李文婧， 陶　妍

(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306)

大西洋庸鰈(HippoglossushippoglossusL.)hipposin抗菌肽在畢赤酵母中的表達(dá)及其純化

李文婧， 陶妍

(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306)

摘要Hipposin是大西洋庸鰈(Hippoglossus hippoglossus L.)組蛋白H2A的N端衍生物，共含51個(gè)氨基酸殘基，具有抑制革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌的活性。根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛(ài)性對(duì)編碼hipposin的cDNA(hip)進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并在5′端添加信號(hào)肽酶kex 2識(shí)別位點(diǎn)的編碼序列、3′端添加6×His標(biāo)簽編碼序列，兩個(gè)末端分別添加X(jué)ho I和Xba I酶切位點(diǎn)，與表達(dá)載體pPICZαA構(gòu)建重組表達(dá)載體pPICZαA-hip；電轉(zhuǎn)至畢赤酵母X-33中，經(jīng)Zeocin篩選以及對(duì)酵母基因組DNA的PCR鑒定，獲得高拷貝酵母轉(zhuǎn)化子；將其在30℃，250 r/min培養(yǎng)，使用1%的甲醇誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白；采用固化金屬離子親和層析(IMAC)純化目的蛋白。培養(yǎng)96 h時(shí)目的蛋白的表達(dá)量最高；Western Blot分析顯示，表達(dá)產(chǎn)物能與His單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)；培養(yǎng)上清經(jīng)純化后獲得高純度的重組體HIP，但發(fā)現(xiàn)部分產(chǎn)物被蛋白酶降解。研究結(jié)果為hipposin抗菌肽的擴(kuò)大制備奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞大西洋庸鰈；Hipposin抗菌肽；畢赤酵母；重組DNA表達(dá)

抗菌肽(Antimicrobial peptide，AMP)是生物防御外來(lái)病原微生物時(shí)在體內(nèi)迅速合成的具有免疫抗菌活性的肽類(lèi)物質(zhì)，對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒等均有殺傷作用，是機(jī)體天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分[1-3]?？咕木哂薪Y(jié)構(gòu)和活性穩(wěn)定、不易產(chǎn)生耐藥性、無(wú)藥物殘留等優(yōu)點(diǎn)，進(jìn)而受到越來(lái)越廣泛的關(guān)注。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，有些抗菌肽的氨基酸序列與組蛋白高度相似，這類(lèi)抗菌肽是在某種機(jī)制作用下由生物體內(nèi)的組蛋白降解而分泌的。這種組蛋白衍生抗菌肽在低等水生動(dòng)物、兩棲動(dòng)物和爬行動(dòng)物等體內(nèi)廣泛存在并發(fā)揮重要的作用[4-6]。就魚(yú)類(lèi)組蛋白衍生抗菌肽的研究而言，Jorge等[7]從虹鱒(Oncorhynchusmykiss)的表皮黏液中分離得到Oncomyncin II，分子質(zhì)量為7.2 ku，它是由組蛋白H1的C端69個(gè)氨基酸殘基組成，對(duì)滕黃微球菌(Micrococcusluteus)和檸檬色游動(dòng)球菌(Planococcuscitreus)等革蘭氏陽(yáng)性菌及大腸桿菌(Escherichiacoli)和鰻利斯頓氏菌(Listonellaanguillarum)等革蘭氏陰性菌有抑菌活性，且沒(méi)有溶血作用；Park等[8]從鯰魚(yú)的皮膚黏膜中分離到具有較強(qiáng)抑菌活性的多肽，將其稱(chēng)為Parasin I，它的氨基酸序列與組蛋白H2A的N端完全一致；Bergsson等[9]從大西洋鱈魚(yú)的皮膚黏液中得到與組蛋白H2B非常相似的13.6 ku的多肽，它對(duì)巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、白色念珠球菌(Moniliaalbican)和大腸桿菌等都有較強(qiáng)的抑菌作用。

Hipposin抗菌肽是大西洋庸鰈(HippoglossushippoglossusL.)組蛋白H2A的N端衍生物，由Birkemo等[10]在大西洋庸鰈皮膚黏液中分離得到，它含有51個(gè)氨基酸殘基，等電點(diǎn)12.23，分子質(zhì)量5.4 ku，含α螺旋和較多的無(wú)規(guī)則卷曲；hipposin的51個(gè)氨基酸殘基中含有15個(gè)堿性氨基酸，無(wú)酸性氨基酸；天然hipposin的N端是被乙?；?，但研究顯示人工合成的N端非乙?；膆ipposin與天然hipposin之間在抑菌活性上并無(wú)差別；此外，研究發(fā)現(xiàn)，hipposin的N端第1至39號(hào)氨基酸殘基組成的片段的活性要強(qiáng)于第1至36號(hào)的，而第16至36號(hào)的要強(qiáng)于第1至19號(hào)的[11]。最近研究發(fā)現(xiàn)，hipposin的作用機(jī)制主要是通過(guò)改變細(xì)胞膜的通透性殺死細(xì)菌，而N端區(qū)域的存在會(huì)促進(jìn)對(duì)細(xì)胞膜的通透作用；hipposin的C端部分是一種穿膜肽，可進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞內(nèi)核酸發(fā)生作用[12]。雖然在2003年Birkemo等[11]已分離純化出有活性的天然hipposin，并測(cè)定出其核苷酸序列，但迄今為止，關(guān)于它的重組DNA表達(dá)方面的研究仍屬空白。據(jù)此，本研究以大西洋庸鰈hipposin為研究對(duì)象，參考編碼hipposin的天然cDNA序列，根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏愛(ài)性對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化合成，與表達(dá)載體pPICZαA連接構(gòu)建真核重組表達(dá)載體，以畢赤酵母X-33為工程菌進(jìn)行重組DNA表達(dá)，并通過(guò)固化金屬離子親和層析(IMAC)對(duì)其進(jìn)行純化，以期建立大西洋庸鰈來(lái)源的重組體hipposin的基因工程制備方法。

1材料與方法

1.1質(zhì)粒、菌種和試劑

表達(dá)載體pPICZαA和畢赤酵母菌X-33均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。XhoI、XbaI和SacI限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自日本TaKaRa公司；質(zhì)粒小提試劑盒、酵母基因組提取試劑盒、DNA分子量marker、Western Blot試劑盒購(gòu)自北京天根生物科技有限公司；Zeocin購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；酵母粉、胰蛋白胨購(gòu)自英國(guó)OXOID公司；抗His標(biāo)簽鼠單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG (H+L)、10×TBS-T購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技公司；蛋白質(zhì)分子量marker購(gòu)自北京中科瑞泰生物科技有限公司；Bio-Scale Mini Profinity IMAC Cartridges購(gòu)自美國(guó)Bio Rad公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2Hipposin基因的優(yōu)化合成

參考編碼hipposin的天然cDNA序列(hip)，根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛(ài)性對(duì)其進(jìn)行密碼子優(yōu)化，同時(shí)在5′端添加X(jué)hoI和信號(hào)肽酶切位點(diǎn)的編碼序列，3′端添加X(jué)baI和6×His標(biāo)簽的編碼序列，優(yōu)化后的hip由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3重組表達(dá)載體pPICZαA-hip的構(gòu)建及陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定

將合成的hip與pPICZαA連接構(gòu)建真核重組表達(dá)載體pPICZαA-hip，將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，在含25 μg/mL Zeocin的低鹽LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)約16 h，離心得到菌體后用質(zhì)粒小提試劑盒提取重組表達(dá)載體pPICZαA-hip；通過(guò)雙酶切和DNA測(cè)序考察其是否構(gòu)建成功；對(duì)篩選到的pPICZαA-hip進(jìn)行SacI線性化處理，電轉(zhuǎn)至畢赤酵母X-33后，加入600 μL預(yù)冷的1 mol/L山梨醇，30℃靜置1～2 h，涂布于含100 μg/mL Zeocin的YPDS培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)至產(chǎn)生單菌落。

選取長(zhǎng)勢(shì)良好的單菌落，提取其酵母基因組DNA為模板，采用pPICZαA上的通用引物5′AOX1(5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′)和3′AOX1(5′-GGCAAATGGCATTCTGACATCCT -3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)目的條帶，同時(shí)以空載體pPICZαA作為對(duì)照。

1.4在畢赤酵母中甲醇誘導(dǎo)表達(dá)HIP及Tricine-SDS-PAGE分析

選取篩選到的酵母轉(zhuǎn)化子，接種于BMGY液體培養(yǎng)基中，30℃，250 r/min培養(yǎng)至D600 nm=2～6，離心收集菌體，用滅菌水清洗2次后再用BMMY培養(yǎng)基清洗一次，離心后用BMMY液體培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至D600 nm為1.0，用1%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)120 h；每隔24 h取樣用以Tricine-SDS-PAGE分析，濃縮膠、夾層膠和分離膠濃度分別為4%、10%和16.5%，Tricine濃度為0.1 mol/L，SDS濃度為1%。

1.5Western Blot分析

將經(jīng)Tricine-SDS-PAGE分離后的蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，將其與封閉液(5%脫脂奶粉)在室溫下反應(yīng)1 h，與抗His標(biāo)簽鼠單克隆抗體孵育2 h，1×TBS-T漂洗后，再與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG (H+L)孵育1 h，再用1×TBS-T漂洗后，用DAB顯色液顯色。

1.6重組體HIP的固化金屬離子親和層析(IMAC)純化

上述通過(guò)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)的酵母培養(yǎng)液經(jīng)離心后得到的上清用0.22 μm濾膜處理后，采用Profinia蛋白純化系統(tǒng)，經(jīng)Ni2+柱(Bio-Scale Mini Profinity IMAC Cartridges)和梯度咪唑捕獲目的蛋白，再通過(guò)透析脫去鹽離子，獲得純化的重組體HIP。

2結(jié)果

2.1構(gòu)建的重組表達(dá)載體pPICZαA-hip及其鑒定結(jié)果

將密碼子優(yōu)化后的含XhoI和XbaI酶切位點(diǎn)的hip(圖1a)與經(jīng)同樣酶處理過(guò)的pPICZαA連接，得到重組表達(dá)載體pPICZαA-hip(圖1b)。為了確定連接是否成功，使用XhoI和XbaI對(duì)pPICZαA-hip進(jìn)行雙酶切，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有大、小分子量的2個(gè)條帶，目的片段的分子量為195 bp，與理論相符(圖2a)。DNA測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步證明了目的片段hip與pPICZαA正確連接，未發(fā)生任何堿基突變。

2.2酵母陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選及其鑒定結(jié)果

經(jīng)SacI線性化的pPICZαA-hip電轉(zhuǎn)入畢赤酵母X-33后，在YPDS平板上長(zhǎng)出10個(gè)單菌落；分別提取這些酵母轉(zhuǎn)化子的基因組DNA，并以此為模板，使用pPICZαA上的通用引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出一條約691 bp的清晰條帶(圖2b)；而以含空載體pPICZαA的酵母基因組DNA為模板的PCR，擴(kuò)增到的條帶約589 bp；兩者均與理論值相符，證明pPIZαA-hip已成功整合進(jìn)酵母基因組中。

2.3HIP在畢赤酵母X-33中的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果

上述經(jīng)篩選鑒定后的酵母轉(zhuǎn)化子在BMMY液體培養(yǎng)基中，采用1%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)120 h，每24 h取樣用于Tricine-SDS-PAGE分析。由圖3可見(jiàn)，誘導(dǎo)表達(dá)48 h時(shí)在4.6 ku與10 ku之間開(kāi)始出現(xiàn)條帶，至96 h時(shí)濃度達(dá)到最高；目的蛋白HIP的理論分子質(zhì)量是6.5 ku，但圖中顯示并非單一條帶，可能由于部分目的蛋白被降解所致。而空載體在此位置未見(jiàn)任何條帶。

圖1 合成的hip(a)及其pPICZαA-hip重組表達(dá)載體的構(gòu)建(b)

單下劃線為XhoI和XbaI酶切位點(diǎn)；雙下劃線為Kex 2識(shí)別位點(diǎn)

圖2 重組表達(dá)載體pPICZαA-hip的雙酶切鑒定(a)及酵母轉(zhuǎn)化子基因組DNA的PCR鑒定(b)

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：雙酶切產(chǎn)物；2：含pPICZαA的轉(zhuǎn)化子；3：含有pPICZαA-hip重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化子

圖3 表達(dá)不同時(shí)間的培養(yǎng)液上清的Tricine-SDS-PAGE分析

M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：含pPICZαA的上清；2～7：含pPICZαA-hip的上清

2.4對(duì)重組體HIP的Western Blot分析結(jié)果

為了進(jìn)一步證明圖3顯示的條帶為重組體HIP，選擇表達(dá)96 h的培養(yǎng)液上清經(jīng)Tricine-SDS-PAGE分析后(圖4a)，使用抗His標(biāo)簽的抗體進(jìn)行了Western Blot分析。結(jié)果顯示，在4.6 ku與10 ku之間出現(xiàn)一條較寬的條帶(圖4b)，而空白對(duì)照并未出現(xiàn)此條帶，由此證明在上清中存在分泌表達(dá)的重組體HIP。

圖4 重組體HIP的Tricine-SDS-PAGE分析(a)和 Western Blot分析(b)

M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：含pPICZαA的上清；2：含pPICZαA-hip的上清

2.5重組體HIP的分離純化結(jié)果

重組體HIP的羧基端攜帶6×His標(biāo)簽，可與Ni2+特異性結(jié)合，通過(guò)固化金屬離子親和層析(IMAC)可將重組體HIP結(jié)合在Ni2+柱上，再用高濃度的咪唑進(jìn)行洗脫，便得到高純度的目的蛋白。Tricine-SDS-PAGE分析顯示，純化前的培養(yǎng)液上清除了在4.6 ku與10 ku之間顯示數(shù)個(gè)條帶之外，還存在大分子量的條帶；而純化后的產(chǎn)物只在4.6 ku與10 ku之間顯示條帶，證明純化目的已達(dá)到。單一性條帶未獲得的原因可能因目的蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定被部分降解所致(圖5)。

3討論

本研究首先根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏愛(ài)性對(duì)編碼大西洋庸鰈hipposin抗菌肽的cDNA進(jìn)行了優(yōu)化，確保了目的蛋白在畢赤酵母中的順利表達(dá)。選取pPICZαA作為真核表達(dá)載體，因其含有Zeocin抗性基因，可篩選獲得高拷貝轉(zhuǎn)化子；因pPICZαA含有AOX1啟動(dòng)子，能通過(guò)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白；此外，該表達(dá)載體在開(kāi)放閱讀框的前端帶有α-factor信號(hào)肽序列，可引導(dǎo)重組體HIP分泌到細(xì)胞外，方便了后續(xù)的分離純化[12，13]。Tricine-SDS-PAGE和Western Blot分析的結(jié)果證實(shí)了在本研究中上述這些目的都已達(dá)到。

圖5 純化的重組體HIP的Tricine-SDS-PAGE分析

M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：純化的重組體HIP；2：未純化的上清

關(guān)于在Tricine-SDS-PAGE和Western Blot分析中未出現(xiàn)單個(gè)條帶的問(wèn)題可能源于以下原因：目前為止報(bào)道的大多數(shù)重組體陽(yáng)離子抗菌肽如hepcidin、defensins和cathelicidin等均含有多個(gè)半胱氨酸殘基，在空間上可形成二硫鍵和反向平行的β折疊結(jié)構(gòu)，以保證它們的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，且不易被蛋白酶水解[14-16]。本研究的目的蛋白為hipposin，屬于組蛋白衍生物類(lèi)抗菌肽，來(lái)源于H2A，雖然在其N(xiāo)端含有豐富的堿性氨基酸而帶正電荷，但在它的一級(jí)結(jié)構(gòu)中不含半胱氨酸殘基，以致其空間結(jié)構(gòu)中不含二硫鍵，且多數(shù)為不規(guī)則卷曲，因此，導(dǎo)致了它在結(jié)構(gòu)上的不穩(wěn)定，在分泌表達(dá)的時(shí)候易被酵母自身的蛋白酶水解而出現(xiàn)多個(gè)條帶。在已有的研究報(bào)道中，具有抗菌活性的大多數(shù)組蛋白衍生抗菌肽是從生物機(jī)體中提取或人工合成的。而本研究中獲得的hipposin是在畢赤酵母細(xì)胞中通過(guò)重組DNA表達(dá)的外源蛋白，極有可能在表達(dá)過(guò)程中被宿主細(xì)胞中的蛋白酶降解。

本研究成功構(gòu)建了畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)，為組蛋白衍生抗菌肽或其他魚(yú)類(lèi)抗菌肽的基因工程制備奠定了基礎(chǔ)。進(jìn)一步的研究將聚焦于解決重組體HIP在表達(dá)過(guò)程中的蛋白酶降解問(wèn)題，初步考慮可采取以下方法進(jìn)行：1)在培養(yǎng)基中加入適量酪蛋白水解物或富含氨基酸物質(zhì)的蛋白胨，以此保護(hù)目的蛋白不被降解；2)調(diào)整培養(yǎng)基的pH值，以抑制蛋白酶的活性，避免培養(yǎng)基的pH值與目的蛋白的pI接近，防止目的蛋白沉淀；3)適當(dāng)加入幾種蛋白酶抑制劑；4)進(jìn)一步摸索誘導(dǎo)表達(dá)的時(shí)間，確定一個(gè)降解程度最低而產(chǎn)量較高的表達(dá)時(shí)間。

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Expression of Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus L.) hipposin antimicrobial peptide in Pichia pastoris and its purification

LI Wen-jing, TAO Yan

(Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing & Preservation,College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

AbstractHipposin is the N-terminal derivative of Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus L.) histone H2A with 51 amino acids, which has a good ability to inhibit gram-positive and gram-negative bacteria. The cDNA encoding hipposin (hip) was optimized and synthesized with reference to the codon preference of Pichia pastoris and its native cDNA sequence, respectively. In this synthesized fragment, nucleotides encoding recognition site for the enzyme (Kex2) cutting α-factor signal peptide and 6×His tag were added to 5′ and 3′ terminals, respectively, and Xho I and Xba I restriction sites were added to the both ends. This fragment was ligated with pPICZαA to construct the recombinant expression vector pPICZαA-hip. The pPICZαA-hip was transformed into P. pastoris X-33. The yeast transformants containing multicopy gene insertion were selected by using Zeocin, and identified by PCR for yeast genomic DNA. Expression was induced by adding 1% methanol at 30℃ and 250 r/min. Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) was used to purify the target protein. The most appropriate expression time was 96 h. Western Blot analysis demonstrated that the His monoclonal antibody could be specifically bound to expressed products. The highly purified target protein was obtained from the fermentation supernatant, but it was found that a part of the expressed product was hydrolyzed. The present results provide important initial values for preparation of hipposin by recombinant DNA expression.

Key wordsAtlantic halibut; hipposin antimicrobial peptide; Pichia pastoris; recombinant DNA expression

收稿日期：2015-09-15；修回日期：2015-10-12

基金項(xiàng)目：農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(南方)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題 (No. UA201307)資助；上海市教育委員會(huì)產(chǎn)學(xué)研合作項(xiàng)目(No. 15CXY30)

作者簡(jiǎn)介：李文婧，碩士研究生，研究方向?yàn)樗鷦?dòng)物分子生物學(xué)，E-mail: wenjingli111@163.com； 通信作者：陶妍，教授，研究方向?yàn)樗鷦?dòng)物分子生物學(xué)，E-mail：ytao@shou.edu.cn。

中圖分類(lèi)號(hào)Q78

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)2095-1736(2016)03-0015-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.03.015