田克勇宋勇莉?qū)O菲王人鳳岳波王敏邱建華第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科（西安710032）

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·基礎(chǔ)研究·

熱休克蛋白60在藥物性聾大鼠模型中的表達(dá)變化

田克勇宋勇莉?qū)O菲王人鳳岳波王敏邱建華
第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科（西安710032）

【摘要】目的探討HSP60在大鼠耳蝸中的表達(dá)及硫酸卡那霉素?fù)p傷后的表達(dá)變化。方法正常成年雌性SD大鼠20只隨機(jī)分為兩組：對照組（生理鹽水）和實驗組（硫酸卡納霉素），按500mg/kg劑量每天給藥一次，連續(xù)腹腔注射21天。ABR檢測聽力變化；實時定量PCR和Western Blot分別檢測HSP60的mRNA和蛋白表達(dá)量的變化；免疫熒光染色觀察HSP60在耳蝸中的表達(dá)變化及分布。結(jié)果ABR檢測顯示實驗組較對照組明顯升高（P＜0.05）。實時定量PCR、Western Blot和基底膜鋪片免疫熒光染色的結(jié)果顯示實驗組HSP60表達(dá)量降低（P＜0.05）。冰凍切片免疫熒光染色，觀察到HSP60表達(dá)于Corti器上的支持細(xì)胞內(nèi)。結(jié)論HSP60表達(dá)于支持細(xì)胞，正常生理情況下即表達(dá)，慢性藥物中毒性耳聾模型中表達(dá)量降低，推測HSP60可能參與了藥物性耳聾的發(fā)生過程。

【關(guān)鍵詞】熱休克蛋白60，聽力損失，支持細(xì)胞

TIAN Keyong，SONG Yongli，SUN Fei，WANG Renfeng，YUE Bo，WANG Min，CHEN Fuquan，QIU Jianhua

Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery，Xijing Hospital，F(xiàn)orth Military Medical University，Xi'an，Shannxi 710032，China

Acknowledgements T This study was supported by the National Natural Science Foundation of China（grant no.81120108008）and the grant from the Major State Basic Research Development Program of China（973 Project；grant no.2011CB504505）.

Conflict of interest The authors declare no conflicts of interest.

熱休克蛋白是在真核和原核生物中都廣泛表達(dá)的應(yīng)激蛋白，進(jìn)化中高度保守，有一個共同的特性就是提高細(xì)胞的應(yīng)激能力，對細(xì)胞起到保護(hù)作用。按分子量的大小分為不同的家族，分別為HSP100，HSP90，HSP70，HSP60以及小分子熱休克蛋白。熱休克蛋白60（Heat Shock Protein 60，HSP60）在正常生理條件下，作為分子伴侶幫助蛋白的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和降解［1］；在創(chuàng)傷、病原體感染、缺血、炎癥等病理條件下誘導(dǎo)表達(dá)，表現(xiàn)為獨(dú)特的抗凋亡和促凋亡的雙向作用［2-3］。目前已有研究表明HSP60在腫瘤、動脈粥樣硬化、自身免疫病、神經(jīng)退行性病變等方面發(fā)揮著重要的作用，而在內(nèi)耳中的作用有待研究。

感音神經(jīng)性聾是耳科常見病、多發(fā)病，如何預(yù)防聽力損失、保護(hù)聽力成為我們研究的重要課題。藥物、噪聲、老齡等是引起感音神經(jīng)性聾的重要原因，氨基糖苷類抗生素造成的聽力損傷是常用的藥物誘導(dǎo)性耳聾模型［4］。本實驗初步研究了HSP60在大鼠耳蝸中的表達(dá)分布，硫酸卡納霉素（Kanamycin Monosulfate，KM）造成大鼠聽力損失后HSP60的表達(dá)變化。

1　材料與方法

1.1實驗動物及分組

選用雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠20只，體重100-150g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心供應(yīng)。實驗前聽性腦干反應(yīng)（Auditory brainstem response，ABR）測試，反應(yīng)閾篩查正常后隨機(jī)分組為：實驗組（KM 500mg/kg）和正常對照組（按體重給予相應(yīng)劑量生理鹽水），每組10只動物。

1.2實驗試劑和儀器

主要試劑有硫酸卡納霉素（AMRESCO）、水合氯醛（上海山浦化工）、實時熒光定量PCR試劑盒（Qiagen）、Western blot檢測試劑盒（Bovogen）、小鼠來源的HSP60單克隆抗體（Millipore）、4，6-二脒基-2-苯基吲哚（4，6-Diamidino-2-Phenylindole，DAPI，Santa）。主要儀器有ABR檢測儀（TDT）、激光共聚焦顯微鏡（OLYMPUS）、凝膠成像分析系統(tǒng)（Syngene）。

1.3實驗方法和步驟

1.3.1動物模型的建立

實驗組KM 500 mg/kg，對照組按體重給予相應(yīng)劑量生理鹽水，每天同一時間腹腔注射，一日一次，連續(xù)21天［4］。

1.3.2ABR測試在隔聲屛閉室內(nèi)進(jìn)行，使用美國TDT公司生產(chǎn)的聽覺誘發(fā)電位工作站于注射結(jié)束后一天進(jìn)行ABR測定。腹腔注射15％水合氯醛（450 mg/ kg）麻醉，記錄電極置于顱頂正中骨縫，參考電極和接地電極分別置于測試耳后皮下和鼠尾根部皮下，外揚(yáng)聲器置于距離大鼠頭部2 cm處，正對外耳道。刺激聲為短純音，由MF1-S立體磁場揚(yáng)聲器輸出，強(qiáng)度為90 dB SPL，刺激頻率20次/s，掃描時間為10 ms，上升下降時間為0.5 ms，間隔時間為45.517 ms，濾波范圍100-3000Hz，疊加1024次。以能引出波Ш的最小刺激強(qiáng)度為ABR反應(yīng)閾，從90dB SPL開始，依次檢測click、4、8、16、24、32 kHz反應(yīng)閾。

1.3.3RT-PCR和Western Blot耳蝸樣本取材ABR檢測結(jié)束后，每組取6只大鼠，麻醉后迅速斷頭，取雙側(cè)顳骨，置于4℃預(yù)冷的生理鹽水中，解剖顯微鏡下除去前庭部分、軟組織等，將帶骨殼的耳蝸在濾紙上吸水干燥，置于凍存管，液氮冷藏保存。

1.3.4RT-PCR檢測mRNA表達(dá)量的變化

每組取3只SD大鼠耳蝸樣本，充分碾碎后，按照試劑盒說明進(jìn)行操作，整個過程在4℃條件下進(jìn)行，檢測HSP60的mRNA表達(dá)，引物Hspd1、內(nèi)參為GAPDH（GeneCopoeiaRockville，MD，catalog#:RQP050362，RQP049537）。首先提取耳蝸總RNA，并測定濃度。然后調(diào)整RNA模板總量為500ng/體系，配制體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。最后配制體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，數(shù)據(jù)分析。

1.3.5Western Blot檢測蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化每組取3只SD大鼠耳蝸樣本，充分碾碎后，加入200ul含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液（1:200），碾磨、裂解組織。置于冰上10分鐘，重復(fù)3次，使組織充分裂解。離心，吸上清，取10ul稀釋10倍后進(jìn)行微孔法BCA蛋白定量，酶標(biāo)儀檢測蛋白濃度（波長560nm），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣的結(jié)果計算并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算蛋白樣品濃度。調(diào)整蛋白濃度，使各樣本終濃度均為1.5ug/ ul，進(jìn)行蛋白變性。采用10％的分離膠和5％的濃縮膠SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗HSP60（1:1000，Millipore）、GAPDH（1:1000，ProteinTech）4℃孵育過夜，二抗分別為抗鼠和抗兔的辣根過氧化物酶標(biāo)記IgG（1:2000，康為世紀(jì)）室溫?fù)u床孵育2小時，化學(xué)發(fā)光顯影，數(shù)據(jù)分析。

1.3.6免疫熒光染色樣本處理

每組取4只，麻醉后迅速斷頭，取耳蝸，4％多聚甲醛固定過夜，10％EDTA脫鈣7天。2只脫鈣后30％蔗糖脫水過夜，OCT膠浸潤一天，切片機(jī)10um連續(xù)切片；2只脫鈣后顯微鏡下剝離基底膜，將其放入EP管中，0.01M PBS（PH7.2-7.4）漂洗用于基底膜鋪片。

1.3.7耳蝸切片免疫熒光染色耳蝸切片PBS漂洗掉OCT膠后，首先1％TritonX-100打孔5 min，而后5％牛血清白蛋白封閉30min，小鼠來源HSP60單克隆抗體（1:100，Millipore）、兔來源P27KIP1單克隆抗體（1:100，Millipore）過夜。二抗（1:200熒光染料488標(biāo)記的羊抗鼠LgG抗體，1:500熒光染料594標(biāo)記的羊抗兔LgG抗體，Invitrogen）孵育1h，最后DAPI（1:200）染色10 min，80％甘油封片觀察

1.3.8基底膜鋪片免疫熒光染色剝離的基底膜PBS漂洗后，首先3％TritonX-100浸泡30 min，而后5％牛血清白蛋白封閉30min，余后過程和切片染色相同。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析

實驗中的數(shù)據(jù)均為計量資料，故用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。運(yùn)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對測試結(jié)果進(jìn)行方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1造模3周后兩組大鼠ABR反映閾比較實驗前ABR檢測，兩組聽力都正常，兩組沒有統(tǒng)計學(xué)差異。造模3周后，對照組聽力仍正常，KM組（實驗組）各頻率ABR均較正常對照組有明顯的升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中以高頻提高最為顯著（表1）。

2.2HSP60在耳蝸中的表達(dá)變化造模3周后，RT-PCR結(jié)果顯示，KM組較對照組HSP60的mRNA表達(dá)量降低（P＜0.05，圖1）；Western Blot結(jié)果顯示，KM組較對照組HSP60蛋白表達(dá)量降低（P＜0.05，圖2）。HSP60在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，表達(dá)變化一致。

圖1　HSP60的mRNA的相對表達(dá)量Fig.1 The expression of HSP60 mRNAin the cochleae of each group

圖2　HSP60蛋白的相對表達(dá)量Fig.2 The expression of HSP60 protein in the cochleae of each group

表1　各組大鼠各頻率ABR反應(yīng)閾（dB SPL±S，）（n=10）Table 1 The ABR threshold of each group（dB SPLχ±S，）（n=10）

表1　各組大鼠各頻率ABR反應(yīng)閾（dB SPL±S，）（n=10）Table 1 The ABR threshold of each group（dB SPLχ±S，）（n=10）

Group Frequence（kHz）4 Control K M Click 26.00±5.16 35.00±5.27*27.00±6.32 39.50±4.97*8 27.50±7.17 40.00±5.27*16 29.50±5.99 45.00±5.27*24 27.00±9.19 48.50±5.80*32 30.50±10.66 53.00±6.32*

2.3HSP60在耳蝸中的表達(dá)分布P27KIP1在大鼠耳蝸Corti器成年后表達(dá)于支持細(xì)胞的胞核，可以作為支持細(xì)胞的標(biāo)記物［5］。耳蝸冰凍切片染色，顯示HSP60表達(dá)于支持細(xì)胞胞漿，包括內(nèi)溝細(xì)胞、內(nèi)緣細(xì)胞、Hensen細(xì)胞、Claudius細(xì)胞（圖3）。對照組和KM組表達(dá)分布相同，沒有變化?；啄っ庖邿晒馊旧?，顯示HSP60表達(dá)于毛細(xì)胞區(qū)域兩側(cè)的支持細(xì)胞，同時可以觀察到KM組毛細(xì)胞核排列紊亂、缺失，KM組較對照組熒光強(qiáng)度降低（圖4）。

圖3　耳蝸冰凍切片顯示HSP60在耳蝸的表達(dá)分布（30×），圖Merge白色箭頭所示從左到右依次為內(nèi)溝和內(nèi)緣細(xì)胞、Hensen細(xì)胞、Claudius細(xì)胞Fig.3 The immunofluorescence staining patterns for HSP60 expression in normal adult rats（30×）.The white arrow shows HSP60 expression in the supporting cells of Corti，including inner sulcus cells，inner border cells，Hensen's cells and Claudius cells in the merged picture（from left to right）.

圖4　基底膜鋪片免疫熒光染色顯示HSP60在耳蝸的表達(dá)變化（60×）Fig.4 The immunofluorescence staining patterns for HSP60 expression in the two groups（60×）

3　討論

臨床發(fā)現(xiàn)無論藥物、噪聲、衰老等引起的耳聾，早期聽力圖表現(xiàn)為高頻聽力下降，病理上表現(xiàn)為高頻區(qū)外毛細(xì)胞損傷。外毛細(xì)胞損傷是引起感音神經(jīng)性聾的主要原因之一，而高頻區(qū)外毛細(xì)胞最先受到損傷。氨基糖苷類抗生素是廣譜殺菌藥，廣泛的應(yīng)用于臨床治療，其在內(nèi)耳的內(nèi)外淋巴液內(nèi)可有高濃度蓄積，會產(chǎn)生明顯的耳毒性。應(yīng)用氨基糖苷類抗生素造成大鼠藥物性耳聾的模型，方便、有效，是耳科研究常用模型［4，6］。本研究應(yīng)用硫酸卡納霉素慢性造聾，ABR檢測結(jié)果顯示形成了典型的高頻聽力下降明顯的感音神經(jīng)性聾。

HSP60是熱休克蛋白家族中的一員，和其他的熱休克蛋白在抵抗病理環(huán)境、維持細(xì)胞存活中起重要作用。HSP60是一種重要的線粒體伴侶蛋白，在蛋白的折疊和裝配中起著重要的作用［1］。而研究表明分子伴侶在維持蛋白穩(wěn)態(tài)和蛋白折疊的過程發(fā)揮著重要的作用，缺失可能與疾病的發(fā)生有關(guān)［7］。也有研究表明熱休克蛋白可以阻止氨基糖苷類抗生素和順鉑引起的感覺毛細(xì)胞的死亡［8］。在硫酸卡納霉素慢性造聾的過程中，HSP60在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平表達(dá)量都降低，可能參與了聽力損傷的發(fā)生。

支持細(xì)胞對內(nèi)耳的發(fā)育、功能的維持、存活、死亡、吞噬、再生等方面發(fā)揮著重要的作用，而目前對此方面的研究很少，是需要深入研究的一個方向［9］。近來研究顯示耳蝸毛細(xì)胞受到損傷會導(dǎo)致支持細(xì)胞一些分子信號激活，推測在毛細(xì)胞的死亡過程中支持細(xì)胞可能參與其中。毛細(xì)胞激光燒灼或機(jī)械損傷引起細(xì)胞間鈣離子流在支持細(xì)胞傳播，從損傷部位移除，提示支持細(xì)胞對毛細(xì)胞的應(yīng)激會產(chǎn)生相應(yīng)特異性的應(yīng)答［10-11］。損傷引起的耳蝸支持細(xì)胞中ERK1/ 2的激活會使毛細(xì)胞的死亡增多，而藥物抑制支持細(xì)胞的ERK信號可以抑制耳蝸毛細(xì)胞的死亡，推測支持細(xì)胞調(diào)控毛細(xì)胞的死亡［12］。而在上皮細(xì)胞，HSP60可以通過激活ERK起到保護(hù)作用［13］。除此之外，支持細(xì)胞在清除損傷或死亡的毛細(xì)胞方面也發(fā)揮著重要的作用［9］。真核生物的HSP60不僅位于線粒體內(nèi)，還發(fā)現(xiàn)HSP60存在于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞間隙和體液中（血液和腦脊液）［14-16］。例如，在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，HSP60是線粒體表達(dá)的熱反應(yīng)蛋白，但可以轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)，也可以轉(zhuǎn)運(yùn)到胞膜，釋放到體液中［17］。在內(nèi)耳前庭中，支持細(xì)胞可能通過分泌熱休克蛋白對毛細(xì)胞起到保護(hù)作用［18］。在本研究中，HSP60表達(dá)于支持細(xì)胞胞漿中，正常情況下即表達(dá)；硫酸卡那霉素慢速造聾模型中，毛細(xì)胞受損，支持細(xì)胞HSP60表達(dá)量降低。推測在耳聾的發(fā)病過程，支持細(xì)胞可能通過調(diào)控HSP60的表達(dá)，介導(dǎo)毛細(xì)胞的死亡。

綜上所述，HSP60表達(dá)于耳蝸Corti器支持細(xì)胞中，在耳聾的發(fā)生過程中可能發(fā)揮了重要作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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Expression of HSP60 in a rat model of drug-induced deafness

【KeyWords】HSP60；Hearing loss；Supporting cell

【Abstract】Objective To study the expression of heat shock protein 60（HSP60）in rat cochleae and its changes in kanamycin monosulfate（KM）-induced ototoxicity.Methods Twenty adult female Sprague-Dawlay（SD）rats were randomly divided into two groups（n=10 in each）to receive intraperitoneal injection of KM（500 mg/kg qd）for twenty one days，or equivalent volume of saline（control group）.ABR tests were used to detect hearing loss.The pattern and level of HSP60 expression within the cochlea were tested by real-time PCR，Western blot and immunofluorescence assays.Results ABR tests showed significantly higher thresholds in the experimental group than in the control group（P＜0.05）.Real-time PCR，Western blot and basilar membrane immunofluorescence staining showed decreased expression of HSP60 in the experimental group（P＜0.05）.Immunofluorescence staining of frozen cochlear sections revealed HSP60 expression in supporting cells of the organ of Corti.Conclusion HSP60 is expressed in supporting cells under normal conditions，but is decreased in rats with chronic drug-induced hearing loss.It is hence speculated that HSP60 may participate in the process of drug-induced hearing loss.

【中圖分類號】R764

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1672-2922（2016）02-251-4

DOI:10.3969/j.issn.1672-2922.2016.02.025

基金項目：國家自然科學(xué)基金海外重大合作項目（81120108008），國家“973”項目課題（2011CB504505）

作者簡介：田克勇，碩士研究生，研究方向:耳聾基礎(chǔ)

通訊作者：邱建華，Email :qiujh@fmmu.edu.cn

Corresponding author:QIU JianhuaEmail:qiujh@fmmu.edu.cn

收稿日期：（2015-10-09審核人：郭維維）