趙媛莉李彤彤劉新華呂錦剛章晉勇畢永紅（.中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，武漢 40072； 2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 00049； .武漢市政工程設(shè)計(jì)研究院有限責(zé)任公司，武漢 40022）

東湖通道工程對(duì)沿線底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響

趙媛莉1，2李彤彤1，2劉新華1，2呂錦剛3章晉勇1畢永紅1
（1.中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，武漢 430072； 2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049； 3.武漢市政工程設(shè)計(jì)研究院有限責(zé)任公司，武漢 430022）

摘要：為調(diào)查東湖通道工程對(duì)沿線底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性可能造成的影響，隨著隧道施工的進(jìn)程，在東湖通道沿線的3個(gè)湖區(qū)中的19個(gè)采樣點(diǎn)進(jìn)行了3次采樣，通過(guò)PCR-DGGE結(jié)合分子克隆技術(shù)，分析了細(xì)菌群落的群落結(jié)構(gòu)及多樣性。3批樣品共檢出細(xì)菌類(lèi)群分別為5門(mén)18屬、6門(mén)17屬、5門(mén)11屬。在門(mén)水平上，底泥中的優(yōu)勢(shì)菌是變形菌門(mén)，但其在總量中的比例隨施工進(jìn)程逐漸下降，依次為86%、80.6%和43.9%。在屬水平上，施工初期的優(yōu)勢(shì)菌是埃希氏桿菌屬，施工后期卻是Steroidobacter。通道施工初期，湯菱湖、郭鄭湖的湖心區(qū)域在屬水平上的群落結(jié)構(gòu)相似性較高，與團(tuán)湖差異顯著； 接近施工區(qū)樣點(diǎn)與遠(yuǎn)離施工區(qū)樣點(diǎn)的底泥細(xì)菌群落存在顯著差異； 因施工形成的臨時(shí)封閉水域與敞水區(qū)除均有埃希氏桿菌屬外，其他菌屬類(lèi)群差異顯著。施工后期的湯菱湖、郭鄭湖及團(tuán)湖的湖心區(qū)的底泥微生物群落結(jié)構(gòu)趨于相似； 接近施工區(qū)樣點(diǎn)與遠(yuǎn)離施工區(qū)樣點(diǎn)的底泥細(xì)菌群落差異不顯著； 封閉區(qū)和敞水區(qū)有相似的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。施工期間，細(xì)菌群落的多樣性指數(shù)的最高點(diǎn)都有出現(xiàn)在靠近施工區(qū)的位置。各批次樣點(diǎn)的Simpson_1-D指數(shù)、Shannon_H指數(shù)、Margalef指數(shù)，均隨著施工進(jìn)程而逐漸增加。因此，東湖通道修建對(duì)通道沿線近距離的底泥細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性產(chǎn)生了較顯著的影響，這種影響是暫時(shí)性還是持續(xù)性的，尚需通道完工回填后的長(zhǎng)期評(píng)估。研究將為進(jìn)一步探討通道修建等人為強(qiáng)干擾活動(dòng)對(duì)淺水湖泊的可能環(huán)境影響和制定合理的生態(tài)修復(fù)策略提供理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支撐。

關(guān)鍵詞：東湖通道工程； 底泥細(xì)菌群落； 種類(lèi)組成； 群落結(jié)構(gòu)； 多樣性； 影響； PCR-DGGE

東湖（114°23′E，30°22′N(xiāo)）位于武漢市武昌區(qū)東北部，最大水深4.75 m，平均水深2.21 m，年平均氣溫18.3℃，年均水溫18.5℃，是長(zhǎng)江中下游的一個(gè)中型淺水湖泊，流域面積187 km2，由多個(gè)大小不同的子湖組成［1］。隨著武漢城市的不斷發(fā)展，東湖環(huán)湖路已成為武珞路車(chē)輛分流的一條交通干線，景區(qū)超負(fù)荷車(chē)流日益破壞景區(qū)生態(tài)環(huán)境，為了加強(qiáng)東湖風(fēng)景名勝區(qū)保護(hù)，合理利用與開(kāi)發(fā)景區(qū)資源，武漢市開(kāi)啟了東湖通道建設(shè)［2］。東湖通道工程位于AAAAA級(jí)東湖風(fēng)景名勝區(qū)內(nèi)。通道起點(diǎn)與二環(huán)線水東段主線高架橋紅廟立交銜接，于九女墩北側(cè)進(jìn)入隧道，隧道下穿郭鄭湖北側(cè)，過(guò)湖心島，再下穿湯菱湖、沿湖路、郭鄭湖南側(cè)、梅園大門(mén)和磨山小區(qū)，穿過(guò)魯磨路、訪梅路與團(tuán)山路路口后，起坡出地面。經(jīng)過(guò)0.3 km地面段后再次于團(tuán)山以北進(jìn)入隧道，下穿團(tuán)山后，于喻家湖北路以北出隧道，以地面段與喻家湖北路相接，止于喻家湖路光谷大道主線高架橋（虹景立交），全長(zhǎng)12.14 km，其中湖底隧道全長(zhǎng)約6.2 km［3］。隧道施工不可避免會(huì)影響東湖生態(tài)環(huán)境，并可能導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境惡化，造成水環(huán)境污染，其中施工區(qū)廢水是主要污染源［4］，明渠開(kāi)挖造成的湖底裸露與施工造成的底泥再懸浮等也將對(duì)隧道周邊微生物群落結(jié)構(gòu)造成不同程度的影響。湖泊底泥是一個(gè)微生物物種豐富、物質(zhì)交換頻繁、生物活性高的環(huán)境［5］，且底泥微生物在物質(zhì)循環(huán)及能量流動(dòng)中起著重要作用。湖泊底泥微生物群落結(jié)構(gòu)是水體環(huán)境變化和演替的重要標(biāo)志，湖泊水環(huán)境質(zhì)量的改變使其底泥微生物在數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)上發(fā)生變化，同時(shí)底泥中的微生物也會(huì)反過(guò)來(lái)影響湖泊水環(huán)境的質(zhì)量。

為了考察東湖通道工程對(duì)沿線底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性造成的可能影響，本研究以武漢東湖通道修建的周邊底泥細(xì)菌為研究對(duì)象，運(yùn)用PCRDGGE及分子克隆、測(cè)序技術(shù)，初步研究了通道修建期間武漢東湖3個(gè)主要受影響湖區(qū)底泥細(xì)菌類(lèi)群的群落組成及多樣性的變化，進(jìn)而探討通道修建的人為強(qiáng)干擾活動(dòng)對(duì)淺水湖泊的可能影響，為制定合理的生態(tài)防護(hù)與修復(fù)策略提供理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 采樣時(shí)間和采樣位置

根據(jù)GPS定位系統(tǒng)在東湖隧道周邊的3個(gè)湖區(qū)內(nèi)設(shè)置了19個(gè)采樣點(diǎn)（圖 1），紅色虛線指的是建通道的位置，其中選取沙灘浴場(chǎng)4個(gè)（1—4#）、湯菱湖4個(gè)（5—8#）、郭鄭湖10個(gè)（9—17#）、團(tuán)湖2個(gè)（18—19#），并于2014年3月26日（第一批）、2014年4月22日（第二批）、2014年5月23日（第三批）各采樣一次。其中第一批和第二批屬于施工初期，第三批屬于施工后期。施工初期，北岸敞口段，北側(cè)岸邊及湖底隧道暗埋段，沙灘浴場(chǎng)段隧道，湖底隧道暗埋段，半敞口式隧道和南岸敞口段均處于正在施工中。施工后期，沙灘浴場(chǎng)段隧道水已完全抽干，北岸敞口段，北側(cè)岸邊及湖底隧道暗埋段，湖底隧道暗埋段，半敞口式隧道和南岸敞口段也均處于施工中。用SBR-1型便攜式沉積物-界面水采樣器對(duì)底泥表層進(jìn)行取樣，順序編號(hào)后用錫箔紙包裹，迅速置于4℃保存并帶回實(shí)驗(yàn)室，部分底泥保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

圖 1 東湖建隧道的采樣點(diǎn)示意圖

1.2 樣品分析

細(xì)菌總基因組提取 采用MP FastDNA土壤自旋提取試劑盒，具體操作參照說(shuō)明書(shū)，提取完畢即用或保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

16S rDNA V3區(qū)PCR擴(kuò)增 使用通用引物R518和5′端帶40 bp GC夾的細(xì)菌特異性引物F338擴(kuò)增基因組DNA［6］。采用50 μL PCR體系的降落PCR方法，程序如下:94℃預(yù)變性4min； 94℃變性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，然后每循環(huán)一次，降低0.5℃，進(jìn)行10個(gè)循環(huán)； 94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共20個(gè)循環(huán)； 72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用含有EB（溴化乙錠）染色劑的1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，紫外成像并保存結(jié)果。其中為了便于對(duì)污染源進(jìn)行追蹤，在每一組PCR擴(kuò)增過(guò)程中都設(shè)立了一個(gè)陰性對(duì)照（陰性對(duì)照除了不加模板DNA外，其余組分均加）。

變性梯度凝膠電泳 通過(guò)DGGE（Dcode system，BioRad）將細(xì)菌總基因組DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳，從而來(lái)分析細(xì)菌群落特征。所選用的聚丙烯酰胺的變性梯度范圍為40%—60%，緩沖液為1×TAE，電泳參數(shù)為110 V、16h，溫度為60℃，電泳結(jié)束采用銀染法進(jìn)行染色。

細(xì)菌16S rDNA片段克隆和測(cè)序 將DGGE圖譜上的優(yōu)勢(shì)條帶和特征條帶割膠回收，放入1.5 mL的離心管，加入10 μLTE（pH 8.0），4℃浸泡一夜，以使DNA從凝膠中釋放，然后取1 μL作為模板，使用F338（不帶GC夾）和R518作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)，熱蓋溫度99℃，94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)，最后在72℃延伸10min，4℃保存。純化PCR產(chǎn)物之后連接到pMD18-T載體（TaKaRa，日本）質(zhì)粒上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)DH5α大腸桿菌，之后挑選陽(yáng)性克隆送往武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司測(cè)序。

數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析 通過(guò)Quantity One4.2.3軟件導(dǎo)出變性梯度凝膠電泳圖譜條帶豐度數(shù)據(jù)矩陣。運(yùn)用PAST軟件對(duì)生成的數(shù)據(jù)矩陣（屬水平）進(jìn)行基于Jaccard similarity/distance的PCoA分析，且計(jì)算出Simpson_1-D、Shannon_H、Margalef指數(shù)，來(lái)分析細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性。測(cè)序得到的序列去除載體序列后，在RDP（Ribosomal Database Project Ⅱ-Release 9 website，http://rdp.cme.msu.edu）上進(jìn)行細(xì)菌分類(lèi)分析，置信度閾值為80%［7］。并用R語(yǔ)言軟件對(duì)數(shù)據(jù)矩陣（屬水平）作出Heatmap圖（http://www.r-project.org/）來(lái)對(duì)3批樣品屬水平的細(xì)菌群落進(jìn)行聚類(lèi)［8］。由于本文分析測(cè)試的數(shù)據(jù)分布不屬于正態(tài)分布，因此采用獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)對(duì)樣本進(jìn)行分析（SPSS，v19.0），多個(gè)組間計(jì)量資料比 較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)顯著性水平確定為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 種類(lèi)組成

施工初期，第一批樣品共檢出5門(mén)18屬，分別是Proteobacteria（變形菌門(mén)）、Acidobacteria（酸桿菌門(mén)）、Firmicutes（厚壁菌門(mén)）、Chloroflexi（綠彎菌門(mén)）、Bacteroidetes（擬桿菌門(mén)），各占86%、7.2%、2.6%、2.3%和1.9%（圖 2A），種類(lèi)最多的門(mén)是變形菌門(mén)，有11屬細(xì)菌類(lèi)群； 其次是酸桿菌門(mén)，有4屬細(xì)菌類(lèi)群； 厚壁菌門(mén)，有2屬細(xì)菌類(lèi)群，綠彎菌門(mén)和擬桿菌門(mén)均1屬細(xì)菌類(lèi)群。沙灘浴場(chǎng)處（樣點(diǎn)1、2、3、4）所在的封閉區(qū)域與湯菱湖（樣點(diǎn)6、7、8）和郭鄭湖（樣點(diǎn)10、11、12）的敞水區(qū)域均有埃希氏桿菌屬（圖 3A），但其他菌屬存在顯著差異（P<0.05；Kruskal-Wallis）。在湯菱湖中，最靠近通道的5、6號(hào)樣點(diǎn)與較通道稍遠(yuǎn)的7、8號(hào)樣點(diǎn)的種類(lèi)組成，除優(yōu)勢(shì)菌群相同，其他菌屬存在顯著差異（P<0.05；Kruskal-Wallis）； 在郭鄭湖中，通道兩側(cè)的15、16樣點(diǎn)的種類(lèi)組成相近，但與這個(gè)湖中其他的樣點(diǎn)（9、10、11、12、13、14）的菌屬存在顯著差異（P<0.05； Kruskal-Wallis）； 在團(tuán)湖中，最靠近通道的17與18號(hào)樣點(diǎn)的種類(lèi)組成也略有不同。且在湯菱湖的湖心區(qū)域（樣點(diǎn)7、8）和郭鄭湖的湖心區(qū)域（樣點(diǎn)11、12）在屬水平上的群落結(jié)構(gòu)存在一定的均一性，而與團(tuán)湖差異顯著（P<0.05； Kruskal-Wallis）。

第二批樣品共檢出6門(mén)1 7屬，分別是Proteobacteria（變形菌門(mén)）、Chloroflexi（綠彎菌門(mén)）、Verrucomicrobia（疣微菌門(mén)）、Fusobacteria（梭桿菌門(mén)）、Aminicenantes，各占80.6%、6.6%、2.2%、0.8%和2.2%（圖 2B），其中種類(lèi)最多的門(mén)是變形菌門(mén)，有12屬細(xì)菌類(lèi)群； 其次是綠彎菌門(mén)和梭桿菌門(mén)均有2屬細(xì)菌類(lèi)群，疣微菌門(mén)和Aminicenantes均有1屬細(xì)菌類(lèi)群。沙灘浴場(chǎng)處（樣點(diǎn)2、3）所在的封閉區(qū)域與湯菱湖（樣點(diǎn)6、7、8）和郭鄭湖（樣點(diǎn)10、11、12）的敞水區(qū)域均有埃希氏桿菌屬（圖 3B），但其他菌屬存在顯著差異（P<0.05； Kruskal-Wallis）。在湯菱湖中，最靠近通道的5號(hào)樣點(diǎn)與6、7、8號(hào)樣點(diǎn)的種類(lèi)組成，除優(yōu)勢(shì)菌群相同，其他菌屬存在顯著差異（P<0.05； Kruskal-Wallis）； 在郭鄭湖中，通道兩側(cè)的15、16樣點(diǎn)的種類(lèi)組成相近，但與該湖中其他的樣點(diǎn)（9、10、11、12）差異顯著（P<0.05； Kruskal-Wallis）； 在團(tuán)湖中，最靠近通道的17與18、19號(hào)樣點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)菌群都不同，且種類(lèi)組成相比略少。盡管各湖湖心區(qū)域細(xì)菌種類(lèi)組成存在明顯差異（P<0.05； Kruskal-Wallis），但各自湖心樣點(diǎn)的細(xì)菌種類(lèi)組成均較為相似，如湯菱湖（7、8樣點(diǎn)）、郭鄭湖（11、12樣點(diǎn)）、團(tuán)湖（18、19樣點(diǎn)）。

圖 3 以屬水平的細(xì)菌類(lèi)群在每個(gè)樣點(diǎn)的分布情況

施工后期，第三批樣品共檢出5門(mén)11屬，分別是Proteobacteria（變形菌門(mén)）、Acidobacteria（酸桿菌門(mén)）、Chloroflexi（綠彎菌門(mén)）、Firmicutes（厚壁菌門(mén)）、Spirochaetes（螺旋體門(mén)），各占43.9%、25.1%、7.4%、3.7%和3.7%（圖2C），其中種類(lèi)最多的門(mén)仍是變形菌門(mén)，有5屬細(xì)菌類(lèi)群，但所占比例有所降低； 其次是酸桿菌門(mén)有4屬細(xì)菌類(lèi)群，螺旋體門(mén)有1屬細(xì)菌類(lèi)群。沙灘浴場(chǎng)處（樣點(diǎn)1）所在的封閉區(qū)域與湯菱湖（樣點(diǎn)6、7、8）和郭鄭湖（樣點(diǎn)10、11、12）的敞水區(qū)域的細(xì)菌類(lèi)群很相似（圖 3C），與施工初期的前兩批細(xì)菌類(lèi)群差異顯著（P<0.05； Kruskal-Wallis）。在湯菱湖中，最靠近通道的5號(hào)樣點(diǎn)與6、7、8號(hào)樣點(diǎn)的種類(lèi)組成略有不同； 在郭鄭湖中，通道兩側(cè)的15、16樣點(diǎn)的種類(lèi)組成相近，但與這個(gè)湖中其他的樣點(diǎn)（9、10、11、12）差異顯著（P<0.05；Kruskal-Wallis）； 在團(tuán)湖中，最靠近通道的17與18、19號(hào)樣點(diǎn)的種類(lèi)組成相同。且各湖湖心區(qū)域細(xì)菌種類(lèi)組成較相似。以上三批樣品，由以上數(shù)據(jù)可得知，施工后期的樣品（第三批）和施工初期（前兩批）種類(lèi)組成上發(fā)生了顯著變化。

2.2 群落結(jié)構(gòu)

在對(duì)這三批樣品的屬水平的菌群結(jié)構(gòu)做基于Jaccard similarity/distance的主坐標(biāo)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)（圖4），沿著PC1坐標(biāo)的方向（貢獻(xiàn)率為38.5%）的第三批樣品（施工后期）與第一批、第二批樣品（施工初期）遠(yuǎn)遠(yuǎn)分開(kāi)。總體而言，經(jīng)主坐標(biāo)分析所得的2個(gè)主坐標(biāo)，累計(jì)貢獻(xiàn)率為52.1%。得出第三批樣品（施工后期）的屬水平的菌群結(jié)構(gòu)與前兩批（施工初期）存在顯著差異（P<0.05； Kruskal-Wallis）。

如圖 5，以屬為水平的細(xì)菌類(lèi)群，主要有Escherichia/Shigella（埃希氏桿菌屬）、Halochromatium（鹽著色菌屬）、Acinetobacter（不動(dòng)桿菌屬）、Bacillus（芽孢桿菌屬）、Pseudomonas（假單胞菌屬）、Spirochaeta（螺旋體屬）、Steroidobacter、Gp22等。熱圖中顏色的漸變可以形象的看出，各樣點(diǎn)的細(xì)菌類(lèi)群的組成及數(shù)量的變化。同時(shí)，熱圖可以很明顯的看出，施工后期的樣品（第三批）和施工初期（前兩批）沒(méi)有聚在一起，而是獨(dú)自聚在一簇，說(shuō)明施工后期的以屬為水平的各樣點(diǎn)的細(xì)菌類(lèi)群的群落結(jié)構(gòu)與施工初期有明顯的區(qū)別。由此可推測(cè)施工后期，細(xì)菌類(lèi)群的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

圖 4 以屬為水平的細(xì)菌類(lèi)群，三批樣品基于Jaccard similarity/ distance的主坐標(biāo)分析圖

2.3 物種多樣性

在施工初期的樣品（第一批）中，Simpson_1-D指數(shù)、Shannon_H指數(shù)、Margalef指數(shù)最高的采樣點(diǎn)均是5號(hào)，5號(hào)是一個(gè)在湯菱湖中最靠近通道的采樣點(diǎn)； 在第二批樣品中，Simpson_1-D指數(shù)、Shannon_H指數(shù)、Margalef指數(shù)最高的采樣點(diǎn)分別是13（14、15）號(hào)、16號(hào)、16號(hào)，15和16號(hào)是在郭鄭湖中最靠近通道的采樣點(diǎn)； 在施工后期的樣品（第三批）中，Simpson_1-D指數(shù)、Shannon_H指數(shù)、Margalef指數(shù)最高的采樣點(diǎn)均是6（15）號(hào)，其中15號(hào)是在郭鄭湖中最靠近通道的采樣點(diǎn)，6號(hào)是在湯菱湖中較靠近通道處，而9號(hào)采樣點(diǎn)的三種多樣性指數(shù)均低于5、15、16號(hào)采樣點(diǎn)，9號(hào)是和通道隔著一條路。由此可知，在每一批樣品中的細(xì)菌群落的各種多樣性指數(shù)最高的都有出現(xiàn)在靠近通道處的采樣點(diǎn)。各批次樣點(diǎn)的Simpson_1-D指數(shù)、Shannon_H指數(shù)、Margalef指數(shù)，隨著施工進(jìn)程的變化范圍分別為0.5781—0.947、1.099—2.944和1.303—6.113，且隨著施工的進(jìn)程，相應(yīng)樣點(diǎn)的指數(shù)（除5、6）都是逐漸增加的（表 1）。3批次相同樣點(diǎn)的微生物群落的多樣性指數(shù)存在顯著差異（P<0.05；Kruskal-Wallis）。因此可知，隨著施工的進(jìn)程，細(xì)菌的多樣性也相應(yīng)增加。

3 討論

本文是采用DGGE結(jié)合分子克隆技術(shù)，來(lái)分析東湖通道工程對(duì)沿線底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性可能造成的影響，DGGE技術(shù)盡管與理論預(yù)期存在一定的差距，但依舊能夠較好地反映環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性［9］。外界環(huán)境條件的改變等因素是造成環(huán)境微生物群落變化的主要原因［10，11］，環(huán)境細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)特征及其變化能靈敏地反映環(huán)境的現(xiàn)狀與變化趨勢(shì)，在環(huán)境監(jiān)測(cè)及污染治理工程中有非常重要的指示作用［12］。

3.1 東湖通道工程對(duì)沿線底泥細(xì)菌群落的種類(lèi)組成和群落結(jié)構(gòu)的影響

目前報(bào)道的淡水湖泊沉積物中的優(yōu)勢(shì)菌群通常是變形菌門(mén)［13，14］，在我們這3批樣品中均有體現(xiàn)，但可以看出3批樣中變形菌門(mén)占總量的比例在逐漸下降，依次為86%、80.6%和43.9%。特別是第三批，變形菌門(mén)下降了近一半，酸桿菌門(mén)填補(bǔ)了空缺，占據(jù)總量的25.1%，說(shuō)明在門(mén)水平的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。屬水平的優(yōu)勢(shì)菌群也發(fā)生了明顯的變化:施工初期的樣品（第一批和第二批）是埃希氏桿菌屬，到施工后期的樣品（第三批）是Steroidobacter，說(shuō)明在屬水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化。通道施工初期，湯菱湖、郭鄭湖的湖心區(qū)域在屬水平上的群落結(jié)構(gòu)相似性較高，說(shuō)明東湖主湖底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在一定的均一性，而與團(tuán)湖差異顯著，這可能與團(tuán)湖面積小而又與主湖隔離、蓮藕栽種形成的底泥性質(zhì)差異等有關(guān)； 在接近施工區(qū)樣點(diǎn)與遠(yuǎn)離施工區(qū)樣點(diǎn)的底泥細(xì)菌群落存在顯著差異； 在沙灘浴場(chǎng)處，通道建設(shè)形成的臨時(shí)封閉區(qū)域（樣點(diǎn)1、2、3、4）與在湯菱湖（樣點(diǎn)6、7、8）、郭鄭湖（樣點(diǎn)10、11、12）敞水區(qū)域，除均有埃希氏桿菌屬外，其他菌屬類(lèi)群差異顯著。施工后期，湯菱湖、郭鄭湖及團(tuán)湖的湖心區(qū)的底泥微生物群落結(jié)構(gòu)趨于相似； 接近施工區(qū)樣點(diǎn)與遠(yuǎn)離施工區(qū)樣點(diǎn)的底泥細(xì)菌群落差異不顯著； 封閉區(qū)和敞水區(qū)有相似的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，很可能是隧道施工的原因。由于東湖隧道施工區(qū)廢水氮磷含量高于東湖原水，施工區(qū)廢水TN是東湖原水的2—5倍，TP是東湖原水的5—7倍［15］，而環(huán)境因素（OrgC，OrgN，TN，TC，TP等）對(duì)湖泊沉積物細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性具有非常重要的影響［16，17］，且水體環(huán)境的變化會(huì)影響沉積物中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)［18］。由此可推知，在東湖長(zhǎng)期處于施工中，導(dǎo)致施工后期時(shí)東湖的水質(zhì)較均一，均含有氮磷含量較高的廢水，這是使得各處中底泥微生物的群落結(jié)構(gòu)相似的原因之一。所以東湖通道工程對(duì)沿線底泥細(xì)菌的群落種類(lèi)組成與結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了顯著的影響。

3.2 東湖通道工程對(duì)沿線底泥細(xì)菌的多樣性的影響

圖 5 以屬水平的細(xì)菌類(lèi)群的熱圖

DGGE圖譜中條帶的多少可直觀地反映每個(gè)采樣點(diǎn)細(xì)菌的多樣性的豐富程度，但多樣性指數(shù)是研究群落物種數(shù)和個(gè)體數(shù)及其分布均勻度的綜合指標(biāo)［19］。Simpson指數(shù)（1-D）是隨機(jī)取樣的兩個(gè)個(gè)體屬于不同種的概率。Shannon均勻度指數(shù)是通過(guò)Shannon多樣性指數(shù)計(jì)算出來(lái)的均度，包含兩個(gè)因素:一是種類(lèi)數(shù)目，即豐富度； 二是種類(lèi)中個(gè)體分布的均勻度。種類(lèi)數(shù)目越多，多樣性越大； 同樣，種類(lèi)之間個(gè)體分配的均勻性增加也會(huì)使多樣性提高［20］。Margalef指數(shù)反映群落物種豐富度，指數(shù)越大，細(xì)菌群落物種越豐富。在底泥細(xì)菌群落多樣性指數(shù)中，每一批樣品中的細(xì)菌群落的多樣性指數(shù)最高的都有出現(xiàn)在靠近施工區(qū)采樣點(diǎn)。隨著通道施工的進(jìn)程，Simpson_1-D指數(shù)、Shannon_H指數(shù)、Margalef指數(shù)均呈現(xiàn)逐漸升高，除了樣點(diǎn)（5、6）外，這兩個(gè)樣點(diǎn)出現(xiàn)反?，F(xiàn)象有可能是提取DNA的泥樣，不具有該樣點(diǎn)的代表性。細(xì)菌群落的3種多樣性指數(shù)普遍是5月份大于4月份，4月份大于3月份，從3月到5月份，由春天逐步過(guò)渡到初夏，氣溫慢慢升高，有可能季節(jié)變化對(duì)微生物的多樣性有一定的影響，推測(cè)溫度［21］是影響湖泊沉積物中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的因素之一，對(duì)其產(chǎn)生正相關(guān)的作用。然而在人為污染嚴(yán)重的環(huán)境中，較高的微生物多樣性能夠完成更多的生物地化循環(huán)過(guò)程，從而保持生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，因此微生物豐度的增加是微生物群落適應(yīng)環(huán)境變化的表現(xiàn)［22］。由此可推知，隨著施工的進(jìn)程，通道周邊底泥細(xì)菌群落的多樣性增加，是底泥微生物為了更好的適應(yīng)變化的生態(tài)環(huán)境而出現(xiàn)的一種現(xiàn)象。所以東湖通道工程對(duì)沿線底泥細(xì)菌多樣性產(chǎn)生了顯著的影響。

表 1 細(xì)菌多樣性指數(shù)Tab.1 Bacterial diversity index

在東湖建通道中，對(duì)周邊底泥細(xì)菌群落造成影響的很可能的環(huán)境因子是明渠開(kāi)挖造成的湖底裸露與施工造成的底泥再懸浮。但是如何減少這些干擾因子對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響，還需要更多的數(shù)據(jù)資料，進(jìn)行更深入的研究。本文為東湖通道工程實(shí)施完后，進(jìn)行填補(bǔ)東湖，探討是否能恢復(fù)原來(lái)生態(tài)環(huán)境提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

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THE POSSIBLE EFFECT OF TUNNEL CONSTRUCTION ON THE SEDIMENT BACTERIAL COMMUNITY AND DIVERSITY IN LAKE EAST

ZHAO Yuan-Li1，2，LI Tong-Tong1，2，LIU Xin-Hua1，2，Lü Jin-Gang3，ZHANG Jin-Yong1and BI Yong-Hong1
（1.Institute of Hydrobiology，Chinese Academy of Sciences，Wuhan 430072，China； 2.University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China； 3.Wuhan Municipal Engineering Design & Research Institute Co.，Ltd.，Wuhan 430022，China）

Abstract:To evaluate effects of tunnel construction on the sediment bacterial community and diversity in Lake East，19 sampling points were selected and analyzed for 3 consecutive time points during the construction process.The PCRDGGE and molecular cloning were applied to analyze the bacterial species composition，community and diversity of all sampling sediment.A total of 18 bacterial genera belonging to 5 phyla，17 bacterial genera belonging to 6 phyla and 11 bacterial genera belonging to 5 phyla were identified from 3 different batches of sediment samples，respectively.At the level of phylum，Proteobacteria was predominant bacteria among all three batches，but its percentage among the total diversity was decreased with the tunnel construction，presenting 86%，80.6% and 43.9%，respectively.At the level of genera，Escherichia/Shigella was predominant bacteria at the first sampling while Steroidobacter at the third sampling.Attheearly stage of tunnel construction，bacterial community structure of the middle area of Lake Tangling and Lake Guozheng were similar at the level of genus，which was significantly different from those of Lake Tuan.The effect of tunnel construction on the sediment bacterial community was distance dependent.The bacterial community of the temporarily producing closed area for tunnel construction was remarkably different from that of open water area，although both contain Escherichia/Shigella.However，the community diversity and composition of the middle area of Lake Tangling，Lake Guozheng and Lake Tuan became similar at the late stage of tunnel construction.The distance dependent effect of tunnel construction on the bacterial community was not significant at the late stage of tunnel construction.Additionally，temporarily forming closed area was similar to open water area regarding their sediment bacterial community composition.During the construction，the highest diversity index of bacterial community for all three batches of samples appeared in the sampling point adjacent the tunnel.The Simpson_1-D index，Shannon_H index and Margalef index gradually increased with the tunnel construction.Therefore，our results indicated that the tunnel construction had a remarkable influence on the bacterial community and diversity of Lake East sediment，although the long-term effect should be further evaluated.

Key words:Tunnel construction in Lake East； Sediment bacteria； Species composition； Community structure；Diversity； The possible effect； PCR-DGGE

中圖分類(lèi)號(hào)：Q145+.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3207（2016）03-0565-09

doi:10.7541/2016.76

收稿日期：2015-06-12；

修訂日期：2015-12-12

基金項(xiàng)目：武漢市“重度人工干擾下水環(huán)境污染處置及綜合控制關(guān)鍵技術(shù)研究”項(xiàng)目資助［Supported by the Research of Key Technologies for Disposal and Control of Water Environmental Pollution Caused by Severe Aritifical Intereference］

作者簡(jiǎn)介：趙媛莉（1991—），女，湖北鄂州人； 碩士研究生； 研究方向?yàn)槲⑸锷鷳B(tài)學(xué)。E-mail:zhaoyl@ihb.ac.cn

通信作者：章晉勇，E-mail:zhangjy@ihb.ac.cn； 畢永紅，E-mail:biyh@ihb.ac.cn