吳 湘吳 昊鐘 斌葉金云（.湖州師范學院生命科學學院，浙江省水生生物資源養(yǎng)護與開發(fā)技術研究重點實驗室，湖州 33000； .湖州市環(huán)境保護監(jiān)測中心站，湖州 33000）

大漂提取物抑制銅綠微囊藻的試驗研究

吳 湘1吳 昊2鐘 斌1葉金云1
（1.湖州師范學院生命科學學院，浙江省水生生物資源養(yǎng)護與開發(fā)技術研究重點實驗室，湖州 313000； 2.湖州市環(huán)境保護監(jiān)測中心站，湖州 313000）

摘要：為了確定高效脫氮除磷的水生漂浮植物大漂的主要化感活性物質，本文通過乙醇超聲波提取獲得大漂的化感粗提物，利用溶劑萃取法從粗提物中分離得到4種能抑制銅綠微囊藻（FACHB-911）生長的化感萃取物，當其濃度均為0.1 g/L時共培養(yǎng)5d后抑藻率分別為40%、69%、40%、35%。將抑藻率最高的化感萃取物通過酸性氧化鋁柱層析法進一步分離純化，分離得到4組抑藻作用較弱的（5d后抑藻率分別為12%、11%、33%、41%）和1組抑藻作用較強的化感層析流分（5d后抑藻率高達80%）。將抑藻作用最強的化感層析流分通過氣相色譜-質譜聯(lián)用（GC-MS）方法進行成分檢測，發(fā)現大漂提取物中含有對甲苯磺酸甲酯、硬脂酸酰胺兩種具有化感潛力的化合物。

關鍵詞：大漂； 提取分離； 化感作用； 銅綠微囊藻； 生長抑制

近年來，水生植物化感作用已廣泛應用于富營養(yǎng)化水體藻類控制領域，相關研究受到國內外專家的普遍關注［1—3］。抑藻水生植物普遍存在于水體中，容易獲得、栽種或移植，且數量豐富。它們一方面能吸收水體中的營養(yǎng)物質，為水中營養(yǎng)物質提供輸出的渠道； 另一方面它們能夠分泌抑制藻類生長的化感物質，起到修復、凈化富營養(yǎng)化水體的作用［4，5］?；形镔|是水生植物生長過程中產生的次生代謝物質，一般能在自然條件下降解，不會在生態(tài)系統(tǒng)中長期積累，生態(tài)安全性好［6，7］。因此通過研究開發(fā)高效專一的化感物質除藻劑，可為湖泊富營養(yǎng)化的生態(tài)治理探索切實可行的方法。

目前利用水生植物化感作用控制藻類，主要集中于沉水植物［8—10］，挺水植物［11，12］，而對漂浮植物的研究多集中于鳳眼蓮［13］、浮萍［14］等較常見的種類。因此本實驗擬選用的研究對象是具有高效脫氮除磷的漂浮栽培植物大漂［15］（Pistia stratiotes Linn.），大漂系天南星科大漂屬植物，又名大藻、浮萍、水浮蓮。水浮蓮味淡微辛，性平，無毒（根有微毒），既可以作為一種美化園林景觀的植物，也可以作為家畜家禽的優(yōu)選飼料。而銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）作為藍藻水華最常見的優(yōu)勢種，對其進行有效抑藻物質的開發(fā)和研究非常有必要。因此，利用大漂化感物質控制銅綠微囊藻生長并加以妥善處理和資源化利用，既可達到有效防控藍藻水華污染的目的，又能產生一定的經濟效益，從而實現水污染治理的良性循環(huán)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大漂:采自本地鄉(xiāng)村河道，挑選生長健康、大小均一的植株進行預培養(yǎng)。

銅綠微囊藻（FACHB-911）:購自中國科學院水生生物研究所。實驗前采用BG-11培養(yǎng)基預培養(yǎng)銅綠微囊藻，使之處于對數增長期。

1.2 試驗設置與方法

大漂化感粗提物的制備 稱取50 g大漂（洗凈后60℃，干燥48h，粉碎至50目），放置于燒杯中，加入100 mL無水乙醇進行超聲波提取。提取結束后，用0.22 μm有機系濾膜過濾雜質，后通過旋轉蒸發(fā)（100 r/min，85℃）除去溶劑，得到浸膏。

大漂化感粗提物的萃取分離 提取得到的浸膏依次用乙酸乙酯、正己烷、石油醚（30—60℃）萃取，每種溶劑各萃取3次，合并萃取液，分別得到乙酸乙酯相（Ethyl acetate phase，簡寫EAP）、正己烷相（n-hexane phase，簡寫NHP）、石油醚相（Mineral ether phase，簡寫MEP）、水相（Water phase，簡寫WP），然后將各有機相和水相旋轉濃縮，再用0.22 μm微孔濾膜進行過濾，去除固體顆粒物，得到純凈濃縮液。各濃縮液用二甲基亞砜（DMSO）定容（DMSO濃度小于1%對銅綠微囊藻生長無影響［16］），在無菌條件下，通過0.22 μm有機系濾膜除去微生物于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

大漂最佳抑藻化感萃取相的選擇 葉綠素a檢測法:在無菌條件下，培養(yǎng)皿中倒入含2%瓊脂的BG-11培養(yǎng)基，冷卻后切割成31 mm的小圓，放入一張30 mm的濾紙，于濾紙中央滴加200 μL處于對數生長期的藻液，加入一定量的已定容好的有機相和水相，濃度為0.10 g/L密封。在溫度為25℃，光照強度為40—60 μmol/（m2·s），光暗比為14h∶10h的人工氣候室中培養(yǎng)，3d后測定濾紙片上葉綠素a［17］的含量，每個提取物做3個平行； 培養(yǎng)液檢測法:采用培養(yǎng)液法，培養(yǎng)液混合體積為100 mL。其中包括一定體積的處于對數生長期的藻液及一定體積的有機相和水相，每個萃取物設定3個平行，在溫度為25℃，相對濕度為75%，光照強度為40—60 μmol/（m2·s），光暗比為14h∶10h的人工氣候室中培養(yǎng)，每隔兩天計數1次。采用顯微鏡計數法測定培養(yǎng)液的藻細胞密度變化。

大漂最佳抑藻化感萃取相的分離提純 將大漂最佳抑藻化感萃取物進行柱層析法分離:采用Φ=26 mm，h=300 mm 層析柱，以40 g 酸性氧化鋁（100—200目）干法裝柱，加入待分離液1 mL（含有100 mg樣品），進行階段洗脫。每種洗脫劑體積都為40 mL，洗脫劑種類分為:W1（石油醚∶乙酸乙酯= 100∶0，體積比，以下均如此）、W2（石油醚∶乙酸乙酯=70∶30）、W3（石油醚∶乙酸乙酯=50∶50）、W4（石油醚∶乙酸乙酯=30∶70）、W5（石油醚∶乙酸乙酯=0∶100）。每種洗脫劑加入層析柱后可以收集到一組洗脫流分，每組流分都進行蒸干、稱重，用一定量的DMSO定容，將每組流分的DMSO溶液進行編號（W1、W2、W3、W4、W5）。

大漂最佳抑藻化感層析流分的確定 將各層析流分（W1、W2、W3、W4、W5）分別以一定的濃度投放到100 mL的銅綠微囊藻培養(yǎng)液中，每個流分和對照組均設3個平行。將上述培養(yǎng)混合液置于溫度25℃，相對濕度75%，光照強度40—60 μmol/（m2·s），光暗時間比為14h∶10h的人工氣候箱中培養(yǎng)，每隔兩天計數一次，以確定其抑藻活性。W0為空白組，不添加任何層析流分。根據藻密度的變化，確定對銅綠微囊藻生長抑制作用最好的大漂化感層析流分。同時利用含攝像裝置的倒置顯微鏡（Motic）觀察銅綠微囊藻在最佳抑藻化感層析流分影響下細胞形態(tài)的變化。

大漂最佳抑藻化感層析流分組成的初步鑒定

利用氣相色譜-質譜聯(lián)用（GC-MS）方法對大漂最佳抑藻化感層析流分進行主要組成的初步檢測鑒定，從而明確大漂提取物中的有效抑藻成分。

1.3 數據統(tǒng)計與分析

根據藻密度計算大漂化感萃取相和層析流分對銅綠微囊藻的相對抑制率，計算公式為:

IR（%）=（1 - N/N0）× 100%

式中IR 為相對抑制率，N 為處理組的藻密度（個/ mL），N0為空白對照組藻密度（個/mL）。所有樣品平行測定3次，結果取其均值。數據采用Excel2007軟件進行統(tǒng)計、分析和制圖。

2 結果與討論

2.1 大漂最佳抑藻化感萃取相的選擇

圖 1 大漂化感萃取相對銅綠微囊藻葉綠素a含量的影響

圖 1表明大漂4種化感萃取相對銅綠微囊藻葉綠素a含量的影響，圖 2為加入各萃取相后銅綠微囊藻的藻密度及其相對抑制率的變化。由圖 1可知，共培養(yǎng)3d后各組大漂化感萃取相處理組中，藻細胞葉綠素a含量均出現不同程度的下降，其中乙酸乙酯相處理組的葉綠素a含量下降最多，第3天比第0天下降了66%。正己烷相處理組的葉綠素a含量下降最少，但也達到了38%，可見各種大漂抑藻化感萃取相對銅綠微囊藻葉綠素a含量都有較好的削減作用，而葉綠素a含量主要受光合作用的影響，說明大漂抑藻化感萃取相可以通過影響藻細胞的光合作用，從而抑制藻細胞的正常生長。

根據圖 2可知，大漂的4種化感萃取相對銅綠微囊藻的細胞增殖均有一定的抑制作用，藻密度雖有增加但是明顯低于空白對照組，第3天各組的IR%達到37%—44%，且各組間差異不顯著。而在第5天各萃取相的IR%相差較為明顯，其中乙酸乙酯相對藻細胞生長的抑制作用最強，IR%達到70%，而其余3組的IR%相差不大，介于35%—40%。綜合圖 1和圖 2可以發(fā)現，大漂提取物的乙酸乙酯萃取相對銅綠微囊藻葉綠素a和藻密度的抑制效果均為最佳，表現出較好的抑藻活性，但是其中的有效抑藻化感成分仍需進一步分離純化。

2.2 大漂最佳抑藻化感層析流分的選擇

大漂化感粗提物中抑藻作用最強的乙酸乙酯萃取相經酸性氧化鋁柱層析可以得到5個流分，各流分均以一定的濃度用于抑藻活性檢測。圖 3為投加各層析流分后銅綠微囊藻的生長及抑制率曲線。由圖 3可知，流分W2對藻細胞生長基本無影響，流分W1、W3、W4和W5均具有抑藻活性。流分W1在第2至第4天內表現出一定的抑藻作用，但是第5天藻細胞即開始恢復正常生長，其原因可能是流分W1中的有效抑藻物質隨著時間逐漸被降解，失去了抑藻活性。而流分W4和W5的抑藻效果在實驗期間表現較好，第5天的IR%分別可達45%和81%，尤其是流分W5，因此可確定其為大漂最佳抑藻化感層析流分，但是W5的具體組成仍有待進一步的分析和鑒定，以明確大漂提取物中的有效抑藻化感成分。

2.3 大漂最佳抑藻化感層析流分對藻細胞形態(tài)的影響

洪喻等［16］研究發(fā)現，銅綠微囊藻在投加蘆竹化感物質后啟動了多種拮抗途徑應對化感物質的脅迫，譬如藻細胞空洞化、色素減褪、細胞聚團、體積減小等。而根據本實驗的研究結果（圖 4A）同樣發(fā)現，在大漂最佳抑藻化感層析流分的脅迫下，銅綠微囊藻的藻細胞開始抱團縮小體積，推測這是由于藻細胞受到刺激，自發(fā)的一種自我保護機制。銅綠微囊藻細胞通常在人工培養(yǎng)條件下主要是以單細胞形式存在；而在自然條件下則主要是以群體形式存在［18］。野外采集到的微囊藻細胞經過純化后由群體型轉變?yōu)閱渭毎?9］。當微囊藻以單細胞存在時，在外界的環(huán)境的脅迫作用下導致藻細胞活性降低或死亡，而群體藻細胞則能抵御抑制作用，保持活力。因此，當化感物質作用于微囊藻細胞時，個體細胞聚集成群來抵御化感物質的抑制作用。而從圖4B中還能看出，在大漂最佳抑藻化感層析流分的作用下，銅綠微囊藻的藻細胞出現破碎現象，其破碎原因還有待進一步研究。

圖 2 大漂化感萃取相對銅綠微囊藻生長（藻密度）及抑制率的影響

圖 3 大漂抑藻化感層析流分對銅綠微囊藻生長（藻密度）及抑制率的影響

圖 4 大漂最佳抑藻化感層析流分對銅綠微囊藻藻細胞形態(tài)的影響（A.抱團； B.破壁）

2.4 大漂最佳抑藻化感層析流分組成的初步鑒定

根據圖 5分析，抑藻效果最佳的W5層析流分通過GC-MS方法分析鑒定，檢測出其中含有多種化合物。但是由于樣品純度不夠高，導致結果僅能鑒定出兩種主要的化合物，即22.9min時檢測出的對甲苯磺酸甲酯和32.105min時檢測出的硬脂酸酰胺。已有研究表明酯類酰胺類為常見植物化感物質類型［20］，故推測大漂層析流分中檢出的對甲苯磺酸甲酯和硬脂酸酰胺可能具有植物化感作用，而其余成分還需進一步地對樣品進行分離純化和檢測分析以獲得確認。

圖 5 GC-MS法檢測大漂最佳抑藻化感層析流分圖譜

3 結論

（1）利用不同有機溶劑對大漂粗提物依次進行萃取，結果表明，乙酸乙酯萃取相對銅綠微囊藻的生長抑制作用最明顯，5d后其抑藻率高達69%，由此可確定其為大漂最佳抑藻化感萃取相。

（2）將乙酸乙酯萃取相經酸性氧化鋁柱層析法分離得到5個層析流分，其中W5流分對銅綠微囊藻的生長抑制作用最強，5d后其抑藻率高達80%，由此可確定其為大漂最佳抑藻化感層析流分。

（3）大漂最佳抑藻化感層析流分中含有強極性的抑藻物質，通過GC-MS法檢測發(fā)現，大漂提取物中含有對甲苯磺酸甲酯和硬脂酸酰胺兩種具有抑藻化感潛力的組分，其余成分有待進一步分離純化和分析鑒定。

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EXPERIMENTAL STUDY ON THE INHIBITION EFFECT OF EXTRACTS FROM PISTIA STRATIOTES LINN.ON THE GROWTH OF MICROCYSTIS AERUGINOSA

WU Xiang1，WU Hao2，ZHONG Bin1and YE Jin-Yun1
（1.Zhejiang Province Key Laboratory of Aquatic Resources Conservation and Development，College of Life Sciences，Huzhou University，Huzhou 313000，China； 2.Huzhou Environmental Protection Monitoring Centre Station，Huzhou 313000，China）

Abstract:The current study obtained four different allelopathic crude extracts from Pistia stratiotes Linn，a aquatic floating plant with higher efficiency on nitrogen and phosphorus removal，using ethanol ultrasonic extraction.These four，allelopathic extracts（0.1 g/L）inhibited the growth of Microcystis aeruginosa（FACHB-911）for 40%，69%，40% and 35% after 5 days treatment，respectively.Extracts were further purified through the method of acidic alumina column chromatography separation，which had inhibition rates 12%，11%，33 and 41% after 5 days treatment，respectively.Interestingly，one group of allelopathic fraction had 80% inhibition rate after 5 days treatment.The results of gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）analysis revealed that the extracts from P.stratiotes mainly contained two antialgal compounds including P-toluene sulfonic acid methyl ester and stearic acid amide.

Key words:Pistia stratiotes Linn.； Extraction and separation； Allelopathy； Microcystis aeruginosa； Growth inhibition

中圖分類號：X 52； Q 946

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3207（2016）03-0547-05

doi:10.7541/2016.73

收稿日期：2015-05-11；

修訂日期：2015-11-03

基金項目：國家自然科學基金青年科學基金項目（21207036）； 湖州市生態(tài)文明先行示范區(qū)科技專項重點項目（2014ZD2019）； 浙江省自然科學基金青年科學基金項目（LQ12B07001）； 浙江省重大科技專項重大農業(yè)項目（2014C02011）資助［Supported by National Natural Science Foundation of China（21207036）； Key Project of Science and Technology Special Projects on Demonstration Area of Ecological Civilization of Huzhou City（2014ZD2019）； Natural Science Foundation of Zhejiang Province（LQ12B07001）；Significant Agricultural Projects of Major Science and Technology Projects of Zhejiang Province（2014C02011）］

通信作者：吳湘（1981—），女，浙江東陽人； 博士，副教授； 主要從事利用植物化感作用控制藻類研究。E-mail:wwxx1981@126.com