朱　韜, 朱冬發(fā), 邱錫爾, 周彥琦, 柳志業(yè), 謝　熙

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院， 寧波 315211)

三疣梭子蟹fps克隆及其在卵巢發(fā)育中的表達(dá)分析

朱韜, 朱冬發(fā), 邱錫爾, 周彥琦, 柳志業(yè), 謝熙

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院， 寧波 315211)

摘要法尼基焦磷酸合成酶(FPS)是類異戊二烯生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，參與甲殼動物甲基法尼酯(MF)等萜類激素的合成。為研究FPS在甲殼動物卵巢發(fā)育中的調(diào)控作用，采用RT-PCR和cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE技術(shù))克隆得到了三疣梭子蟹fps(Ptfps)的序列全長(GenBank登錄號：KM013803)。結(jié)果顯示：Ptfps cDNA全長為2 360 bp，開放閱讀框長1 290 bp，編碼429個氨基酸。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)PtFPS具有7個異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的保守結(jié)構(gòu)域，與已公布的內(nèi)華達(dá)古白蟻FPS同源性最高(達(dá)到58%)。實時熒光定量PCR分析結(jié)果顯示：fps主要在大顎器(MO)中表達(dá)，遠(yuǎn)高于其它組織的表達(dá)水平 (P<0.01)；在第1次卵巢發(fā)育過程中， fps的表達(dá)水平在Ⅳ期顯著升高(P<0.05)，之后略有下降；在第2次卵巢發(fā)育過程中，fps的表達(dá)水平在Ⅲ期顯著升高(P<0.05)，并在IV期達(dá)到最大。以上結(jié)果表明fps可能參與三疣梭子蟹卵巢發(fā)育的調(diào)控。

關(guān)鍵詞三疣梭子蟹；法尼基焦磷酸合成酶；克??；卵巢發(fā)育；表達(dá)水平

法尼基焦磷酸合成酶(farnesyl diphosphate synthase，F(xiàn)PS)是一種異戊烯基轉(zhuǎn)移酶，催化牻牛兒基焦磷酸(geranyl pyrophophate，GPP)與異戊烯基焦磷酸(isopentenyl diphosphate，IPP)頭尾縮合生成法尼基焦磷酸(farnesyl pyrophophate，F(xiàn)PP)[1]。產(chǎn)物FPP是多種類異戊二烯物質(zhì)的前體化合物，包括長萜醇、泛醇、類固醇和其他異戊烯蛋白等[2]。與脊椎動物不同，甲殼動物和昆蟲在合成FPP后，由于缺乏羊毛脂固醇合成酶和鯊烯合成酶而無法合成膽固醇[3]，取而代之的是倍半萜類物質(zhì)。甲基法尼酯(methyl farnesoate，MF)就是FPP經(jīng)催化生成的一種重要的類倍半萜烯激素。從1958年起，科學(xué)家研究并證明了MF是昆蟲保幼激素Ⅲ(Juvenile hormone Ⅲ，JH Ⅲ)的前體類似物，其結(jié)構(gòu)和功能與之相似，在甲殼動物的蛻皮、變態(tài)、應(yīng)激性調(diào)節(jié)和卵巢發(fā)育等生理活動方面有重要作用[4]。

一般認(rèn)為昆蟲的JH是由咽側(cè)體(corpora allata，CA)合成后直接分泌進(jìn)入血淋巴的, 但也有研究報道其他器官參與JH的合成[5]?？茖W(xué)家們已經(jīng)在一些昆蟲中鑒定出了fps的編碼序列，包括球菜夜蛾(Agrotisipsilon)[6]、岡比亞按蚊(Anophelesgambiae)[2]等，且在CA中有大量表達(dá)[7]。水生甲殼動物的大顎器(mandibular organ，MO)與昆蟲CA同源[8]，均起源于外胚層，并且是MF合成和分泌的唯一場所[4]。此外，甲殼動物MO分泌的MF被認(rèn)為是一種性腺刺激激素，具有啟動和加速卵黃發(fā)生，促進(jìn)卵黃蛋白原(vitellogenin，Vg)合成的功能[9]。但是也有一些研究表達(dá)了不同的觀點：Abdu等[10]在對克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)的研究中發(fā)現(xiàn)高濃度的MF會導(dǎo)致其死亡；Medesani等[11]對紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)的研究表明，MF對肝胰腺中vg的表達(dá)沒有明顯的影響。MF對卵巢發(fā)育的調(diào)控作用還有待進(jìn)一步闡明。

FPS作為類異戊二烯合成途徑中的重要催化酶，已經(jīng)在許多生物中有所研究，但在甲殼動物中尚未有研究報道。本研究以三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)為材料，克隆獲得了三疣梭子蟹fps的全長cDNA序列，并運(yùn)用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR)對其在不同組織和卵巢發(fā)育過程中表達(dá)量的變化情況進(jìn)行了分析，旨在闡明fps在三疣梭子蟹卵巢發(fā)育中的調(diào)控作用，豐富和完善甲殼動物卵巢發(fā)育的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

野生三疣梭子蟹暫養(yǎng)于寧波市寧?？h得水育苗場，每日喂養(yǎng)鮮活蟶子。于2014年10月中旬，采集蛻皮間期雌性三疣梭子蟹(頭胸甲寬：14.8～16.3 cm；體質(zhì)量：166～254 g)的表皮、心臟、肝胰腺、Y器、大顎器、X器、卵巢和胸神經(jīng)節(jié)用于組織表達(dá)差異性分析。于2014年8月至2015年3月，采集第1次卵巢發(fā)育Ⅰ～Ⅴ期[12]三疣梭子蟹(頭胸甲寬：12～18 cm；體質(zhì)量：90～335 g)；于2015年4月至5月，采集第2次卵巢發(fā)育Ⅰ～Ⅳ期[13]三疣梭子蟹(頭胸甲寬：14.3～18.3 cm；體質(zhì)量：175～455 g) 的MO用于分析其中FPS的表達(dá)水平變化。組織剝離后存放在RNA保存液中，于-20℃保存。

1.2 實驗方法

總RNA提取 將上述組織樣品按照Trizol試劑盒(上海生工)說明進(jìn)行總RNA提取?？俁NA用DNaseI (Takara)去除基因組DNA后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，并用超微量分光光度計Nanodrop 2 000 (Thermo scientific)進(jìn)行純度分析。

1.3 基因克隆與序列分析

采用RT-PCR進(jìn)行fps核心片段的擴(kuò)增。模板cDNA由MO總RNA通過 PrimeScript?RT reagent Kit試劑盒(Takara)反轉(zhuǎn)錄獲得，擴(kuò)增引物設(shè)計自三疣梭子蟹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中fps的同源序列 (表1)。根據(jù)得到的核心序列設(shè)計基因特異性引物，并利用RACE技術(shù)分別對Ptfps的3′和5′端進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增(表1)。其中，3′RACE-cDNA時將接頭引物AP替換上述試劑盒中的OligodTprimer和Random 6 mers后用相同的方法進(jìn)行制備，5′ RACE-cDNA按照 SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒(Clontech)進(jìn)行合成(表1)。以上PCR均在25 μL體系下進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，33個循環(huán)；72℃再延伸10 min。所有PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳后，用DNA回收試劑盒(上海生工)進(jìn)行回收和連接，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后選取陽性克隆菌落交由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。得到測序結(jié)果后用VectorNTI 10.0對序列進(jìn)行拼接，獲得三疣梭子蟹fps(Ptfps)的全長cDNA序列，并參照邱錫爾等[14]的方法進(jìn)行序列分析。

表1 fps擴(kuò)增及表達(dá)所用引物

1.4 實時熒光定量(qRT-PCR)

取1.0 μg各個組織總RNA 用PrimeScript RT reagent Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。根據(jù)fpscDNA全長設(shè)計一對特異性引物YG-F和YG-R(表 1)，以actin-F 和actin-R(表 1)作為內(nèi)參引物進(jìn)行實時熒光定量測定fps在不同組織和卵巢發(fā)育中的表達(dá)量。qRT-PCR的反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性5 s，58.2℃退火20 s，68℃延伸20 s，共40個循環(huán)；95℃變性15 s，55℃退火15 s、升溫25 min，95℃延伸15 s。最后用SPSS17. 0統(tǒng)計分析軟件對獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2結(jié)果與分析

2.1 三疣梭子蟹fps的生物信息學(xué)分析

將測序結(jié)果進(jìn)行拼接獲得2 360 bp的fpscDNA全長序列(圖1)，GenBank登錄號：KM013803(表2)。5′端非編碼區(qū)為87 bp，3′端非編碼區(qū)為983 bp，開放閱讀框(Open reading frame，ORF)長度為1 290 bp，編碼429個氨基酸。利用ExPASy(http://ca.expasy.org/)網(wǎng)站在線ProtParam tool預(yù)測該序列編碼的蛋白質(zhì)分子式為C2146H3367N587O614S19，分子質(zhì)量約為47.8 ku，等電點為8.97； TMHMM工具分析發(fā)現(xiàn)該氨基酸序列無跨膜結(jié)構(gòu)。利用在線軟件Signal 3.0 Server分析該氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)存在信號肽結(jié)構(gòu)，說明該序列編碼的蛋白屬于分泌蛋白。

圖1 三疣梭子蟹fps的cDNA核苷酸序列和編碼區(qū)氨基酸序列

起始密碼子和終止密碼子用黑體表示；保守區(qū)域用陰影表示；富含天冬氨酸的序列用方框表示；芳香族殘基(FF)用加粗斜體表示

表2 用于氨基酸序列比對及進(jìn)化樹構(gòu)建的fps登錄號

利用NCBI上的BLASTp功能，搜索PtFPS的同源序列，未見其它甲殼動物FPS氨基酸序列。PtFPS與內(nèi)華達(dá)古白蟻(Z.nevadensis)FPS氨基酸序列同源性最高，達(dá)到58%，與赤擬谷盜(T.castaneum)FPS氨基酸序列同源性為55%，與桃蚜(M.persicae)、家蠶(B.mori)FPS氨基酸序列同源性均為50%。因此在昆蟲中選擇同源性較高的4個不同物種：內(nèi)華達(dá)古白蟻、赤擬谷盜、桃蚜和松甲蟲(D.jeffreyi)，用ClustalX軟件將這些物種的FPS氨基酸序列與PtFPS氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(圖2)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PtFPS氨基酸序列也具有異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的7個保守結(jié)構(gòu)域，并且在結(jié)構(gòu)域Ⅱ和結(jié)構(gòu)域Ⅵ中都找到了高度保守的富含天冬氨酸的序列(DDXXD)。因此，本次實驗克隆所得的序列為三疣梭子蟹fps(Ptfps)。

在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索到不同物種的FPS氨基酸序列，用MEGA 4.0軟件的鄰接距離法構(gòu)建進(jìn)化樹(圖3)。結(jié)果顯示，三疣梭子蟹FPS(PtFPS)與昆蟲聚為一支，脊椎動物則單獨聚為一支。

2.2fps在雌性三疣梭子蟹不同組織中的表達(dá)差異

實時熒光定量測定結(jié)果表明，fps在雌性三疣梭子蟹各組織中均有不同程度的表達(dá)(圖4)，但在MO中表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他組織，差異極顯著(P<0.01)。

2.3三疣梭子蟹fps在卵巢發(fā)育中的表達(dá)水平變化

實時熒光定量測定結(jié)果顯示，fps在第1次卵巢發(fā)育的Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期表達(dá)量較低，呈緩慢上升趨勢，Ⅳ期表達(dá)量顯著增大(P<0.05)，Ⅴ期略有下降(圖5)。在第2次卵巢發(fā)育中fps的相對表達(dá)量隨卵巢成熟逐步升高，其中Ⅱ期與Ⅲ期間差異顯著(P<0.05)，在Ⅳ期達(dá)到最大值(圖6)。

圖2 三疣梭子蟹FPS氨基酸多序列比對結(jié)果

7個異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的保守區(qū)域用羅馬字母和下劃線標(biāo)出；2個天冬氨酸富集區(qū)用方框表示

圖3 FPS氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

FPS氨基酸序列登錄號詳見表2

圖4 fps在三疣梭子蟹不同組織里的相對表達(dá)量

P：表皮；Ht：心臟；Hp：肝胰腺； YO：Y器；MO：大顎器；XO：X器；O：卵巢；TG：胸神經(jīng)節(jié)。不同大寫字母表示有極顯著差異(P<0.01)

圖5 三疣梭子蟹第1次卵巢發(fā)育中fps在大顎器中的相對表達(dá)量

不同小寫字母表示有顯著差異(P<0.05)

圖6 三疣梭子蟹第2次卵巢發(fā)育中fps在大顎器中的相對表達(dá)量

不同小寫字母表示有顯著差異(P<0.05)

3 討論

作為類異戊二烯生物合成途徑中的重要催化酶，F(xiàn)PS在甲殼動物中尚未見研究報道。本實驗克隆得到三疣梭子蟹fps的全長cDNA序列，與NCBI上已公布的昆蟲FPS氨基酸序列具有較高的同源性。Gussion等[15]在對兩種鱗翅目昆蟲(家蠶B.mori和一星粘蟲Pseudaletiaunipuncta)中編碼FPS的cDNA分析發(fā)現(xiàn)FPS具有兩種結(jié)構(gòu)，分別為FPS I和FPS II。FPS I在鱗翅目昆蟲的各組織中普遍表達(dá)，而FPS II則主要在咽側(cè)體(CA)中表達(dá)，含量也高于FPS I近23倍左右，并依此認(rèn)為咽側(cè)體是分泌FPS II的主要部位[15, 16]。但是本次對三疣梭子蟹的實驗中沒有發(fā)現(xiàn)FPS的亞型，這可能與物種差異有關(guān)，也可能與鱗翅目昆蟲能產(chǎn)生不同類型的保幼激素(JH)有關(guān)。

在與其他物種的 FPS 氨基酸序列進(jìn)行比對的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)， FPS基因家族具有7個異戊烯基轉(zhuǎn)移酶特征結(jié)構(gòu)域，分別為：結(jié)構(gòu)域Ⅰ(GKXNRG)、結(jié)構(gòu)域Ⅱ(WCXEXXXXXXLXXDDIXDXXXXRRG)、結(jié)構(gòu)域Ⅲ(GXXAXND)、結(jié)構(gòu)域Ⅳ(GQXLD)、結(jié)構(gòu)域Ⅴ(KT)、結(jié)構(gòu)域Ⅵ(LXEMGXFFQXQDDXLDCXGDXXVXGKXG)和結(jié)構(gòu)域Ⅶ(FXXXXXXIXXR)[17]，并且在結(jié)構(gòu)域Ⅱ和結(jié)構(gòu)域Ⅵ中均含有高度保守的富含天冬氨酸的序列(DDXXD)。許多對于該區(qū)域的研究都表明，這兩個區(qū)域是丙烯基底物與異戊烯基焦磷酸(IPP)的結(jié)合位點[18]。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，三疣梭子蟹FPS與昆蟲FPS聚為一支，脊椎動物單獨聚為一支，這說明三疣梭子蟹fps與昆蟲fps具有較高同源性，符合生物的自然進(jìn)化關(guān)系。組織表達(dá)結(jié)果顯示，fps在MO中表達(dá)量最高，而其他組織中的表達(dá)量均極低，具有極顯著差異。這一研究結(jié)果支持了MO是MF唯一合成和分泌場所的觀點[4]。

作為重要的養(yǎng)殖品種，對三疣梭子蟹卵巢發(fā)育調(diào)控機(jī)制的研究就極為重要。甲殼動物的卵巢發(fā)育主要是通過卵黃發(fā)生合成卵黃蛋白原(Vg)，進(jìn)而在卵母細(xì)胞中積累卵黃體和各類營養(yǎng)物質(zhì)(蛋白質(zhì)、脂類、碳水化合物等)的過程[19]。其中，卵黃體主要是由卵黃磷蛋白(vitellin，Vn)組成的，而卵黃蛋白原(Vg)又是Vn的前體物質(zhì)[20]。據(jù)現(xiàn)有報道，MF能夠促進(jìn)卵黃發(fā)生：趙維信等[21]利用放射化學(xué)法對克氏原螯蝦MO中的MF合成速率進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)MF與促進(jìn)卵黃發(fā)生密切相關(guān) ；郭敏[22]實驗發(fā)現(xiàn)，與MF共同培養(yǎng)后的中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)卵母細(xì)胞中vg表達(dá)上升。謝熙等[23]的實驗已證明三疣梭子蟹卵巢中vg的表達(dá)水平與卵巢發(fā)育呈正相關(guān)，同時結(jié)果顯示在三疣梭子蟹第一次卵巢發(fā)育時，卵巢中vg的表達(dá)水平在Ⅳ期達(dá)到最高，Ⅳ期為三疣梭子蟹卵巢的卵黃合成旺盛期[12]。本實驗中，fps的表達(dá)量在第一次卵巢發(fā)育的Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期均較低，Ⅳ期顯著上升至最大值，Ⅴ期略有下降，與vg的表達(dá)趨勢相符。在三疣梭子蟹第二次卵巢發(fā)育時，fps的表達(dá)量隨著卵巢的成熟而逐漸升高，Ⅲ期有顯著上升。這與第2次卵巢發(fā)育中vg的表達(dá)水平變化趨勢[24]和GSI指數(shù)的變化曲線[13]均相吻合，說明三疣梭子蟹卵巢發(fā)育過程中vg的表達(dá)與fps有明顯的相關(guān)性。由此推測，fps在第一次卵巢發(fā)育Ⅳ期和第二次卵巢發(fā)育的Ⅲ期、Ⅳ期高效表達(dá)，可能與卵巢中卵黃的旺盛合成有關(guān)，并能促進(jìn)三疣梭子蟹卵巢的排卵過程。但在劉智俊等[25]對三疣梭子蟹第一次卵巢發(fā)育時MO中MF合成速率進(jìn)行檢測的實驗中，發(fā)現(xiàn)MF的合成速率在Ⅲ期達(dá)到最高。這種差異可能與fps在三疣梭子蟹大顎器中還參與合成其它能促進(jìn)次級卵黃發(fā)生的類固醇激素有關(guān)。早在1987年，Couch[26]發(fā)現(xiàn)無論美洲龍螯蝦(H.americanus)卵巢是否發(fā)育，孕酮含量均較高且穩(wěn)定，而雌二醇僅在卵黃發(fā)生期可以檢測到，并由此認(rèn)為大顎器除合成MF外，還合成分泌孕酮和雌二醇，促進(jìn)卵黃發(fā)生。至于fps具體參與合成哪些促進(jìn)三疣梭子蟹次級卵黃發(fā)生的類固醇激素，有待進(jìn)一步研究證實。

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Cloning of farnesyl diphosphate synthase (fps) from Portunus trituberculatus and its expression during the ovarian development

ZHU Tao, ZHU Dong-fa, QIU Xi-er, ZHOU Yan-qi, LIU Zhi-ye， XIE xi

( School of Marine Sciences， Ningbo University， Ningbo 315211， China)

AbstractFarnesyl diphosphate synthase (FPS) is a key enzyme in isoprenoid biosynthesis, participates in the synthesis of methyl farnesoate (MF) in the crustaceans. To study the regulatory role of FPS during ovarian development of the crustaceans, a full-length of fps (Ptfps, GeneBank accession number: KM013803) was cloned from Portunus trituberculatus by RT-PCR and rapid amplification of cDNA ends (RACE). The full-length of Ptfps was 2 360 bp and it contained an open reading frame (ORF) of 1 290 bp encoding a protein of 429 amino acid residues. Bioinformatics analysis found that PtFPS has seven prenyltransferase conserved regions, and exhibits the highest identity (58%) with FPS of Zootermopsis nevadensis. Quantitative real-time PCR analysis results showed that fps was mainly expressed in mandibular organ (MO), and the expression level was much higher than that in other tissues (P < 0.01). During the first ovarian development, the expression of fps significantly increased to the highest levels at stage Ⅳ (P < 0.05), and then slightly declined; During the second ovarian development, the expression of fps significantly increased to the highest level at stage Ⅲ (P < 0.05), and reached to the maximum at stage Ⅳ. The above results indicated that fps may closely related to the regulation of ovarian development in P. trituberculatus.

Key wordsPortunus trituberculatus; farnesyl diphosphate synthase (FPS); gene cloning; ovarian development; expression

收稿日期：2015-09-09；修回日期：2015-10-27

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(41376152)；浙江省自然科學(xué)基金項目( LY13C190006)資助

作者簡介：朱 韜，專業(yè)方向為甲殼動物發(fā)育生物學(xué)； 通信作者：朱冬發(fā)，教授，研究方向為甲殼動物發(fā)育生物學(xué)，E-mail: zhudongfa@nbu.edu.cn。

中圖分類號Q78

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號2095-1736(2016)03-0010-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.03.010