除活性氧，保護(hù)線粒體等作用相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】C57BL/6J小鼠，老年性聾，毛細(xì)胞，中藥

Funding:this research was supported by National Natural Science Foundation of China grant No.81260552，No.81373700，and Guangxi Natural Science Foundation of China grant No.2014GXNSFAA118162.

Competing interests:The authors have declared that no competing interests exist.

老年性聾又稱年齡相關(guān)性聾（age-related hearing loss，AHL），隨著社會(huì)人口老齡化加重，AHL發(fā)病率呈逐年大量增加趨勢，據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）估計(jì)，到2025全世界60歲以上人口約有12億，其中僅65-75歲老年人群中約70-80％將患有AHL，已成為嚴(yán)重影響老年人生活質(zhì)量的常見和難治、甚至不治的感音神經(jīng)性聾［1］，因此，尋找有效藥物，對(duì)AHL早期發(fā)現(xiàn)，早期干預(yù)，早期防治的意義十分重大。復(fù)方健耳劑系筆者通過長期臨床治療感音神經(jīng)性聾實(shí)踐，不斷總結(jié)和優(yōu)化形成的中藥新配方，為了了解其干預(yù)老年性耳蝸毛細(xì)胞損害影響作用，近年來我們以C57BL/6J小鼠作為AHL模型，觀察了復(fù)方健耳劑對(duì)老年性聾發(fā)病早期小鼠的耳蝸毛細(xì)胞的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)復(fù)方健耳劑具有顯著延緩老年性耳蝸毛細(xì)胞損害的防治作用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選擇1月齡剛斷奶國產(chǎn)健康C57BL/6J小鼠22只，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)公司提供［批號(hào)：SCXK（京）2012-0001］，雌雄不拘，隨機(jī)分為3月齡幼齡對(duì)照組4只、7月齡對(duì)照組6只，同時(shí)針對(duì)學(xué)術(shù)界有學(xué)者提出實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自然飲用藥物與人工灌喂藥物可能產(chǎn)生不同結(jié)果的爭議，因此專門設(shè)立了自然飲用藥物和人工灌喂藥物兩組實(shí)驗(yàn)，即7月齡中藥1組和中藥2組各6只。3月齡對(duì)照組小鼠自斷奶后食用常規(guī)飼料并飲用自來水至出生后三個(gè)月終止實(shí)驗(yàn)。7月齡對(duì)照組小鼠自斷奶后食用常規(guī)飼料并飲用自來水至出生后七個(gè)月終止實(shí)驗(yàn)。7月齡中藥1組小鼠自斷奶后食用相同的常規(guī)飼料，但在出生后一個(gè)月開始每日自動(dòng)飲用中藥溶液以代替日常飲水，直到出生后七個(gè)月終止實(shí)驗(yàn)。7月齡中藥2組小鼠前三個(gè)月飲藥條件與7月齡中藥1組完全相同，但到第四個(gè)月即開始改為每日人工灌服中藥溶液直到出生后七個(gè)月止，這是因?yàn)?月齡以下小鼠尚處幼年階段，難于承受和完成長達(dá)數(shù)月的每日人工灌喂藥物，稍有操作不慎則極易造成局部損傷而導(dǎo)致動(dòng)物死亡。所有期滿實(shí)驗(yàn)小鼠的一側(cè)耳用于全耳蝸毛細(xì)胞鋪片和定位定量分析，另一側(cè)耳的耳蝸膜迷路被用于其它研究與聽功能檢測結(jié)果將另文發(fā)表。

2　實(shí)驗(yàn)藥物及用量

復(fù)方健耳劑主要由葛根、丹參、黃芪、骨碎補(bǔ)等組成。經(jīng)過水煮、濃縮、烘干、反復(fù)粉碎和過篩等流程，制成每克藥粉相當(dāng)于6.63克生藥材。按照《中藥藥理研究方法學(xué)》［2］小鼠與成人用量換算法，計(jì)算出該藥的小鼠用量定為1.83g/kg/日。中藥粉加適量比例水配兌（一般為0.05克藥粉加5毫升水），盛于動(dòng)物自吸喂養(yǎng)瓶內(nèi)供小鼠自動(dòng)飲用，在沒有其它水源供應(yīng)的實(shí)驗(yàn)條件下，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物因生理需要而必須每天攝取足夠的飲水，因而也就保證了實(shí)驗(yàn)小鼠每天都能攝取到規(guī)定的藥物劑量。其中中藥2組到4月齡后改用人工灌服中藥溶液至期滿。

3　耳蝸毛細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

3.1耳蝸標(biāo)本制備與鋪片

將麻醉小鼠斷頭，然后在解剖顯微鏡下取出聽泡，在蝸尖鉆孔并摘除鐙骨同時(shí)打開園窗，將10％福爾馬林磷酸鹽緩沖液從蝸尖孔灌入耳蝸，然后浸入上述固定液固定24小時(shí)以上。將取出的顳骨浸入5％鹽酸溶液脫鈣48小時(shí)，在解剖顯微鏡下分離取出全耳蝸基底膜，用蘇木素染液常規(guī)對(duì)基底膜染色［3-5］。也可選擇在固定前向耳蝸內(nèi)灌入琥珀酸脫氫酶染色液，即由0.2M琥珀酸鈉、0.2M磷酸鹽緩沖液、0.1％氯化硝基四氮唑藍(lán)按1：1：2配制而成，在37℃恒溫箱內(nèi)作用40分鐘到60分鐘，然后將耳蝸浸入10％中性福爾馬林固定液固定24小時(shí)，常規(guī)脫鈣后分離取出全耳蝸基底膜［3-5］。這兩種常用染色方法并不存在造成細(xì)胞膨脹或者細(xì)胞縮小的問題，均可一致相同反映細(xì)胞的完整形態(tài)，或細(xì)胞損害，或消失，因此并不影響定位定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果，均可用于定量評(píng)估耳蝸毛細(xì)胞的損害情況分析。最后將全耳蝸基底膜移入載玻片上的甘油滴中，使基底膜的網(wǎng)狀膜面向上，蓋上蓋玻片，中性樹膠封固［3-5］。

3.2耳蝸圖和毛細(xì)胞的定位定量分析

從各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取出每只動(dòng)物的一側(cè)耳用于耳蝸鋪片和耳蝸圖制備。在光學(xué)顯微鏡下，分別對(duì)3月齡對(duì)照組，7月齡對(duì)照組和7月齡中藥1組及7月齡中藥2組觀察全耳蝸基底膜上毛細(xì)胞的缺損情況。在置有標(biāo)記單位長度為0.24mm的顯微測量尺目鏡的光學(xué)顯微鏡下，從蝸尖向蝸底逐個(gè)視野依次進(jìn)行內(nèi)、外毛細(xì)胞計(jì)數(shù)并將采集的數(shù)據(jù)輸入到計(jì)算機(jī)中，數(shù)據(jù)經(jīng)耳蝸圖軟件對(duì)C57小鼠耳蝸數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，耳蝸基底膜的實(shí)際全長被轉(zhuǎn)換為百分比長度單位，單位長度內(nèi)的毛細(xì)胞實(shí)際數(shù)量被轉(zhuǎn)換成細(xì)胞密度并按照百分比分布在耳蝸基底膜的各個(gè)部位，從而建立該耳蝸的曲線分析圖［3-5］。由于老年性耳蝸毛細(xì)胞缺損的范圍是從耳蝸底回開始發(fā)生并逐漸向耳蝸頂回?cái)U(kuò)展，因此未發(fā)生毛細(xì)胞缺損的耳蝸頂回范圍內(nèi)的毛細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果將不適合用于分析毛細(xì)胞缺損程度的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。為此，我們分別將距離耳蝸頂回40％-70％和80％-90％兩個(gè)區(qū)域的毛細(xì)胞密度值摘出，所有采集數(shù)據(jù)被輸入到GraphPad prism5軟件系統(tǒng)，應(yīng)用X2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和比較，P＜0.05被確定為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的顯著性差異。

3　結(jié)果

取自耳蝸基底部四組動(dòng)物耳蝸鋪片舉例對(duì)照如圖1A-D所示，3月齡對(duì)照組動(dòng)物的三排外毛細(xì)胞和一排內(nèi)毛細(xì)胞基本完好無損；7月齡對(duì)照組動(dòng)物的三排外毛細(xì)胞和內(nèi)毛細(xì)胞在同一部位卻幾乎損失殆盡；7月齡中藥1組與中藥2組動(dòng)物的三排外毛細(xì)胞損失范圍較小，兩組間幾乎不存在明顯差別。耳蝸圖結(jié)果顯示3月齡對(duì)照組小鼠除Hook區(qū)域即距離蝸尖95-100％的位置出現(xiàn)毛細(xì)胞缺損之外，其余部位基本無毛細(xì)胞缺損（圖2A）；7月齡對(duì)照組小鼠耳蝸從距離耳蝸頂回75-100％區(qū)間的外毛細(xì)胞全部缺損（圖2A），內(nèi)毛細(xì)胞的損失程度也越過50％區(qū)域（圖2B），說明正常C57BL/6J小鼠在出生后7個(gè)月，毛細(xì)胞的缺損已經(jīng)從耳蝸底回起始端蔓延到占基底膜全長50％的范圍，尤其在距離耳蝸頂回80％到100％區(qū)間，所有內(nèi)外毛細(xì)胞幾乎全部缺損，這個(gè)結(jié)果與早期的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果完全相符［6，7］。值得注意的是，無論是自然飲用中藥的7月齡中藥1組還是從出生后4個(gè)月改為每天灌喂中藥的7月齡中藥2組，耳蝸內(nèi)、外毛細(xì)胞的缺損程度都明顯比同齡對(duì)照組小鼠減輕，即使在距離耳蝸頂回75％的區(qū)間，存活外毛細(xì)胞的數(shù)量也超過60％（圖2A），而內(nèi)毛細(xì)胞的損失數(shù)量很少（圖2B）。從各組動(dòng)物的平均耳蝸圖截取點(diǎn)比較進(jìn)一步分析不難看出，7月齡對(duì)照組動(dòng)物的外毛細(xì)胞缺損已經(jīng)從耳蝸底回蔓延到距離耳蝸頂回40％的區(qū)間，其中在60％區(qū)間的外毛細(xì)胞缺損范圍達(dá)到40％，在80％區(qū)間則高達(dá)100％。然而，7月齡中藥1組動(dòng)物的外毛細(xì)胞損失雖然也蔓延到距離耳蝸頂回50％的區(qū)間，但在60％區(qū)間的外毛細(xì)胞缺損僅20％，在80％區(qū)間的外毛細(xì)胞缺損僅40％，而內(nèi)毛細(xì)胞在上述兩個(gè)區(qū)間卻未發(fā)生缺損；與此相同的是，7月齡中藥2組動(dòng)物在距離耳蝸頂回60％區(qū)間并未發(fā)生毛細(xì)胞缺損率，在距離頂回80％區(qū)間的外毛細(xì)胞缺損為40％，而此區(qū)間的內(nèi)毛細(xì)胞卻幾乎沒有缺損。上述耳蝸鋪片及耳蝸圖結(jié)果均表明，7月齡中藥1組或中藥2組的內(nèi)、外毛細(xì)胞缺損程度比7月齡對(duì)照組明顯減輕，內(nèi)、外毛細(xì)胞的缺損范圍也明顯比7月齡對(duì)照組縮小，說明無論是自然飲用中藥還是灌喂中藥，都能有效保護(hù)發(fā)生在C57BL/6J小鼠的老年性耳蝸損害。截取距離耳蝸頂回45％區(qū)間和75％區(qū)間的毛細(xì)胞損失經(jīng)X2檢驗(yàn)結(jié)果見表1，從統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表可以看出，7月齡中藥1組和7月齡中藥2組與7月齡對(duì)照組相比，無論是外毛細(xì)胞還是內(nèi)毛細(xì)胞的缺損程度，都具有極顯著差異（P＜0.01），說明無論是自然飲用還是灌喂中藥，復(fù)方健耳劑都能有效延遲老年性耳蝸毛細(xì)胞損害的發(fā)生和發(fā)展，兩種用藥方法無顯著性差異（P＞0.05）。

圖1　四組動(dòng)物耳蝸鋪片基底部對(duì)照：A 3月齡對(duì)照組三排外毛細(xì)胞和內(nèi)毛細(xì)胞損失極輕，甚至基本完好無損。B 7月齡對(duì)照組三排外毛細(xì)胞和部分內(nèi)毛細(xì)胞損失嚴(yán)重，甚至幾乎殆盡。C、D分別為7月齡中藥1組與中藥2組，均顯示三排外毛細(xì)胞和內(nèi)毛細(xì)胞損失范圍較小，兩組間幾乎沒有什么差別。Fig.1 Comparisons of cochlear surface preparations at basal turn from 4 groups of animals.Ais typical example of cochlear at basal turn at 3 months of age with drinking tap water，which displayed that three rows of outer hair cells and inner hair cells were almost intact or their damages were extremely slight.B is typical example of cochlear surface preparation at basal turn at 7 months of age with drinking tap water，which displayed that damages in three rows of outer hair cells and part inner hair cells were extremely serious or they almost disappear.C and D respectively are typical examples of cochlear surface preparation at basal turn of group 1 with voluntarily and automatically drinking TCM and group 2 with feeding TCM at 7 months of age，which displayed that three rows of outer hair cells and inner hair cells were less damage，and there was no significant difference in comparison betweenthe group 1of TCMandthe group2of TCM.

圖2　A，B分別為3月齡對(duì)照組、7月齡對(duì)照組、7月齡中藥1組、7月齡中藥2組外毛細(xì)胞和內(nèi)毛細(xì)胞缺損的平均耳蝸圖。綜合耳蝸圖表明，耳蝸外、內(nèi)毛細(xì)胞損失開始出現(xiàn)在底回區(qū)域，并隨著年齡增長，由底回向頂回發(fā)展。3月齡對(duì)照組毛細(xì)胞損害僅出現(xiàn)在耳蝸基底回鉤端處；7月齡對(duì)照組毛細(xì)胞損失則已延伸至整個(gè)耳蝸底回，甚至抵達(dá)耳蝸中部；7月齡中藥1組和中藥2組毛細(xì)胞損失較7月齡對(duì)照組明顯為輕。Fig.2 A and B respectively represent the averaged cochleograms of cochlear outer hair cells and inner hair cells losses from C57BL/6J mice at 3 months of age group and 7 months of age group with drinking tap water group，group 1 with voluntarily and automatically drinking TCM and group 2 with feeding TCM at 7 months of age.They showed that cochlear outer hair cells and inner hair cells losses began from cochlear basal turn and progressed toward apical turn along with the age.Losses of hair cells at 3 months of age controlling group were only in hook region at cochlear basal turn.Losses of hair cells at 7 months of age controlling group had been extended to the whole cochlear basal turn and even reached middle region，however，losses of hair cells at group 1 of TCM or group 2 of TCM at 7 months of age was less by comparison with 7 months of age controlling group.

3　討論

AHL是聽覺器官衰老退變的過程，病因病機(jī)錯(cuò)綜復(fù)雜，目前主要有活性氧代謝物（reactiv oxygen species，ROS）和線粒體DNA（mtDNA）學(xué)說；內(nèi)耳循環(huán)和代謝障礙學(xué)說；基因遺傳和突變學(xué)說；環(huán)境噪聲或藥物危害學(xué)說等，其中認(rèn)為AHL與線粒體能量代謝和ROS損害的關(guān)系最為密切［8，9］。細(xì)胞內(nèi)90％以上的能量由線粒體提供，能量代謝的主要副產(chǎn)物是ROS，100多種疾病的病理狀況（包括衰老）與ROS有關(guān)。ROS活性極高，可導(dǎo)致廣泛的DNA、細(xì)胞和組織損傷。體內(nèi)的ROS主要來自氧化磷酸化期間的線粒體電子轉(zhuǎn)運(yùn)體系，在老年時(shí)期，耳內(nèi)部循環(huán)系統(tǒng)血流降低，時(shí)程延長，血流灌注不足，耳蝸血供明顯減少，耳蝸能量將通過氧化磷酸化產(chǎn)生，從而導(dǎo)致耳蝸內(nèi)ROS大量形成。與細(xì)胞核DNA相比，mtDNA沒有組蛋白的保護(hù)和僅具有有限的自我修復(fù)能力，因此mtDNA極易受到ROS的破壞或某些藥物副反應(yīng)損傷。隨著年齡增長等因素又使mtDNA的損傷累積，當(dāng)大量的mtDNA受到損傷時(shí)，線粒體功能受到影響，導(dǎo)致細(xì)胞缺乏生物能量，這種機(jī)制是衰老的線粒體鐘理論的基礎(chǔ)，也稱為衰老的膜假說。已發(fā)現(xiàn)AHL與mtDNA損傷有關(guān)，也支持線粒體疾病在漸進(jìn)性聽力喪失中起一定作用，AHL病人mtDNA內(nèi)部發(fā)生突變或特異性缺失，這是由于其長期暴露于ROS的結(jié)果。另外若mtDNA突變，則導(dǎo)致線粒體能量代謝喪失，最終整個(gè)細(xì)胞受到損害，所以聽覺系統(tǒng)的ROS損傷，mtDNA突變被普遍認(rèn)為是AHL的重要原因［10，11］。

AHL屬中醫(yī)“漸聾”、“久聾”等范疇。傳統(tǒng)中醫(yī)有腎主耳，腎開竅于耳，“老人之耳，多見聰不內(nèi)居，而聲聞?dòng)谕?，此正腎元不固，陽氣渙散之征耳”（《景岳全書·卷二十七·耳證》）；耳屬清竅，脾主升清降濁，清陽出上竅，“脾為孤臟，……其不及則令九竅不通”（《素問·玉機(jī)真藏論》）；“十二經(jīng)脈，三百六十五絡(luò)，其血?dú)饨陨嫌诿娑呖崭[，······其別氣走于耳而為聽”（《靈樞·邪氣臟腑病形篇》）等觀點(diǎn)，因此，筆者認(rèn)為AHL的中醫(yī)發(fā)病機(jī)制應(yīng)與腎、脾、血脈密切相關(guān)。復(fù)方健耳劑以中醫(yī)脾腎瘀立論，選擇具有補(bǔ)腎健脾、活血通竅作用的中草藥組成，現(xiàn)代中藥藥理研究表明［12］，其所選藥物如骨碎補(bǔ)具有降血脂、抗血栓、強(qiáng)心、改善微循環(huán)、以及缺血乏氧腦病有較好的保護(hù)等作用。黃芪可提高紅細(xì)胞膜Na+，K+-ATP酶活性，可使紅細(xì)胞超氧化物歧化酶（SOD）活性顯著升高，促進(jìn)抗氧化作用，延長組織細(xì)胞壽命，促進(jìn)核酸蛋白質(zhì)代謝；提高血漿cAMP含量，抑制血小板功能，擴(kuò)張外周血管，改善微循環(huán)，強(qiáng)心和抗心肌缺血，提高組織細(xì)胞耐缺氧能力等。丹參能顯著提高血漿及體內(nèi)器官cAMP含量，抑制血小板聚集和血脂升高，擴(kuò)張外周血管，改善微循環(huán)，提高組織細(xì)胞耐缺氧能力。葛根則具有顯著改善腦微循環(huán)障礙、抗氧化與清除自由基、抗缺氧、抗凝血、和解痙等廣泛藥理作用。效應(yīng)很可能與其改善內(nèi)耳微循環(huán)、保護(hù)線粒體、補(bǔ)充能量代謝、抗氧化與清除活性氧自由基等多種作用有關(guān)。

表1　外、內(nèi)毛細(xì)胞損失各區(qū)域占比統(tǒng)計(jì)學(xué)χ2檢驗(yàn)結(jié)果Table 1 Statistical χ2test results from regional proportion of outer hair cells and inner hair cells losses

C57BL/6J小鼠是研究人類AHL的理想動(dòng)物之一，其耳蝸毛細(xì)胞在成年期即出現(xiàn)退變，隨年齡增長，毛細(xì)胞退變從耳蝸基底回不斷向蝸頂擴(kuò)展，到26月齡時(shí)，幾乎整個(gè)耳蝸的外毛細(xì)胞和大部分的內(nèi)毛細(xì)胞喪失［13-15］。另據(jù)國內(nèi)報(bào)道［16］，通過聽性腦干反應(yīng)檢測、HE染色等方法，比較2月齡與10月齡兩組C57BL/6J小鼠聽力和初級(jí)聽皮層神經(jīng)元凋亡變化，再次證實(shí)了C57BL/6J小鼠年齡相關(guān)的聽力損失與初級(jí)聽皮層神經(jīng)元凋亡密切相關(guān)。最近研究表明［17-19］，若敲除C57BL/6J小鼠線粒體促凋亡基因Bak，可減少與年齡相關(guān)的耳蝸毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元凋亡，從而減低AHL的發(fā)生，而提高過氧化氫酶活性，或口服抗氧化劑α-硫辛酸和輔酶Q均可抑制耳蝸Bak基因的表達(dá)。研究還發(fā)現(xiàn)小鼠AHL與Cdh23基因突變有著密切關(guān)系，其中C57BL/6J小鼠Cdh23和SOD1雙基因突變或缺失所引起聽功能下降和毛細(xì)胞損害最為嚴(yán)重。因此認(rèn)為，促凋亡基因Bak系通過氧化應(yīng)激反應(yīng)被活化，從而介導(dǎo)耳蝸神經(jīng)細(xì)胞凋亡，或Cdh23和SOD1突變或缺失，ROS積累，導(dǎo)致耳蝸神經(jīng)細(xì)胞損害是C57BL/6J小鼠AHL發(fā)生的關(guān)鍵分子機(jī)制之一。10年前的研究曾表明［6，7］，國產(chǎn)代傳C57BL/6J小鼠7月齡在耳蝸基底回即出現(xiàn)毛細(xì)胞損害現(xiàn)象，越往鉤端越重，呈現(xiàn)出向頂回不斷蔓延趨勢，與以往發(fā)表的大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道相一致。先前在實(shí)驗(yàn)中還曾發(fā)現(xiàn)，早期臨床治聾其中兩個(gè)驗(yàn)方均具有不同程度延緩C57BL/6J小鼠隨著年齡增長而發(fā)生的耳蝸毛細(xì)胞損害的作用。本次研究進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)論，同時(shí)還表明臨床優(yōu)化新配方復(fù)方健耳劑具有顯著對(duì)抗C57BL/6J小鼠老年性耳蝸毛細(xì)胞退變作用。前述該主要藥物藥理研究發(fā)現(xiàn)其具有改善微循環(huán)，提高SOD活性，促進(jìn)抗氧化與清除自由基作用，符合針對(duì)C57BL/6JAHL有關(guān)發(fā)病機(jī)制的藥效解釋。過去通過動(dòng)物初步實(shí)驗(yàn)［20］，本研究發(fā)現(xiàn)復(fù)方健耳劑原始配方，可以提高小鼠耳蝸組織腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）的表達(dá)。最新在通過對(duì)過氧化氫（H2O2）在體外誘導(dǎo)成年大鼠脊髓神經(jīng)氧化應(yīng)激反應(yīng)性損害模型研究中發(fā)現(xiàn)，24小時(shí)氧化應(yīng)激導(dǎo)致脊髓神經(jīng)細(xì)胞存活率明顯降低，而經(jīng)過BDNF預(yù)處理的48小時(shí)脊髓神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)活性氧受到明顯抑制，其生存率也明顯提高，這種生存效應(yīng)與凋亡細(xì)胞數(shù)量的顯著減少，與BDNF誘導(dǎo)抗氧化酶谷胱甘肽還原酶和超氧化物歧化酶活性顯著增加密切相關(guān)［21］。因此認(rèn)為，該復(fù)方中藥有可能通過減少耳蝸ROS和對(duì)抗相關(guān)基因突變，成為其有效防治耳蝸毛細(xì)胞損害的關(guān)鍵機(jī)制之一?？紤]到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每日飲水量的差別可能影響動(dòng)物攝取復(fù)方健耳劑的劑量，為了確保實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按照1.83g/kg/d的劑量服用復(fù)方健耳劑，本研究對(duì)7月齡中藥2組動(dòng)物從出生后第4個(gè)月開始灌喂中藥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論是自然飲藥還是強(qiáng)行灌喂，復(fù)方健耳劑都能有效減輕C57BL/6J小鼠老年性耳蝸毛細(xì)胞損害，而且這兩種用藥方法的防治作用并無統(tǒng)計(jì)學(xué)上差別。這些研究不但為最近發(fā)現(xiàn)的復(fù)方健耳劑有效保護(hù)C57BL/6J小鼠的聽覺功能提供了內(nèi)耳病理學(xué)證據(jù)，同時(shí)還為今后相關(guān)研究采用較為方便的自然飲藥方法提供了可行性的依據(jù)。

該文內(nèi)容僅限于復(fù)方健耳劑對(duì)耳蝸毛細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)和毛細(xì)胞病理學(xué)研究報(bào)道，其它一系列有關(guān)聽覺生理學(xué)的研究、周邊螺旋神經(jīng)節(jié)的病理學(xué)研究以及分子生物學(xué)研究報(bào)道將陸續(xù)發(fā)表在其它相關(guān)雜志，復(fù)方健耳劑的保護(hù)性作用機(jī)制也將有待更深入的研究和確認(rèn)。

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Protective effects of the Compound Healthy Ear Agent against presbycusis in C57BL/6J mice

XUAN Weijun1，2，DING Dalian1，2，3，JIANG Haiyan3，YANG Kun3，WEI Yulong4，CHEN Zhuang4，TANG Junbo1
1.Department of otorhinolaryngology head and neck surgery，the first clinical medical college of Guangxi university of Chinese medicine
2.Department of otorhinolaryngology head and neck surgery，the ruikang clinical medical college of Guangxi university of Chinese medicine
3.Center for Hearing Deafness，the State University of New York at Buffalo，USA
4.Pharmaceutical factory，the ruikang clinical medical college of Guangxi university of Chinese medicine
Corresponding author:XUAN WeijunEmail:xuan5352100@sina.com

【Abstract】Objective To investigate the efficacy of the Compound Healthy Ear Agent（CHEA），a traditional Chinese medicine compound product，on age-related cochlear hair cell damage by two different administration methods.Methods Twenty two 1 month old C57BL/6J mice were divided into 4 groups to drink tap water until 3 months of age （young control group，n=4），drink tap water until 7 months of age（presbycusis control group，n=6），voluntarily drink CHEA until 7 months of age（n=6），or voluntarily drink CHEA until 4 months of age，followed by CHEA feeing until 7 months of age（n=6）.At the end of the experiment，the cochlear basilar membrane was micro-dissected out，trimmed and mounted in glycerin on glass slides as flat surface preparations.The number of cochlear hair cells along the entire length of cochlea was counted for cochleograms.The hair cells density at two different locations of interval lesions was statistically analyzed and compared among the four groups.Results Cochlear hair cells in the young control group showed missing cells only at the end of the basal turn.Hair cell missing in the presbycusis control group extended fromthe basal turn to about 40％from the apex.In both CHEA treated groups，the extent and degree of missing hair cells were less compared to the presbycusis control group（P＜0.001）.Conclusion The traditional Chinese medicine compound product CHEA appears to mitigate the development age-related cochlear hair cells damage，with similar results for both administration methods tested in this study.The mechanisms may involve improving microcirculation，eliminating reactive oxygen species and protecting mitochondria.

【Keywords】C57BL/6J mice，presbycusis，hair cells，traditional Chinese medicine

【中圖分類號(hào)】R764.436

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1672-2922（2016）02-272-6

DOI:10.3969/j.issn.1672-2922.2016.02.029

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（地區(qū)項(xiàng)目81260552，面上項(xiàng)目81373700）和廣西自然科學(xué)基金（2014GXNSFAA118162）

作者簡介：宣偉軍，醫(yī)學(xué)博士，教授，研究方向：耳鼻咽喉科學(xué)，光動(dòng)力頭頸外科學(xué)

通訊作者：宣偉軍，Email:xuan5352100@sina.com

收稿日期：（2015-10-09審核人：郭維維）