王 舒肖 艷李 哲張利萍郭勁松（.重慶大學(xué)城市建設(shè)與環(huán)境工程學(xué)院，重慶 400044； 2.中國(guó)科學(xué)院重慶綠色智能技術(shù)研究院，重慶 40074； 3.中國(guó)科學(xué)院水庫(kù)水環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 40074）

小球藻純種室內(nèi)模擬培養(yǎng)初探

王 舒1肖 艷2，3李 哲2，3張利萍1郭勁松2，3
（1.重慶大學(xué)城市建設(shè)與環(huán)境工程學(xué)院，重慶 400044； 2.中國(guó)科學(xué)院重慶綠色智能技術(shù)研究院，重慶 400714； 3.中國(guó)科學(xué)院水庫(kù)水環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400714）

摘要：實(shí)驗(yàn)以小球藻為藻種，構(gòu)建室內(nèi)模擬培養(yǎng)裝置，在選定的一組優(yōu)化的光照、溫度和營(yíng)養(yǎng)鹽濃度條件下，采用間歇培養(yǎng)+連續(xù)培養(yǎng)的方式對(duì)其進(jìn)行單種群培養(yǎng)，模擬藻類生物量積累的過程。將培養(yǎng)期劃分為5個(gè)階段，通過分析各階段的光合熒光參數(shù)以及藻細(xì)胞內(nèi)C、N、P含量，初探生物量積累過程中藻生理參數(shù)的變化特征，為研究水華的發(fā)生、維持和消退提供一定的參考。結(jié)果顯示:調(diào)整期，藻生長(zhǎng)不受生境光熱、營(yíng)養(yǎng)鹽限制，小球藻光合活性較強(qiáng)； 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，藻類開始出現(xiàn)光抑制，熱耗散增加，胞內(nèi)N、P含量及N/P值較高； 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期，藻同時(shí)受光抑制和營(yíng)養(yǎng)鹽抑制，N和P含量、N/P值均下降； 連續(xù)培養(yǎng)期，營(yíng)養(yǎng)鹽限制得到緩解，小球藻光合活性開始升高，且藻細(xì)胞對(duì)N、P營(yíng)養(yǎng)物吸收能力增強(qiáng)。監(jiān)控藻類生物量積累過程中細(xì)胞內(nèi)氮磷下降的“拐點(diǎn)”和細(xì)胞內(nèi)元素比例變化可為預(yù)測(cè)水華的消退提供一定的參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：小球藻； 生物量積累； 生理特征； 水華

水華現(xiàn)象是近年來我國(guó)水體生態(tài)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。水華是指當(dāng)水體出現(xiàn)富營(yíng)養(yǎng)狀況，并且在利于藻類生長(zhǎng)和聚集的光強(qiáng)、溫度以及氣候等環(huán)境條件下，水體藻類大量繁殖或聚集并達(dá)到一定濃度的現(xiàn)象［1］。從單種群生長(zhǎng)的角度，水華表現(xiàn)為優(yōu)勢(shì)藻在生境中最大化生長(zhǎng)以實(shí)現(xiàn)生物量積累。普遍認(rèn)為水華形成的誘因是生境條件改變刺激優(yōu)勢(shì)藻生長(zhǎng)。如今已有大量［2—5］針對(duì)不同生境界因子如光照、溫度和CO2濃度等對(duì)藻類生長(zhǎng)影響的研究。然而水華是否暴發(fā)，其高生物量是否在一定時(shí)期內(nèi)維持，這與藻類自身對(duì)生境條件改變所做出的生理響應(yīng)也有一定的關(guān)聯(lián)。

目前關(guān)于藻類生長(zhǎng)對(duì)生境變化的響應(yīng)機(jī)制研究主要有室內(nèi)模擬和野外原位實(shí)驗(yàn)兩種手段。室內(nèi)藻類培養(yǎng)大多采取光照培養(yǎng)箱，通過側(cè)面光照系統(tǒng)和溫控裝置對(duì)藻類生長(zhǎng)進(jìn)行觀測(cè)，主要用于藻類種群生物量累積等方面的研究，但對(duì)于模擬水體光強(qiáng)垂直單向衰弱以及水體紊流擾動(dòng)等對(duì)藻類的影響存在一定的局限性。野外原位實(shí)驗(yàn)極易受到氣候變化的影響，難以通過獨(dú)立控制單一因子，定量分析不同生境要素下藻類生長(zhǎng)響應(yīng)機(jī)制。

因此，為進(jìn)一步明晰水華形成過程中藻類細(xì)胞生理的調(diào)整特征，研究設(shè)計(jì)了模擬室內(nèi)試驗(yàn)裝置，選取小球藻作藻種，采用間歇培養(yǎng)+連續(xù)培養(yǎng)的方式對(duì)其進(jìn)行單種群培養(yǎng)，模擬藻生物量積累的過程，將培養(yǎng)期劃分為間歇1期（1—3d）、間歇2期（4—8d）、間歇3期（9—14d）、稀釋率0.01/d期（15—24d）、稀釋率0.03/d期（25—36d）5個(gè)階段，通過對(duì)各階段葉綠素?zé)晒鈪?shù)以及藻細(xì)胞內(nèi)C、N、P含量的分析，初探生物量積累過程中藻類細(xì)胞的生理參數(shù)變化特征，為研究水華的形成、維持和消退提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻類生物量積累室內(nèi)模擬裝置的構(gòu)建

本文提出一種可模擬光照在自然水體中垂直分布特性、可在線監(jiān)測(cè)或控制其他實(shí)驗(yàn)參數(shù)的藻類培養(yǎng)裝置。模擬裝置的尺寸為40 cm×80 cm× 50 cm（長(zhǎng)×寬×高），包括培養(yǎng)液供給系統(tǒng)、培養(yǎng)箱供氣系統(tǒng)、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)箱頂部光源陣列與控制系統(tǒng)、在線監(jiān)測(cè)系統(tǒng)、培養(yǎng)液出流與取樣裝置、外側(cè)控溫系統(tǒng)等。其結(jié)構(gòu)如圖1—4所示，具有以下突出特點(diǎn):（1）光源均勻置于培養(yǎng)箱頂部，通過調(diào)節(jié)啟閉燈管的數(shù)量和單根燈管的功率來控制入射的光照強(qiáng)度。光照入射方式同天然水體相同，可以很好的模擬天然水體中光照單向傳遞的現(xiàn)象。（2）培養(yǎng)箱可通過出水口的調(diào)節(jié)，采取不同水深的水樣，實(shí)現(xiàn)對(duì)藻類生長(zhǎng)和藻類垂向運(yùn)動(dòng)的研究。（3）培養(yǎng)箱內(nèi)置水下光量子儀，可精確測(cè)量不同水深下光照強(qiáng)度的變化特征。（4）培養(yǎng)箱的水浴溫控裝置可以調(diào)節(jié)不同水層的水溫，模擬天然水體中水溫分層的特征。（5）培養(yǎng)箱系統(tǒng)各組件可拆卸，便于清潔和滅菌。（6）通過在線探頭，可以對(duì)培養(yǎng)箱內(nèi)藻類生長(zhǎng)過程進(jìn)行精確監(jiān)控，并通過無紙記錄儀自動(dòng)記錄。（7）培養(yǎng)箱可設(shè)置間歇運(yùn)行、連續(xù)運(yùn)行、半連續(xù)運(yùn)行等多重運(yùn)行模式，通過光照調(diào)節(jié)、水溫調(diào)節(jié)、培養(yǎng)液濃度調(diào)節(jié)等，可模擬不同環(huán)境對(duì)藻類生長(zhǎng)的影響。其中:1.PVC板材箱體； 2.透明有機(jī)玻璃頂板； 3.接種孔； 4.在線監(jiān)測(cè)探頭安裝孔； 5.水下光量子儀測(cè)量孔； 6.供氣干管； 7.光源陣列； 8.常閉的承插式觀察孔； 9.溫控裝置； 10.出樣口； 11.曝氣支管； 12.曝氣頭； 13.曝氣管槽； 14.培養(yǎng)液進(jìn)樣管；15.培養(yǎng)液進(jìn)樣孔； 16.水下光量子探頭固定平臺(tái)；17.垂直導(dǎo)軌； 18.溫控材料； 19.PLC控制單元； 20.培養(yǎng)液進(jìn)樣系統(tǒng)； 21.蠕動(dòng)泵； 22.光量子儀探頭；23.可拆卸連桿； 24.水下光量子儀光纜； 25.氣泵；26.流量調(diào)節(jié)閥； 27.流量計(jì)； 28.空氣過濾器； 29.在線監(jiān)測(cè)探頭； 30.探頭PLC控制單元。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

藻種及培養(yǎng) 小球藻（Chlorella sp.FACHB-8）購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院淡水藻種庫(kù)（FACHB-collection）。以BG11為基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度（25±1）℃，光照強(qiáng)度25 μmol/（m2·s），光周期12h︰12h。

圖 1 模擬裝置頂部示意圖

圖 2 模擬裝置底部示意圖

圖 3 模擬裝置A-A剖面圖

圖 4 模擬裝置B-B剖面圖

藻液的制備 藻種在使用前先饑餓培養(yǎng)1周，取10 mL藻種于離心管中，以4500 r/min離心15min，棄上清液，加入15 mg/L NaHCO3溶液，用于除去表面吸附的多余的營(yíng)養(yǎng)鹽，再次離心15min，棄上清，重復(fù)2次，藻種的初始密度為1.0×104左右 。從而獲得將被接種于模擬裝置的藻液。

1.3 模擬裝置的運(yùn)行

實(shí)驗(yàn)通過對(duì)裝置的稀釋率調(diào)節(jié)來實(shí)現(xiàn)室內(nèi)模擬藻類生物量積累。當(dāng)稀釋率低于藻類生長(zhǎng)速率時(shí)，藻類可利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)再次進(jìn)行生物量的累積，從而達(dá)到該生境下的最大生物量值。稀釋率是指培養(yǎng)液在模擬裝置內(nèi)平均停留時(shí)間的倒數(shù)。計(jì)算公式如下:

式中，D（/d）、F（L/d）、V（L）分別表示稀釋速率、培養(yǎng)液輸入流量、藻液體積。

在使用之前先將模擬裝置內(nèi)部清洗并紫外滅菌消毒，然后通過蠕動(dòng)泵將超純水注入，打開曝氣裝置，將模擬裝置滿負(fù)荷運(yùn)行3—5d，排水，待用。將滅菌后的培養(yǎng)液通過蠕動(dòng)泵注入模擬裝置內(nèi)，直至液面上升到20 cm處；培養(yǎng)液的供給管路置于箱內(nèi)底部的一側(cè)，沿培養(yǎng)管均勻設(shè)置若干小孔，培養(yǎng)液經(jīng)過高溫滅菌后通過密封的硅膠管路由蠕動(dòng)泵抽入培養(yǎng)箱內(nèi)。接著通過接種孔將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻液接入培養(yǎng)箱內(nèi)，打開曝氣裝置，使培養(yǎng)箱內(nèi)藻液混合均勻；在實(shí)驗(yàn)中使用的氣體為空氣，由空氣泵通過流量調(diào)節(jié)閥，經(jīng)空氣過濾器過濾后，由與箱體底部的曝氣砂頭通氣支管通入培養(yǎng)箱內(nèi)，氣體的供給一方面用于培養(yǎng)箱內(nèi)水體攪拌，維持水體一定的紊流擾動(dòng)，另一方面用于補(bǔ)給藻類生長(zhǎng)過程中所需的碳源，亦可調(diào)節(jié)箱內(nèi)水體酸堿度，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置的通氣速率為0.6 L/min。通過頂部光源陣列系統(tǒng)和側(cè)面溫控系統(tǒng)將培養(yǎng)箱的光照強(qiáng)度和溫度分別設(shè)定為100 μmol/（m2·s）和25℃，每天8:00開啟，20:00關(guān)閉，光周期為12h︰12h。

先通過間歇運(yùn)行階段，使藻類在特定的生境下歷經(jīng)調(diào)整期和對(duì)數(shù)期，隨著營(yíng)養(yǎng)物的消耗的加劇，最終藻類生物量達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定值，進(jìn)入穩(wěn)定期。此時(shí)模擬裝置開啟連續(xù)培養(yǎng)運(yùn)行階段，其他條件保持不變，以相同的流量不斷的加入和放出培養(yǎng)液，培養(yǎng)液的放出由箱右側(cè)的出樣口進(jìn)行，最初稀釋速率設(shè)置為0.01/d，運(yùn)行一段時(shí)間后，藻類生物量再次達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定值進(jìn)入穩(wěn)定期，此時(shí)再將稀釋速率調(diào)為0.03/d運(yùn)行一段時(shí)間。在培養(yǎng)期間，取樣時(shí)間為每天的9:00—10:00。按照實(shí)驗(yàn)計(jì)劃進(jìn)行指標(biāo)測(cè)試。

1.4 監(jiān)測(cè)指標(biāo)及方法

在線監(jiān)測(cè)指標(biāo) 在線監(jiān)測(cè)指標(biāo)主要有pH、ORP和DO，通過無紙記錄儀每隔30min記錄一次數(shù)據(jù)。通過檢測(cè)這3個(gè)指標(biāo)判斷內(nèi)部環(huán)境是否在小球藻生長(zhǎng)的適宜范圍內(nèi)，以便能及時(shí)進(jìn)行調(diào)整。

光合熒光動(dòng)力學(xué)參數(shù)指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)采用由德國(guó)Walz公司生產(chǎn)的PHYTO-PAM，它的特點(diǎn)是分析快速、靈敏和非破壞性。取水樣2 mL于樣品杯中，放在黑暗環(huán)境中暗適應(yīng)15min后，放入PHYTOPAM儀器中，分別測(cè)出最小熒光F0、最大熒光Fm，其中（Fm-F0）為可變熒光Fv，F(xiàn)v/Fm即為PSⅡ（光系統(tǒng)Ⅱ）的最大光量子產(chǎn)量，反映了藻類的潛在最大光合效率［6］。水樣不經(jīng)過暗適應(yīng)，PHYTO-PAM測(cè)定其Fm′、Fs，通過公式1、公式2可得ΦPSII、NPQ。計(jì)算公式如下：

式中:Fm′表示光適應(yīng)狀態(tài)下所有反應(yīng)活性中心都關(guān)閉并且所有的非光化學(xué)過程都處于最優(yōu)態(tài)的熒光產(chǎn)量； Fs表示穩(wěn)態(tài)熒光產(chǎn)量； ΦPSⅡ表示PSⅡ光化學(xué)能量轉(zhuǎn)化的有效量子產(chǎn)量； NPQ表示非光化學(xué)淬滅，通常作為光適應(yīng)狀態(tài)下PSⅡ的天線系統(tǒng)將過量的光能耗散為熱能的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

小球藻細(xì)胞內(nèi)葉綠素的測(cè)定 取4 mL藻液于5 mL離心管中，在溫度25℃、轉(zhuǎn)速6000 r/min下離心5min，吸掉上清液，向所得沉淀中加入4 mL 95%乙醇，于4℃避光提取24h后離心（6000 r/min，4℃，5min）并取上清液，于649 nm和665 nm波長(zhǎng)處，以95%乙醇為參比，測(cè)定吸光度，葉綠素a計(jì)算公式為Chl.a=13.7A665-5.76A649，單位μg/L［7］。

小球藻細(xì)胞內(nèi)P、C、N的測(cè)定 藻P（CellP）的測(cè)定。將直徑為25 mm、孔徑為0.45 μm 的GF/F膜在45℃下灼燒4h，在干燥器中冷卻置室溫后，過濾水樣收集藻細(xì)胞，用蒸餾水通過濾膜2—3次去除GF/F膜上的營(yíng)養(yǎng)鹽。將過濾后含有藻細(xì)胞的濾膜置于50 mL具塞比色管中，加蒸餾水至25 mL，將膜淹沒其中后，加入5%過硫酸鉀溶液4 mL。高壓鍋120℃滅菌30min。冷卻至室溫，加蒸餾水至50 mL。使用鉬藍(lán)法測(cè)定磷酸鹽含量。

藻C（CellC）、藻N（CellN）的測(cè)定。將直徑為25 mm、孔徑為0.45 μm的GF/F膜在45℃下灼燒4h，在干燥器中冷卻置室溫后，過濾水樣收集藻細(xì)胞，用蒸餾水通過濾膜2—3次去除GF/F膜上的營(yíng)養(yǎng)鹽。將過濾后含有藻細(xì)胞的濾膜于65℃下烘24h后于元素分析儀測(cè)定藻細(xì)胞內(nèi)C、N含量。

2 結(jié)果

目前關(guān)于水華的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)大多采用的是水體中Chl.a的濃度大于10 μg/L，生物量大于2×104cell/ L［8］這一指標(biāo)，本論文中水華判斷亦采用此標(biāo)準(zhǔn)。圖 5為裝置內(nèi)小球藻的生長(zhǎng)曲線，根據(jù)模擬裝置內(nèi)小球藻的生長(zhǎng)曲線以及裝置的不同運(yùn)行模式，本文將小球藻的培養(yǎng)期劃分為5個(gè)階段:間歇1期，1—3d，該時(shí)期為小球藻的調(diào)整期； 間歇2期，4—8d，該時(shí)期為小球藻的前指數(shù)生長(zhǎng)時(shí)期； 間歇3期，9—14d，該時(shí)期為小球藻后指數(shù)生長(zhǎng)時(shí)期和穩(wěn)定期； 稀釋率0.01/d期，15—24d，該時(shí)期為裝置以稀釋率為0.01/d運(yùn)行時(shí)期； 25—36d，該時(shí)期為裝置以稀釋率為0.03/d運(yùn)行時(shí)期。從各階段葉綠素?zé)晒鈪?shù)和藻C、N、P含量?jī)蓚€(gè)方面來探討小球藻生物量積累過程中的生理響應(yīng)。

圖 5 裝置內(nèi)小球藻生長(zhǎng)曲線

2.1 模擬裝置內(nèi)在線pH、ORP及DO的監(jiān)控

使用在線pH和ORP控制探頭可實(shí)現(xiàn)對(duì)培養(yǎng)箱內(nèi)藻類生長(zhǎng)過程的精確監(jiān)控。水體pH是一個(gè)重要的生態(tài)參量，主要從兩個(gè)方面來影響微藻的生長(zhǎng):一方面改變環(huán)境的酸堿度，較強(qiáng)的酸性或堿性均會(huì)對(duì)藻細(xì)胞產(chǎn)生傷害； 另一方面通過影響水體碳酸鹽的平衡以及不同形態(tài)無機(jī)碳的分配關(guān)系來影響藻類的生長(zhǎng)。不同的藻種有不同的pH適應(yīng)范圍:魚腥藻的適宜pH范圍為8.0—9.0，微囊藻的pH適宜范圍為9.0左右，來萊茵衣藻的最適pH范圍為7.0左右［9］。氧化還原電位（ORP）也是廣泛用于檢測(cè)水體水質(zhì)的重要指標(biāo)，水體中ORP較低時(shí)表明還原性物質(zhì)或有機(jī)污染物含量高，不利于藻類的生長(zhǎng)，但過高的ORP對(duì)生物的生長(zhǎng)也不利。一般好氧微生物在氧化還原電位為+100 mV以上均可生長(zhǎng)，但最適值為+300—+400 mV； 厭氧性微生物只能在較低于+100 mV以下生長(zhǎng)。表1為模擬裝置內(nèi)在線監(jiān)測(cè)結(jié)果。

藻類在生長(zhǎng)過程中通過光合作用吸收CO2釋放O2，水體pH含量會(huì)升高，同時(shí)藻類產(chǎn)生的還原性產(chǎn)物以及水體中溶解氧的降低也會(huì)使ORP降低。本實(shí)驗(yàn)的目的是在模擬裝置運(yùn)行過程中小球藻的生物量達(dá)到最大形成水華，故而當(dāng)水體中pH或ORP過高或過低時(shí)，需通過改變曝氣量使得pH和ORP維持在小球藻適宜生長(zhǎng)的范圍內(nèi)。有研究表明小球藻的適宜酸堿度為7.0—8.0［10］。模擬裝置運(yùn)行過程中pH的變幅為7.535—7.648，ORP的變幅為290—430 mV，均在小球藻適宜生長(zhǎng)范圍內(nèi)。

2.2 模擬裝置內(nèi)小球藻光合熒光參數(shù)的變化

藻類吸收的光能的用途有三個(gè)途徑:光合作用、熱耗散以及熒光。光合熒光動(dòng)力學(xué)參數(shù)反應(yīng)了小球藻的光合作用的過程和生境要素對(duì)光合能力的影響。Fv/Fm在正常生理狀態(tài)下，它是一個(gè)穩(wěn)定的值，藻類約為0.65［11］，當(dāng)藻類受到環(huán)境脅迫時(shí)其值開始顯著下降，它常用作研究環(huán)境脅迫對(duì)光合作用影響的重要指標(biāo)。ФPSⅡ表示任一光照下的PSⅡ?qū)嶋H光合能量。有研究表明［12，13］，當(dāng)藻類受到營(yíng)養(yǎng)鹽限制時(shí)，光合作用能力會(huì)下降。NPQ是一種重要的“下游調(diào)節(jié)”機(jī)理，當(dāng)外界條件發(fā)生變化時(shí)，通過NPQ的調(diào)節(jié)可以使光化學(xué)淬滅保持恒定，但NPQ的調(diào)節(jié)是有限的［14］。它通常作為光適應(yīng)狀態(tài)下PSⅡ的天線系統(tǒng)將過量的光能耗散為熱能的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

圖 6—9分別為培養(yǎng)期間5個(gè)階段Chl.a含量、Fv/Fm、ФPSⅡ及NPQ的變化。

表 1 模擬裝置內(nèi)在線監(jiān)測(cè)指標(biāo)Tab.1 Online indicators during chemist at running

由圖 7可知，整個(gè)模擬裝置運(yùn)行期間，小球藻的光合活性Fv/Fm總體變化幅度不大，但在間歇2期和間歇3期較其他培養(yǎng)階段低。圖 8可知，模擬裝置運(yùn)行過程中，間歇1期ФPSⅡ均值高于其他培養(yǎng)時(shí)期，間歇2期和間歇3期較其他培養(yǎng)階段低。圖 9可知，模擬裝置運(yùn)行過程中，NPQ均值處于逐漸上升趨勢(shì)。

圖 6 不同培養(yǎng)期小球藻Chl.a變化

圖 7 不同培養(yǎng)期小球藻Fv/Fm變化

圖 8 不同培養(yǎng)期小球藻ФPSⅡ變化

葉綠素a能反映水體中小球藻的生物量，模擬裝置運(yùn)行過程中在間歇1期時(shí)，Chl.a均值（圖 6）為（6.600±2.335）μg/L，處于較低水平，該時(shí)期藻類處于適應(yīng)新環(huán)境的調(diào)整期； 光合活性Fv/Fm和PSⅡ電子傳遞的實(shí)際量子產(chǎn)量ФPSⅡ較高，均值分別為（0.485±0.035）和（0.412±0.010），說明此時(shí)小球藻的光合能力較高，光能被吸收利用轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的效率較高； 同時(shí)NPQ均值為（0.012±0.010），為模擬裝置運(yùn)行期間最低值（圖 6），說明熱耗散較低，多余的激發(fā)能較少，絕大部分被吸收的光能都用于了光合作用。

圖 9 不同培養(yǎng)期小球藻NPQ變化

間歇2期，Chl.a均值為（31.500±06.450）μg/L，較間歇1時(shí)期有了較大的提高，表示小球藻在歷經(jīng)了短暫的調(diào)整期后，細(xì)胞大量繁殖迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期； 隨著培養(yǎng)箱內(nèi)小球藻密度的增大，水體的透光性減弱，藻類受到光抑制現(xiàn)象，光系統(tǒng)II反應(yīng)中心P680不能得到有效還原，供體側(cè)P680+累積，光系統(tǒng)II到光系統(tǒng)I的電子傳遞鏈?zhǔn)茏瑁禤SⅡ均值為（0.299±0.098），較間歇1期降低； 隨著光合作用的降低，小球藻通過調(diào)節(jié)自身光保護(hù)機(jī)制，通過非光化學(xué)淬滅進(jìn)行熱耗散，NPQ較高，在電子轉(zhuǎn)移和熱耗散的綜合作用下，光合活性Fv/Fm均值為（0.460± 0.030），也較間歇1期低。

間歇3期，外界培養(yǎng)液的濃度開始降低，小球藻同時(shí)消耗細(xì)胞內(nèi)源儲(chǔ)存營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)繼續(xù)分裂增殖，培養(yǎng)箱內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸成為小球藻生長(zhǎng)繁殖的限制因子，藻類達(dá)到穩(wěn)定期，Chl.a均值為（48.700± 3.716）μg/L，較間歇2期高，這段時(shí)期為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期至穩(wěn)定初期； 藻類發(fā)生光合作用時(shí)，電子經(jīng)過光系統(tǒng)II傳至光系統(tǒng)I，再傳遞給最終受體NADP+，當(dāng)藻受到營(yíng)養(yǎng)限制時(shí)，部分電子還會(huì)通過Mehler等［15］反應(yīng)再次回到PSI，從而產(chǎn)生熱耗散，使得ФPSⅡ降低為（0.293±0.018）； 同時(shí)NPQ增加，均值為（0.026± 0.001）； 在電子轉(zhuǎn)移和熱耗散的綜合作用下，F(xiàn)v/Fm為（0.462±0.008），較間歇1期低，與間歇2期無顯著差異。

稀釋率為0.01/d期。此時(shí)的模擬裝置開始進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，新鮮的培養(yǎng)液以稀釋率0.01/d進(jìn)入培養(yǎng)箱內(nèi)，小球藻生物量繼續(xù)累積，說明稀釋率小于藻類的生長(zhǎng)速率，此時(shí)Chl.a均值為（64.700±0.256）μg/L，為5個(gè)階段最大值； Fv/Fm與ФPSⅡ均值分別為（0.479±0.0176）和（0.346±0.003），較間歇3期升高； 該時(shí)期藻類幾乎不受到光抑制現(xiàn)象，光能絕大部分用于光合作用，熱耗散較低，故NPQ均值較低，為（0.024±0.003）。

稀釋率為0.03/d期，培養(yǎng)液以0.03/d稀釋速度進(jìn)入裝置，藻類開始被沖出培養(yǎng)箱，稀釋率大于藻類的生長(zhǎng)速率，Chl.a均值較0.01/d有所降低，為（54.700±5.517）μg/L； 由于該時(shí)期藻類亦不受光抑制，光和活性Fv/Fm、ФPSⅡ與NPQ的均值分別為（0.473±0.009）、（0.326±0.039）和（0.023±0.002），較稀釋率0.01/d時(shí)期無顯著差異。

有室內(nèi)實(shí)驗(yàn)探究環(huán)境變化對(duì)蛋白核小球藻和銅綠微囊藻光合作用的影響時(shí)，藻類的光合作用曲線趨勢(shì)與本實(shí)驗(yàn)一致［16，17］，當(dāng)藻類受到光照、溫度或營(yíng)養(yǎng)鹽限制時(shí)，光系統(tǒng)II均會(huì)遭到破壞，光合反應(yīng)活動(dòng)中心類囊體膜上電子傳遞速率降低，導(dǎo)致實(shí)際量子產(chǎn)量ФPSⅡ也降低，同時(shí)細(xì)胞的ATP合成受阻，在光合作用下降的同時(shí)，藻類為了避免過多能量損傷細(xì)胞，會(huì)啟動(dòng)自我保護(hù)機(jī)制，將過多的能量以熱耗散的形式降低，NPQ值增高。

2.3 模擬裝置內(nèi)小球藻細(xì)胞內(nèi)C、N、P的變化

C、N、P是藻類的主要組成元素。C是細(xì)胞的骨架元素，也是構(gòu)成藻類細(xì)胞內(nèi)葉綠素a和碳水化合物的主要組成元素。不少國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究表明［18，19］藻細(xì)胞內(nèi)C與葉綠素a之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系。N和P是生物體必須的基本元素，N的主要去處是合成藻類蛋白質(zhì)以及一系列參與催化作用的酶，P是核酸、生物膜和ATP等大分子物質(zhì)的重要組成成分，C、N、P對(duì)藻類的光合作用、呼吸作用和酶調(diào)節(jié)等方面均起重要作用。在小球藻培養(yǎng)過程中，模擬裝置內(nèi)小球藻細(xì)胞C、N、P的變化如表 2所示。

從表 2可以看出，模擬裝置運(yùn)行過程中，細(xì)胞碳的吸收總體趨勢(shì)是上升的，這是由于隨著細(xì)胞的分裂增殖，Chl.a以及碳水化合物等大分子物質(zhì)合成需求較高，故而對(duì)C的需求也較高。

表 2 模擬裝置內(nèi)小球藻細(xì)胞內(nèi)C、N、P的變化Tab.2 Values of CellC，CellN，CellP of Chlorella during chemostat running

細(xì)胞N、P的變化趨勢(shì)與細(xì)胞C有一定的差異。Ketchum［20］在研究硅藻對(duì)水體中N、P營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收時(shí)發(fā)現(xiàn)藻細(xì)胞內(nèi)普遍存在“營(yíng)養(yǎng)庫(kù)”，即在合適條件下可過量?jī)?chǔ)存某些營(yíng)養(yǎng)元素，當(dāng)環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)物濃度較低時(shí)，過量積累在藻細(xì)胞內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以維持藻類繼續(xù)分裂增殖，緩解藻類種群數(shù)量因外界環(huán)境營(yíng)養(yǎng)物的缺乏而產(chǎn)生較大動(dòng)蕩。在本實(shí)驗(yàn)中小球藻在饑餓培養(yǎng)后歷經(jīng)間歇1期的調(diào)整期，到間歇2期前對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期時(shí)，細(xì)胞內(nèi)N、P含量迅速升高，這是由于在此期間Chl.a含量較低，營(yíng)養(yǎng)相對(duì)較為充分，藻細(xì)胞快速吸收并存儲(chǔ)過量的N、P。到了間歇3期，由于藻生物量的不斷增長(zhǎng)，此時(shí)期的Chl.a均值為間歇培養(yǎng)期中最大值，水體中營(yíng)養(yǎng)物的濃度不能充分維持小球藻生長(zhǎng)，藻細(xì)胞的生長(zhǎng)開始受到抑制，細(xì)胞內(nèi)N和P的含量，這時(shí)藻開始消耗細(xì)胞內(nèi)存儲(chǔ)的N、P，故該時(shí)期細(xì)胞內(nèi)N、P含量開始降低，此期間胞內(nèi)N、P含量達(dá)到最小值（圖10）。Janse等［21］研究表明藻類對(duì)N、P的吸收速率與細(xì)胞內(nèi)N、P累積量有關(guān)，細(xì)胞內(nèi)N、P含量越低，吸收速率越大。本文中稀釋率0.01/d期，模擬裝置開啟連續(xù)運(yùn)行，新培養(yǎng)液的流入，營(yíng)養(yǎng)鹽限制得到緩解，藻細(xì)胞又開始吸收儲(chǔ)存N、P營(yíng)養(yǎng)物，細(xì)胞內(nèi)N、P含量較間歇3期大幅上升，但略低于間歇2期，Chl.a濃度也小幅度上升，達(dá)到5個(gè)時(shí)期的最大值。稀釋率0.03/d，Chl.a值最終維持在45 μg/L左右，藻內(nèi)N、P含量但與間歇3期，與稀釋率0.01/d期相差不大。

培養(yǎng)期間小球藻細(xì)胞內(nèi)CellN/CellP變化范圍在6—23。Klausmeier等［22］人指出藻類在營(yíng)養(yǎng)鹽充裕條件下達(dá)到最大生長(zhǎng)速率時(shí)細(xì)胞內(nèi)CellN/CellP為最優(yōu)N/P，當(dāng)藻類受光照或營(yíng)養(yǎng)鹽等限制時(shí)，該值下降。模擬裝置運(yùn)行期間，間歇2期小球藻的生長(zhǎng)速率達(dá)到最大值，該時(shí)期的N/P為小球藻在該生境下能達(dá)到的最優(yōu)氮磷比，為22.77； 間歇3期，此時(shí)的Chl.a濃度為間歇培養(yǎng)期中 最大值，藻類生長(zhǎng)受到營(yíng)養(yǎng)鹽限制時(shí)，細(xì)胞為了維持生長(zhǎng)，開始消耗內(nèi)源氮磷營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而在營(yíng)養(yǎng)鹽受限的條件下，胞內(nèi)N比P消耗快，CellN/CellP下降，這與國(guó)外許多研究的結(jié)果是一致的［23，24］。到了稀釋率0.01/d期，新培養(yǎng)液的流入，營(yíng)養(yǎng)鹽得到了補(bǔ)充，藻細(xì)胞內(nèi)N/P比上升，Chl.a濃度小幅度上升。0.03/d期是chla濃度略低于0.01/d期，N/P比與0.01/d期相差不大 ，遠(yuǎn)高于間歇3期。

圖 10 培養(yǎng)期間CellN/CellP變化

綜上可以發(fā)現(xiàn)，在藻生物量積累過程中，Chl.a濃度不斷增大，水體中營(yíng)養(yǎng)鹽的含量逐漸降低，以至不能充分維持藻細(xì)胞的增長(zhǎng)，藻會(huì)開始通過消耗內(nèi)源存儲(chǔ)的營(yíng)養(yǎng)鹽來維持期生長(zhǎng)繁殖，此時(shí)藻類細(xì)胞內(nèi)N、P含量和N/P比迅速降低。然而，細(xì)胞內(nèi)源物質(zhì)也消耗殆盡時(shí)，在沒有外源營(yíng)養(yǎng)鹽加入的情況下持續(xù)一段時(shí)間，藻細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入衰亡期。也就是說，在藻類快要進(jìn)入負(fù)增長(zhǎng)期前，細(xì)胞內(nèi)N、P含量和N/P持續(xù)下降，在降到某一個(gè)值時(shí)，我們把這個(gè)值處稱為拐點(diǎn)，營(yíng)養(yǎng)鹽嚴(yán)重的限制了藻的生長(zhǎng)，藻細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入衰亡期。

野外藻類水華的形成是由適宜的光照、溫度以及水體中充裕的營(yíng)養(yǎng)鹽等原因造成，隨著藻類大量生長(zhǎng)繁殖，水體中營(yíng)養(yǎng)鹽的含量逐漸降低，當(dāng)藻類細(xì)胞內(nèi)氮磷等營(yíng)養(yǎng)元素開始降低時(shí)，說明此時(shí)水體的營(yíng)養(yǎng)鹽含量已經(jīng)無法維持藻類的生長(zhǎng)，藻類需通過消耗細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存的內(nèi)源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)維持其生長(zhǎng)繁殖，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)源物質(zhì)也消耗殆盡時(shí)，水體水華開始消退。因此監(jiān)控藻類生物量富集過程中細(xì)胞內(nèi)氮磷下降的“拐點(diǎn)”和細(xì)胞內(nèi)元素比例變化可為預(yù)測(cè)水華消退的提供一定的參考依據(jù)。

3 結(jié)論

（1）調(diào)整期，藻生長(zhǎng)不受生境光熱、營(yíng)養(yǎng)鹽限制，小球藻光合活性較強(qiáng)； 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期，藻類開始受到光抑制現(xiàn)象，光合活性下降，熱耗散增加，同時(shí)藻進(jìn)行胞內(nèi)N、P儲(chǔ)存，胞內(nèi)N、P、N/P較高； 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期和穩(wěn)定期，水體中營(yíng)養(yǎng)鹽不足以維持藻生長(zhǎng)，藻開始消耗胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，N、P、N/P均下降，藻同時(shí)受光抑制和營(yíng)養(yǎng)鹽抑制； 連續(xù)培養(yǎng)期時(shí)，稀釋率為0.01/d時(shí)細(xì)胞豐度最大，營(yíng)養(yǎng)鹽限制得到緩解，小球藻光合活性又開始升高，同時(shí)藻細(xì)胞對(duì)N、P營(yíng)養(yǎng)物吸收能力增強(qiáng)。（2）在小球藻生物量積累過程中，生境資源隨著生物量的增大而不斷減少，當(dāng)光熱或營(yíng)養(yǎng)物條件受限時(shí)，藻類光合活性下降，細(xì)胞內(nèi)N、P含量亦協(xié)同發(fā)生變化。因此，監(jiān)控藻類生物量積累過程中氮磷下降的“拐點(diǎn)”和細(xì)胞內(nèi)元素比例變化可為預(yù)測(cè)水華消退提供一定的參考依據(jù)。（3）為進(jìn)一步探索水華的形成、消退和維持機(jī)制，可多選取藻種，通過模擬裝置設(shè)置不同的生境梯度進(jìn)行藻生物量積累的過程模擬。

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PRELIMINARY RESEARCH ON CULTIVATED SIMULATION OF CHLORELLA UNDER AXENIC CULTURE

WANG Shu1，XIAO Yan2，3，LI Zhe2，3，ZHANG Li-Ping1and GUO Jin-Song2，3
（1.Faculty of Urban Construction and Environmental Engineering，Chongqing University，Chongqing 400044，China； 2.Chongqing Institute of Green and Intelligent Technology，Chinese Academy of Sciences，Chongqing 400714，China； 3.State Key Laboratory of Water Resources and Hydropower Engineering Science，Chongqing 400714，China）

Abstract:The current study explored physiological characteristics of Chlorella cultivated under axenic culture in the designed simulator with a set of optimized parameters，including light intensity，temperature and nutrient concentrations，by mainly measuring intracellular contents of C，N，P and photosynthesis fluorescent parameters.The experiment employed the “Batch culture+ Continuous culture” cultivated mode to simulate the formation of algal bloom，and the cultivation period was divided into five phases according to the growth curve.Results showed that Chlorella had highly photosynthetic activity，and the growth was not inhibited by light intensity，temperature and nutrient concentration during adjustment phase.While in exponential phase，the growth of Chlorella was inhibited by light intensity，and heat dissipation was enhanced and intracellular contents of C，N and C/N ratio were high.At stable period，Chlorella was simultaneously inhibited by light intensity and nutrient concentration，and intracellular contents of N，P and N/P ration decreased.In continuous culture phase，when nutrient limitation was mitigated，both photosynthetic activity and the nutrient absorption ability of Chlorella were enhanced.This implied that monitoring the “turning point” of intracellular nutrients and changes in intracellular element ratio provided a reference basis on the study of the formation，persistence and fade of algal bloom.

Key words:Algal bloom； Biomass accumulation； Chlorella； Physiological characteristics

中圖分類號(hào)：Q94-331

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3207（2016）03-0580-09

doi:10.7541/2016.78

收稿日期：2015-07-10；

修訂日期：2015-12-11

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（51309220）； 重慶市基礎(chǔ)科學(xué)和前沿技術(shù)研究專項(xiàng)重點(diǎn)項(xiàng)目（cstc2015jcyjBX0006）資助［Supported by the National Natural Science Foundation of China（No:51309220）； the Chongqing Natural Science Program（cstc2015jcyjBX0006）］

作者簡(jiǎn)介：王舒（1990—），女，廣西桂林人； 碩士研究生； 主要研究方向?yàn)樵孱悓W(xué)。E-mail:Wangshu2008Y@hotmail.com

通信作者：肖艷，E-mail:yxiao@cigit.ac.cn