劉丁丁劉永澤麻曉峰陸玲周函錢曉云高下南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（南京210008）

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慶大霉素導致耳毒性中毒的自噬現象

劉丁丁劉永澤麻曉峰陸玲周函錢曉云高下
南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（南京210008）

【摘要】目的慶大霉素是一種臨床上常用的氨基糖苷類抗生素，隨著其使用劑量和作用時間的增加，它的耳毒性逐漸明顯。本實驗在體外用新生C57BL/6J小鼠的耳蝸基底膜構建慶大霉素耳毒性模型觀察自噬的發(fā)生。方法體外原代培養(yǎng)的耳蝸基底膜應用慶大霉素之后，行透射電鏡觀察自噬體的結構，免疫熒光、免疫印跡檢測自噬相關蛋白LC3-II的變化。結果在慶大霉素的耳毒性模型中，觀察到了自噬現象的發(fā)生。結論自噬參與了慶大霉素的耳毒性過程，提示我們干預自噬可以影響慶大霉素的耳毒性過程。

【關鍵詞】毛細胞；慶大霉素；耳毒性；自噬

劉丁丁和劉永澤并列第一作者

This work was supported by the Nanjing Science and technology development Foundation（201303003）and Nanjing Medical Science and technique Development Foundation（QRX11079）of China.

Conflict of interests:The authors declare no conflict of interests.

全世界流行最廣的感覺器官殘疾是聽力損失。依據2014年世界衛(wèi)生組織報告：全世界有3.6億人有殘疾性聽力損失，占全球人口的5％，其中80％殘疾人群生活在中低收入國家。聽力殘疾居于我國殘疾人口數量的第二位，近年來隨著耳毒性藥物使用增加，聽力損失的人群數量急劇增長。聽力損失最影響與他人溝通的能力，會導致一系列問題。顯而易見，聽力損失已成為影響社會政治和經濟的全球性的健康問題。目前認為哺乳動物耳蝸毛細胞及螺旋神經元不能自發(fā)再生，一旦受到損傷將會導致永久性耳聾。

對于肺結核的治療以及由需氧革蘭陰性菌產生的其他疾病，氨基糖苷類抗生素有強大的功效（Fujimoto，Mizuno et al.）。然而，隨著氨基糖苷類抗生素使用療程的延長和（或）劑量的增加往往導致嚴重腎毒性和耳毒性的發(fā)生，其中耳毒性往往是不可逆轉的，特別是對于那些遺傳易感性的患者［6-7］。由于其價格低廉、低耐藥、低過敏，目前仍然在許多發(fā)展中國家使用。慶大霉素是一種常用的氨基糖苷類抗生素，因其耳毒性備受關注，被吸收后在內耳淋巴液內蓄積［8-10］。內耳中的毛細胞對其有高度親和力，吸收后會導致毛細胞的死亡。研究已證明在慶大霉素的耳中毒過程中毛細胞的死亡屬于凋亡［11］，凋亡與自噬聯系密切［12］，而自噬是否參與毛細胞的死亡過程尚未可知。

上個世紀60年代即在哺乳動物細胞中發(fā)現細胞自噬現象［13］，但是涉及到自噬的的細胞成分及機制則是在酵母中得到了驗證［14］?，F在哺乳動物的同源基因也被發(fā)現并在哺乳動物細胞自噬中發(fā)揮了重要作用［15-16］。諸如：LC3，Atg8的哺乳動物同源體，通過與腦磷脂結合形成LC3-II，而其位于自噬體膜上，它的表達水平反映自噬水平的高低［17］。自噬是通過一系列復雜的過程，將一個組件或外來入侵者自我消化的過程；是維持細胞穩(wěn)態(tài)和抵抗逆境的重要機制；是亞細胞膜構造產生動態(tài)變化并經溶酶體介導對細胞內蛋白質和細胞器降解的過程［14-15，18］。自噬的形成分為四個過程，即自噬前體的形成、自噬體的形成、自噬體與溶酶體相結合、消融的一個過程［19］。自噬作為一種細胞對外界刺激的反應［14-15］。盡管近年來自噬研究飛速發(fā)展，但在慶大霉素的耳毒性過程中研究甚少。

體外培養(yǎng)的耳蝸中加入慶大霉素可以導致耳蝸毛細胞的損傷，自噬現象是否出現在該種模型中，到目前為止仍然無相關報道。我們本次的研究利用慶大霉素的耳毒性模型證明了該造模過程中自噬的發(fā)生。

1　材料和方法

1.1實驗材料

出生四天的C57BL/6J的小鼠由南京大學模式動物研究所提供。Millicell購自Millipore公司（PIHT30R48），層粘連蛋白購自BD公司，多聚鳥氨酸、phalloidin均購自Sigma公司，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚購自碧云天，DMEM購自生興。兔抗LC3抗體（Sigma Aldrich L7543），Western blot中使用的蛋白裂解緩沖液（RIPA裂解液）購于南通碧云天生物有限公，GAPDH等抗體購于美國Cell Signaling公司；二抗anti-rabbit IgG購于美國Jackson公司。

1.2實驗方法

1.2.1耳蝸取材及培養(yǎng)

組織包被液的制作參照之前文獻［20］。P4小鼠冰上麻醉后，用75％酒精噴灑C57小鼠頭頸部后再移入超凈臺內斷頭暴露顱底，在顯微鏡下用細鑷在內耳道處分離暴露整個耳蝸底回并取出耳蝸，在平衡培養(yǎng)液中用鑷子打開整個耳蝸，充分暴露膜迷路，去除骨性蝸軸、螺旋韌帶、血管紋和蓋膜等其他結構，分離出全耳蝸基底膜Corti'S器進行體外培養(yǎng)。吸棄預孵濾膜的混合液，加入適量培養(yǎng)液，用1ml的加樣槍把耳蝸轉移至濾膜表面，區(qū)分正反，在濾膜表面鋪放平整，再次吸棄培液，使組織貼壁牢固，之后緩慢加入培養(yǎng)液，以覆蓋濾膜和基底膜為宜。在37℃和5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h以使基底膜貼壁牢固。24h之后更換組織培養(yǎng)液，耳蝸組織被隨機分為兩組，空白對照組即正常培養(yǎng)液組，慶大霉素組即培養(yǎng)液中加入了100μm/L的慶大霉素。分為兩組后再繼續(xù)培養(yǎng)24h后收樣進行后續(xù)實驗。

1.2.2免疫熒光

藥物作用24h之后帶有樣本的濾膜經4％福爾馬林磷酸鹽緩沖液在4℃固定2h，用0.1mol/L的PBST漂洗，之后0.1％Triton破膜20分鐘，5％BSA封閉30分鐘，放入用0.1mol/L PBST（含5％的BSA）稀釋（1:200）的LC3抗體，于4℃冰箱孵育過夜。第二天，0.1mol/L的PBST漂洗后加入用0.1mol/L PBST稀釋（1:500）的相應的二抗及DAPI（1:2500）和phalloidin（1:500），室溫避光2h，漂洗后將帶有樣本的濾膜用抗熒光淬滅封片劑進行封片。激光共聚焦顯微鏡拍照。

1.2.3透射電鏡觀察

培養(yǎng)48h之后帶有樣本的濾膜經2.5％戊二醛磷酸鹽緩沖液在4℃固定過夜（前固定），1％四氧化鋨于4℃固定2小時（后固定），用1×PBS漂洗3次后梯度脫水：30％丙酮、50％丙酮、70％丙酮、80％丙酮、90％丙酮、100％丙酮各脫水一次，之后浸透、固化，樣品在Reichert超薄切片機中切片，獲得50-60nm的切片。檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50％乙醇飽和溶液各染色15min。Hitachi-7650透射電鏡觀察，拍片。

1.2.4耳蝸組織的Western blot

耳蝸組織被隨機分為兩組，對照組即正常培養(yǎng)液組，慶大霉素組即培養(yǎng)液中加入了100μm/L的慶大霉素，兩組耳蝸經不同處理后在相同的時間點收取樣本。每組取20個耳蝸，在0.1mol/L的PBS中蕩洗除去培養(yǎng)液，收集在無酶1.5mlEP管中加入100μL的Lysis Buffer并補充1％的蛋白酶抑制劑PMSF。提取用蛋白定量分析試劑盒測定蛋白含量，按比例加入Loading Buffer后沸水浴10min，保存在-70℃。配置15％的分離膠及5％的濃縮膠，之后電泳、轉膜及顯影。

2　結果

2.1免疫熒光及細胞計數

耳蝸經過不同處理培養(yǎng)之后，毛細胞數量會發(fā)生變化，毛細胞數量也間接反映了耳毒性的大小。用FITC-phalloidin標記的毛細胞纖毛（綠色）染色和DAPI（藍色）染核及自噬標記抗體LC3（紅色）的免疫熒光實驗（圖1A）。空白對照組內外毛細胞沒有明顯的損失。慶大霉素組毛細胞破壞嚴重，排列紊亂。同時，我們每組取6個耳蝸根據FITC-phalloidin標記的毛細胞纖毛對毛細胞數量進行了統(tǒng)計，結果如下（圖1B）。

圖1　利用免疫熒光和毛細胞定量分析系統(tǒng)對耳蝸毛細胞的統(tǒng)計，A:FITC-phalloidin和DAPI及LC3對耳蝸組織的染色結果。Apical:頂轉Middle：中轉Basal：底轉。B:根據FITC-phalloidin染色結果應用毛細胞定量分析軟件對細胞數目所做的計數圖。每組的耳蝸數均為6個，毛細胞計數即為6個耳蝸分別計數輸入軟件得到的平均值。bar=10μm。Fig.1 Immunofluorescence and quantitative analysis of hair cells in differet treated groups.（A）Explant culture treated with GM and control（no drug）stained with FITC-phalloidin，DAPI and anti-LC3 labeled protein showed the difference in loss of hair cells in apical，middle and basal region，respectively.（B）Average cytocochleograms represents the percentage of inner hair cell（IHC）and outer hair cell（OHC）loss as a function of percent total distance from the apex of the cochlea.6 specimens were assessed for each condition.

2.2透射電鏡觀察慶大霉素作用后的自噬體結構

透射電鏡的分辨率為0.1～0.2nm，能夠放大倍數為幾萬～幾十萬倍，是材料研究中的重要技術手段，能觀察到細胞內細微結構。取材基底膜制成超薄切片，利用透射電鏡觀察毛細胞的超微結構。電鏡結果顯示應用慶大霉素后耳蝸組織出現大量的自噬體。

圖2　透射電鏡觀察對照組及慶大霉素組自噬體結構，對照組沒有觀察到明顯的自噬體結構，細胞核和表面的纖毛結構清晰、完整。慶大霉素組組毛細胞破壞嚴重，觀察到大量的自噬體結構，圖中方框中箭頭指向自噬體。bar=2μm。Fig.2 Autophagy structure within the hair cells observed under transmission electron microscope.Cochlea in each group showed under TEM for autophagy.Structure of cell membrane looks intact，stereocillia arranged in order，and the organelles seemed normal in control group.After GM treatment，the large amount of autophagosomes（red marked）appeared inside the sensory epithelium and cell membrane becomes ruptured，In the box，the arrow points to the autophagosome.bar=2μm.

2.3Western blot檢測LC3蛋白的表達

通過Western blot（圖3）分析LC3蛋白的表達。每組收集20個耳蝸作為一組檢測了對照組和慶大霉素組LC3蛋白的表達量，發(fā)現慶大霉素組LC3的蛋白量表達明顯增加。Western blot檢測LC3有兩條帶，LC3-I和LC3-II，而LC3-II結合在自噬體膜上，反映自噬水平。

圖3　每組收集20個耳蝸作為一組，用組織蛋白裂解液提取耳蝸蛋白進行Western blot檢測LC3的表達，GAPDH作為內參，慶大霉素組的LC3-II的表達量明顯增加。Fig.3 The expression of LC3 protein.Western blotting analysis displayed LC3-II formation after GM treatment.Cochleae were incubated with GM for 24h to collect whole cell lysates for immunoblot analysis of LC3.GAPDH was used as a protein loading control.20 specimens were assessed for Western blotting.Abbreviations:

3　討論

對于慶大霉素損害的聽覺機理研究已有很多，研究結果主要涉及毛細胞纖毛和外毛細胞本身的損害從而導致聽力的下降［21］。慶大霉素是一種廣泛使用的氨基糖苷類抗生素，因其耳毒性而備受關注，氨基糖苷類藥物攝取后在內耳淋巴液內蓄積累加，與耳蝸毛細胞親和力較強，引起的耳蝸毛細胞損害總是從耳蝸底回的外毛細胞開始逐漸向頂回發(fā)展，外毛細胞損壞也總是早于內毛細胞。毛細胞死亡有壞死和凋亡兩種方式。細胞壞死是某種機械原因或者代謝原因促使細胞內發(fā)生一系列降解反應，是細胞的一種被動破壞過程。凋亡也稱為“程序性細胞死亡”，是由基因介導的一系列變化，細胞依靠它來主動的引起自身的破壞。有研究證明，由氨基糖苷類抗生素的代表——慶大霉素引起的急性耳中毒過程中，毛細胞死亡100％屬于“自殺”，即屬于細胞凋亡［11］。

阻止慶大霉素的耳毒性的一個重要目標是保護毛細胞，眾所周知，凋亡是毛細胞的主要死亡方式［11］。因此，許多藥物被用來評估由慶大霉素導致的耳毒性中毛細胞的保護作用并且證實能夠減輕凋亡［22-24］，這些化合物包括鐵鰲合劑［25］和抗氧化劑［26］。而凋亡與自噬的關系又非常密切［12］。到目前為止，對于氨基糖苷類抗生素引起的耳聾的發(fā)病機制仍然不是十分清楚，也無有效治療方法。鑒于此，本研究考慮建立該疾病的離體模型，并通過該模型證明自噬在耳毒性過程中的發(fā)生。近期Jing Cui等在豬中報道了自噬激活劑雷帕霉素通過增強自噬可以改善慶大霉素導致的腎臟毒性［27］。而慶大霉素的耳毒性與自噬的關系目前無任何文獻報道，因此這是今后研究的重點。

自噬與凋亡之間的關系雖有爭議，但一般都是受一些共同調節(jié)因素的影響，兩者之間存在相互作用，以及對細胞的生存起著重要的作用。目前自噬和凋亡的關系大致有以下三種關系［28］：自噬和凋亡都可引發(fā)細胞的死亡（圖a），這類觀點包括：自噬和凋亡無相互的作用，各自引發(fā)細胞的死亡；自噬處在凋亡的上游，在誘發(fā)凋亡的同時也引發(fā)細胞的死亡；凋亡也可抑制自噬發(fā)生，當抑制凋亡時，才能誘發(fā)自噬導致細胞死亡。自噬還可以抑制凋亡通路：自噬通過降解受損蛋白、降低DNA的損傷途徑減少細胞凋亡（圖b）。自噬促進細胞凋亡：細胞自噬本身不引起細胞的死亡，但它能夠為凋亡小體形成提供能量，促進細胞凋亡發(fā)生（圖c）。自噬和凋亡的關系可以用下圖概括說明（引自文獻28）。

自噬研究已有幾十年，超過30個自噬相關基因已被發(fā)現，自噬研究也越來越透徹。有趣的是，自噬可以導致細胞存活也可以導致細胞死亡，盡管很大程度上不知道什么決定了它的最終結果［29-30］。雖然自噬研究飛速發(fā)展，但很少研究耳蝸組織中的自噬以及它的調控和病理生理作用。

本實驗主要是在體外培養(yǎng)的耳蝸組織中進行，在培養(yǎng)過程中加入慶大霉素可以導致毛細胞損傷死亡，這種模型已被諸多實驗所證明。研究運用多種技術證明在這種模型中自噬的發(fā)生，包括透射電鏡技術分析自噬體結構、免疫熒光及免疫印跡技術分析自噬標記蛋白LC3-Ⅱ的表達。對比這些組織培養(yǎng)技術，體內實驗自噬相關標記的檢測由于耳蝸的特殊性而被限制。在體外培養(yǎng)的耳蝸中，證明了加入慶大霉素之后能夠破壞毛細胞并且透射電鏡及免疫印跡均證明了自噬的存在。

結合研究的結果，推測自噬很有可能參與了氨基糖苷類抗生素的耳毒性過程。提示研究者干預自噬有可能成為治療耳聾新的靶點。這將是關于毛細胞凋亡機制一個新的發(fā)現。因此，后續(xù)重點研究自噬的分子機制及信號通路，將能更好地了解如何操縱這一信號通路滿足治療目的。這仍是一個年輕的研究領域，還有許多未知事物，這項工作才剛剛開始，最后，用藥物調控這些信號通路有可能為對抗疾病指出了一些可能的治療策略。本研究的完成，將證明自噬在氨基糖苷類抗生素耳毒性過程中的發(fā)生，將為認識氨基糖苷類抗生素的耳毒性打開新的篇章，同時為臨床上相應的治療提供新的思路。

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The Phenomenon of Autophagy in Gentamicin Induced Ototoxicity

LIU Dingding，LIU Yongze，MA Xiaofeng，LU Ling，ZHOU Han，QIAN Xiaoyun，GAO Xia
Department of Otolaryngology，Drum Tower Hospital，Medical School of Nanjing University，Nanjing，210008
Corresponding author:GAO Xia，E-mail:xiagaogao@hotmail.com

【Abstract】Objective Gentamicin is a frequently used aminoglycoside antibiotic.With increasing dose and duration，its ototoxicity side effects will gradually appear.The current study aims to study the phenomenon of autophagy in gentamicin induced ototoxicity.Methods The cochlea was cultured with gentamicin exposure.Transmission electron microscopy，immunofluorescence and Western blotting were used to observe the expression of autophagy protein LC3 in the explant culture treated with the gentamicin.Results In vitro administration of gentamicin in mouse cochlear cultures induced the formation of autophagic vesicles and autophagosomes in hair cells.Conclusion Our results demonstrate that autophagy participates in the process of ototoxicity induced by gentamicin and suggest that intervention aimed at autophagy may influence the ototoxicity process.

【Key words】Hair cells；Gentamicin；Ototoxicity；Autophagy

【中圖分類號】R764

【文獻標識碼】A

【文章編號】1672-2922（2016）02-260-5

DOI:10.3969/j.issn.1672-2922.2016.02.027

基金項目：南京市科技計劃項目（編號：201303003）南京市醫(yī)學科技發(fā)展資金資助（編號：QRX11079）

作者簡介：劉丁丁，碩士在讀，研究方向:耳內科基礎

通訊作者：高下，Email:xiagaogao@hotmail.com

收稿日期：（2015-11-04審核人：郭維維）