馬文靜， 史雨紅， 陳　炯

(寧波大學(xué) 生物與海洋科學(xué)系, 寧波 315211)

梅氏新貝尼登蟲(chóng)膜聯(lián)蛋白B1基因序列分析及應(yīng)激表達(dá)分析

馬文靜， 史雨紅， 陳炯

(寧波大學(xué) 生物與海洋科學(xué)系, 寧波 315211)

摘要膜聯(lián)蛋白(Annexins, ANX)是一類(lèi)Ca2+依賴(lài)性磷脂結(jié)合蛋白多基因家族，參與生物膜修復(fù)、Ca2+調(diào)節(jié)、信號(hào)傳導(dǎo)、膜泡運(yùn)輸以及細(xì)胞增殖等過(guò)程，部分成員其mRNA和蛋白表達(dá)與發(fā)育和環(huán)境變化緊密相關(guān)。研究采用生物信息學(xué)方法鑒定了梅氏新貝尼登蟲(chóng)anxb1(Neobenedenia melleni anxb1，nmanxb1)的序列特征，隨后采用RT-qPCR技術(shù)確定其mRNA表達(dá)與發(fā)育和環(huán)境(溫度和鹽度)變化相關(guān)性。研究結(jié)果表明，NmANXB1具有4個(gè)由α-螺旋組成的重復(fù)單元，其中3個(gè)典型II型Ca2+結(jié)合位點(diǎn)、6個(gè)III型Ca2+結(jié)合位點(diǎn)，以及1個(gè)KGD基序。氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析揭示，nmanxb1與其他B族蠕蟲(chóng)類(lèi)寄生蟲(chóng)anx共成一簇。RT-qPCR結(jié)果顯示，nmanxb1 mRNA主要在蟲(chóng)卵中表達(dá)。低溫和高溫應(yīng)激下蟲(chóng)卵nmanxb1 mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)；高溫和低鹽應(yīng)激時(shí)成蟲(chóng)中的表達(dá)量也顯著上升。以上結(jié)果揭示，NmANXB1可能參與梅氏新貝尼登蟲(chóng)的發(fā)育和環(huán)境應(yīng)激適應(yīng)過(guò)程。

關(guān)鍵詞nmanxb1；序列特征；基因表達(dá)；梅氏新貝尼登蟲(chóng)

膜聯(lián)蛋白(Annexins, ANX)是一類(lèi)Ca2+依賴(lài)性磷脂結(jié)合蛋白，廣泛地分布于單細(xì)胞生物、動(dòng)物和植物中，約占細(xì)胞總蛋白質(zhì)的2%以上，存在于細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)側(cè)、儲(chǔ)Ca2+細(xì)胞器附近以及在核內(nèi)或細(xì)胞外基質(zhì)中[1]。除酸性磷脂外，ANX可結(jié)合含EF指結(jié)構(gòu)蛋白和細(xì)胞骨架蛋白[2]，廣泛參與生物膜修復(fù)、離子通道調(diào)節(jié)、膜泡運(yùn)輸、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖、分化和凋亡、抗炎以及抗凝血等過(guò)程[2-5]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，anxmRNA表達(dá)不僅與發(fā)育緊密相關(guān)，且其表達(dá)、豐度以及細(xì)胞定位受溫度和鹽度調(diào)控[6]。因此，anx基因家族可能參與機(jī)體發(fā)育過(guò)程對(duì)環(huán)境脅迫的適應(yīng)性應(yīng)答過(guò)程[2]。

ANX家族是多基因家族，可分成5族： A族為脊椎動(dòng)物， B族為非脊椎動(dòng)物， C族為真菌和部分真核單細(xì)胞生物， D族為植物， E族為原生動(dòng)物，此外還有40多種還未分類(lèi)[7]。蠕蟲(chóng)類(lèi)寄生蟲(chóng)ANX基因?qū)儆贐族。近年來(lái)，由于高通量測(cè)序及組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的蠕蟲(chóng)類(lèi)寄生蟲(chóng)anx序列逐步被鑒定[8-10]。其中研究對(duì)象多為體內(nèi)蠕蟲(chóng)類(lèi)寄生蟲(chóng)，如曼氏吸血蟲(chóng)(Schistosomamansoni)[7]、豬肉絳蟲(chóng)(Taeniasolium)[11]和華支睪吸蟲(chóng)(Clonorchissinensis)[12]等。相對(duì)于上述寄生體內(nèi)的蠕蟲(chóng)，體表蠕蟲(chóng)anx鮮少報(bào)道，僅有微杯蟲(chóng)(Microcotylesebastis)anx[13]。由于體內(nèi)蠕蟲(chóng)類(lèi)寄生蟲(chóng)anx表達(dá)受環(huán)境變化影響較小，因此，其與環(huán)境應(yīng)激相關(guān)研究未曾報(bào)道。anxmRNA表達(dá)與溫度和鹽度應(yīng)激相關(guān)性報(bào)道來(lái)自于脊椎動(dòng)物或植物。

梅氏新貝尼登蟲(chóng)(Neobenedeniamelleni)隸屬扁形動(dòng)物門(mén)、吸蟲(chóng)綱、單殖目、分室科、新貝尼登蟲(chóng)屬。該蟲(chóng)在世界范圍內(nèi)分布較為廣泛，是近年來(lái)我國(guó)沿海和日本養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)暴發(fā)急性寄生蟲(chóng)流行病的主要病原之一，造成海水養(yǎng)殖業(yè)巨大經(jīng)濟(jì)損失[14]。梅氏新貝尼登蟲(chóng)廣泛寄生于多種海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)體表，如褐牙鲆、高體鰤和大黃魚(yú)等，對(duì)環(huán)境條件(如溫度和鹽度)變化敏感[15]。因此，研究梅氏新貝尼登蟲(chóng)anxb1(Neobenedeniamellenianxb1，nmanxb1)參與寄生蟲(chóng)適應(yīng)環(huán)境變化的分子機(jī)制，可為梅氏新貝尼登蟲(chóng)病害防治提供理論依據(jù)。

本研究采用文庫(kù)隨機(jī)測(cè)序方法鑒定了nmanxb1序列，運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析了nmanxb1分子序列特征，研究其與溫度和鹽度應(yīng)激相關(guān)性，為該基因的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

寄生蟲(chóng)采集方法參考文獻(xiàn)[16]，大黃魚(yú)病樣采集于浙江省寧波市象山黃避岙港灣。首先從病樣體表分離梅氏新貝尼登蟲(chóng)成蟲(chóng)；再將收集的成蟲(chóng)放入盛有過(guò)濾海水的培養(yǎng)皿中，置于室溫下讓其自然產(chǎn)卵，數(shù)小時(shí)后收集形狀完好和顏色為黃褐色的蟲(chóng)卵；最后將收集的蟲(chóng)卵放入盛有過(guò)濾海水的培養(yǎng)皿中室溫培養(yǎng)，培養(yǎng)皿中海水每天更換，收集逸出的鉤毛蚴。應(yīng)激實(shí)驗(yàn)如下：成蟲(chóng)和蟲(chóng)卵分別置于18 ℃、25 ℃及32 ℃的過(guò)濾海水(鹽度24)中，2h后收集并液氮速凍保存。取成蟲(chóng)與蟲(chóng)卵分別置于鹽度18、24及30的過(guò)濾海水(25℃)中，5 h后收集，液氮速凍后-70℃保存。上述實(shí)驗(yàn)生物學(xué)重復(fù)3次。

SMART RACE cDNA amplification kit、RNAiso試劑、AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶、ExTaq DNA聚合酶、DNA Ligation Kit Ver.2.0及SYBR Premix ExTaq試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司；引物合成及序列測(cè)定由上海英駿生物工程公司完成。

1.2方法

1.2.1cDNA序列獲得及分析 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的anx序列設(shè)計(jì)ANX兼并引物上游序列ANX(+)：5′-ATGAAAGGWHBHGGCACNGATGA-3′，W=A，T，H=A，C或T，B=C，G或T，N=A，C，G或T；下游引物ANX(-)：5′-GGTAWTCWCCAGADGTATCA-3′，D=A，G或T。ANX(+)與ANX(-)配對(duì)從梅氏新貝尼登蟲(chóng)各發(fā)育階段混合cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增獲得中間序列，再根據(jù)中間序列測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)5′-RACE引物NmANXB1-5t(-)(5′-GAAGCAATCT CTATTCTCTG-3′)和Nested Universal Primer A配對(duì)擴(kuò)增5′-末端片段，最后根據(jù)中間序列設(shè)計(jì)特異引物NmANXB1-3t(+)(5′-GGTTTGGGTACCTGCGATGT-3′)，采用RACE技術(shù)從上述cDNA文庫(kù)中獲得nmanxb1 3′-末端序列。序列拼接獲得nmanxb1 cDNA，用BLASTX (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/BLAST/)分析，信號(hào)肽序列預(yù)測(cè)采用SignalP 4.0程序[17]。多重序列比對(duì)采用Bioedit軟件，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析采用MEGA 5.0軟件[18]。1.2.2nmanxb1 mRNA表達(dá)分析 根據(jù)已知的nmanxb1 cDNA序列設(shè)計(jì)的RT-qPCR引物為NmANXB1F：5′-GTTGGACGCCTACTCCATGT-3′和NmANXB1R：5′-TTTCTCATGCCTTGCAACAG-3′，擴(kuò)增234 bp片段；內(nèi)參為β-actin基因，RT-qPCR引物為Nm-actinF：5′-CTTTAGATTT CAACCAGGAG-3′和Nm-actinR：5′-TGCCACAGTATTCCCTTT-3′，預(yù)期擴(kuò)增162 bp片段。

樣品處理和RT-qPCR反應(yīng)體系等同文獻(xiàn)[16]。簡(jiǎn)述如下：首先用RNAiso試劑分別提取不同發(fā)育階段樣品和應(yīng)激處理樣品的總RNA；DNase I (RNase-free)處理后，在AMV逆轉(zhuǎn)錄酶作用下以總RNA為模板合成cDNA第一鏈；RT-qPCR反應(yīng)體系25 μL。采用2-ΔΔCt法[19]計(jì)算nmanxb1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析法(One-way ANOVA)，P<0.05為顯著性差異。

2結(jié)果

2.1nmanxb1 cDNA序列分析

圖1 部分蠕蟲(chóng)寄生蟲(chóng)ANX氨基酸序列比對(duì)

ANX具有5個(gè)部分：N末端(N-terminus)和4個(gè)重復(fù)單元(Repeat I-IV)，分別用劃線(xiàn)表示；重復(fù)單元中II型Ca2+結(jié)合位點(diǎn)“G-X-G-T-(38residues)-D/E”基序用“▲”表示，III型Ca2+結(jié)合位點(diǎn)“G-X-G-T-D/E”用“↓”表示；“KGD”基序用“▽”表示；α螺旋(1A-4E)用圓角矩形表示；NmANXB1：梅氏新貝尼登蟲(chóng)N.melleniANXB1(KT314071)，EmANX：多房棘球絳蟲(chóng)EchinococcusmultilocularisANX(CBLO010001671)，TsANXB3：豬帶絳蟲(chóng)T.soliumANXB3(DQ010543)，TsANXB1：豬帶絳蟲(chóng)T.soliumANXB1(AF147955)，MsANX：微杯蟲(chóng)M.sebastisANX(EU719209)，SbANX：牛血吸蟲(chóng)S.bovisANX (EU595758)，SmANXB22：曼氏血吸蟲(chóng)S.mansoniANXB22(AF065599)

nmanxb1 cDNA序列長(zhǎng)為1 286 bp(不計(jì)polyA尾)。開(kāi)放閱讀框共1 050 bp (31 nts～1 080 nts)，編碼一個(gè)由350個(gè)氨基酸組成的蛋白，該蛋白無(wú)信號(hào)肽序列，編碼蛋白分子質(zhì)量約38.6 ku，其等電點(diǎn)pI為4.46。NmANXB1氨基酸序列分成N末端(N-terminus)和C端序列。N末端包含25 aa，與其他蠕蟲(chóng)類(lèi)寄生蟲(chóng)ANX氨基酸序列相比，NmANXB1蛋白N端適中(圖1)。C端序列包含4個(gè)重復(fù)單元(Repeat I：aa 27～98；Repeat II：aa 99～176；Repeat III：aa 177～286；Repeat IV：aa 287～350)；4個(gè)重復(fù)單元各由5個(gè)α-螺旋組成，分別用A-E命名(圖1)。4個(gè)重復(fù)單元各具有一個(gè)典型的II型Ca2+結(jié)合位點(diǎn)“G-X-G-T-(38 residues)-D/E”基序(圖1)，氨基酸殘基“G-X-G-T”位于α-螺旋A和B之間，氨基酸殘基D/E位于α-螺旋D和E之間。Ca2+可與此基序中帶負(fù)電荷的殘基結(jié)合，ANX可通過(guò)Ca2+再結(jié)合膜上帶有負(fù)電的磷脂。此外，C端共存在6個(gè)III型Ca2+結(jié)合位點(diǎn)“G-X-G-T-D/E”(圖1)。重復(fù)單元IV末端存在“K342G343D344”基序，該基序與ANX結(jié)合膜有關(guān)(圖1)。根據(jù)多重序列比對(duì)結(jié)果，ANX基因N端屬于可變區(qū)，C端氨基酸序列保守性較高(圖1)。氨基酸序列同源性比較揭示，NmANXB1與華支睪吸蟲(chóng)ANXB7同源性最高(42.2%)。氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析揭示，NmANXB1與其他B族蠕蟲(chóng)類(lèi)寄生蟲(chóng)ANX共成一簇，A族中ANXA13另成一簇(圖2)。目前僅A族內(nèi)部各個(gè)異構(gòu)體命名較明確，B族內(nèi)部anx命名混亂[7]，通常無(wú)法從蠕蟲(chóng)類(lèi)寄生蟲(chóng)anx命名的數(shù)字編號(hào)將其歸類(lèi)。

圖2 基于ANX氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)

分叉處數(shù)值表示1 000次重復(fù)抽樣所得到的置信度百分比, 只顯示置信度60 %以上的數(shù)值; 標(biāo)尺長(zhǎng)度表明每個(gè)位點(diǎn)發(fā)生0.1次置換；所用序列登錄號(hào)：人HomosapiensANXA13(BC125158)，牛BostaurusANXA13(BC133570)，豬SusscrofaANXA13(XM_005662867)，非洲爪蟾XenopuslaevisANXA13(NM_131774)，斑馬魚(yú)DaniorerioANXA13(NM_131774)，大西洋鮭SalmosalarANXA13(BT045040)，豬帶絳蟲(chóng)T.soliumANXB3(Q4ZGZ6)，多房棘球絳蟲(chóng)E.multilocularisANX(CBLO010001671)，梅氏新貝尼登蟲(chóng)N.melleniANXB1(KT314071)，日本血吸蟲(chóng)S.japonicumANX(FN320195)，華支睪吸蟲(chóng)C.sinensisANXB7(DF142903)，曼氏血吸蟲(chóng)SchistosomamansoniANXB22(AF065599)，牛血吸蟲(chóng)SchistosomabovisANX(EU595758)，微杯蟲(chóng)M.sebastisANXB34(EU719209)，豬帶絳蟲(chóng)T.soliumANXB2(Q52MU2)，曼氏血吸蟲(chóng)S.mansoniANXB2(FJ860253)，華支睪吸蟲(chóng)C.sinensisANXB30(DF142920)

2.2不同發(fā)育階段中nmanxb1 mRNA表達(dá)變化

取梅氏新貝尼登蟲(chóng)3個(gè)發(fā)育階段蟲(chóng)體：卵、鉤毛蚴、成蟲(chóng)，進(jìn)行RT-qPCR分析。結(jié)果表明，nmanxb1 mRNA在卵中表達(dá)量最大且顯著高于其他兩個(gè)發(fā)育階段，其表達(dá)量約為鉤毛蚴的19.1倍，為成蟲(chóng)的3.97倍。成蟲(chóng)中次之，鉤毛蚴中表達(dá)量最少(圖3)。

圖3 nmanxb1 mRNA在3個(gè)發(fā)育階段表達(dá)

E：蟲(chóng)卵(Egg)；O：鉤毛蚴(Oncomiracidium)；A：成蟲(chóng)(Adult)。*P<0.05 (n=3)

2.3溫度和鹽度應(yīng)激后nmanxb1 mRNA表達(dá)變化

本研究以梅氏新貝尼登蟲(chóng)病爆發(fā)時(shí)水溫25℃為對(duì)照溫度，對(duì)蟲(chóng)卵和成蟲(chóng)分別進(jìn)行低溫(18℃)和高溫(32℃)應(yīng)激處理。RT-qPCR結(jié)果表明，在低溫和高溫應(yīng)激下蟲(chóng)卵nmanxb1 mRNA表達(dá)量分別為對(duì)照溫度時(shí)表達(dá)量的2.19倍和1.86倍；在低溫應(yīng)激下成蟲(chóng)nmanxb1 mRNA表達(dá)量無(wú)顯著變化，在高溫應(yīng)激時(shí)其表達(dá)量為對(duì)照溫度時(shí)表達(dá)量的1.77倍(圖4A)。

蟲(chóng)病爆發(fā)期海水鹽度約為24。本研究以鹽度24為對(duì)照，對(duì)蟲(chóng)卵和成蟲(chóng)分別進(jìn)行低鹽(鹽度18)和高鹽(鹽度30)應(yīng)激。RT-qPCR結(jié)果顯示，低鹽和高鹽應(yīng)激后蟲(chóng)卵nmanxb1 mRNA表達(dá)量均無(wú)顯著變化；低鹽應(yīng)激成蟲(chóng)后其表達(dá)量上調(diào)為對(duì)照鹽度的1.72倍；高鹽應(yīng)激其表達(dá)量無(wú)顯著變化(圖4B)。

圖4 溫度和鹽度應(yīng)激后蟲(chóng)卵和成蟲(chóng)nmanxb1 mRNA表達(dá)

A：溫度應(yīng)激；B：鹽度應(yīng)激。*P<0.05 (n=3)

3討論

ANX是Ca2+依賴(lài)性磷脂結(jié)合蛋白，典型結(jié)構(gòu)各由4組α螺旋組成為環(huán)形α螺旋束，其凸面為Ca2+依賴(lài)的膜結(jié)合區(qū)[20]。Ca2+結(jié)合位點(diǎn)存在3種形式：II型、III型和K/R/HGD基序。K/R/HGD基序取代II型Ca2+結(jié)合位點(diǎn)成為ANX結(jié)合膜的新形式，這種現(xiàn)象在無(wú)脊椎動(dòng)物B族中較為常見(jiàn)[21]。氨基酸序列分析表明，NmANXB1也具有α螺旋形成的4組重復(fù)單元，符合典型ANX結(jié)構(gòu)特征。同時(shí)具有4個(gè)典型II型Ca2+結(jié)合位點(diǎn)，6個(gè)III型Ca2+結(jié)合位點(diǎn)，重復(fù)單元IV中α螺旋4D和4E之間存在一個(gè)KGD基序，表明NmANXB1是典型的Ca2+依賴(lài)性蛋白。此外，系統(tǒng)進(jìn)化分析表明NmANXB1與其他B族蠕蟲(chóng)類(lèi)寄生蟲(chóng)ANX共成一簇。

anx家族部分成員mRNA和蛋白表達(dá)受生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控[2]。牛血吸蟲(chóng)ANX是童蟲(chóng)和成蟲(chóng)體被表膜蛋白[20]。華支睪吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵、后囊蚴和成蟲(chóng)中后囊蚴anxb30 mRNA表達(dá)量最高[12]。復(fù)殖類(lèi)曼氏血吸蟲(chóng)anxb22(又名Sm1)在卵和幼蟲(chóng)中表達(dá)量較少，在童蟲(chóng)和成蟲(chóng)中表達(dá)量較高[9]。梅氏新貝尼登蟲(chóng)生活史可簡(jiǎn)單劃分為 3 個(gè)典型的生理發(fā)育時(shí)期，帶殼蟲(chóng)卵需5～7 d孵化成鉤毛蚴；鉤毛蚴逸出6 h后感染性大幅降低，寄生于魚(yú)體表后鉤毛蚴發(fā)育為成蟲(chóng)；成蟲(chóng)存活周期一般為 14～16 d[22, 23]。在生活史3個(gè)階段中，蟲(chóng)卵nmanxb1 mRNA表達(dá)量最高。anx為多基因家族，不同的anx可能在不同階段發(fā)揮功能。

文獻(xiàn)報(bào)道，anx家族可能參與機(jī)體對(duì)環(huán)境脅迫的適應(yīng)性應(yīng)答過(guò)程[2]。人ANXA1體外具有分子伴侶活性，可防止檸檬酸合酶和谷氨酸脫氫酶熱失活[24]。低溫應(yīng)激導(dǎo)致白楊樹(shù)anxmRNA表達(dá)增加[25]。大麥ANX p39和p22.5蛋白量上調(diào)，通過(guò)插入質(zhì)膜感應(yīng)或轉(zhuǎn)導(dǎo)Ca2+信號(hào)，或調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，參與信號(hào)調(diào)控和適應(yīng)環(huán)境變化[26]。anxmRNA的表達(dá)、豐度以及細(xì)胞定位都與鹽度變化相關(guān)[6]。ANX在鹽度應(yīng)激時(shí)可暫時(shí)性插入質(zhì)膜中，可能通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或通過(guò)調(diào)節(jié)其他膜蛋白，以應(yīng)對(duì)惡劣環(huán)境[6]。高鹽應(yīng)激后苜蓿anxms2 mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)[27]。梅氏新貝尼登蟲(chóng)寄生于海水魚(yú)類(lèi)體表，其蟲(chóng)卵孵化率、發(fā)病率等都受環(huán)境條件影響。據(jù)報(bào)道，蟲(chóng)卵在25℃時(shí)發(fā)育正常且孵化率最高，低溫(18 ℃)和高溫(32 ℃)時(shí)發(fā)育停滯以及孵化率驟減[28]，從而導(dǎo)致發(fā)病率顯著下降。此外，梅氏新貝尼登蟲(chóng)在水溫為19 ℃[29]和30 ℃[24]時(shí)均有報(bào)道，但迄今為止在寒帶海域未有發(fā)現(xiàn)，因此，本研究選擇18 ℃和32 ℃進(jìn)行溫度應(yīng)激實(shí)驗(yàn)。研究表明低溫及高溫下蟲(chóng)卵nmanxb1 mRNA均顯著上升，而成蟲(chóng)nmanxb1 mRNA在高溫應(yīng)激時(shí)顯著上調(diào)，在低溫應(yīng)激時(shí)無(wú)顯著變化。蟲(chóng)卵卵殼對(duì)海水鹽度變化有較強(qiáng)的保護(hù)作用，因此鹽度17.6～56.9對(duì)蟲(chóng)卵基本無(wú)影響[29]。但成蟲(chóng)對(duì)鹽度的變化敏感, 暴雨等造成的鹽度暫時(shí)性改變能導(dǎo)致成蟲(chóng)從宿主體表脫落[15,29]。無(wú)論低鹽還是高鹽應(yīng)激處理時(shí)，蟲(chóng)卵nmanxb1 mRNA表達(dá)無(wú)顯著變化，低鹽時(shí)成蟲(chóng)nmanxb1 mRNA表達(dá)上升，高鹽應(yīng)激下其表達(dá)無(wú)顯著變化。ANX具有維持細(xì)胞膜完整性和膜修復(fù)的功能，參與Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)和信號(hào)調(diào)控等過(guò)程，從而在梅氏新貝尼登蟲(chóng)應(yīng)對(duì)環(huán)境應(yīng)激中發(fā)揮作用。

綜上所述，本研究分析了梅氏新貝尼登蟲(chóng)nmanxb1序列特征，并探討了其表達(dá)與生長(zhǎng)發(fā)育以及環(huán)境溫度和鹽度應(yīng)激的相關(guān)性，為后續(xù)蛋白功能的研究奠定了基礎(chǔ)。

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Sequence analysis and stress-related changes of the annexin B1 gene in Neobenedenia melleni

MA Wen-jing, SHI Yu-hong, CHEN Jiong

(Department of Biology and Marine Science, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

AbstractAnnexins (ANX) are a multigene family of Ca2+-dependent phospholipid binding proteins, which are involved in the processes, such as membrane repair, ion channel regulation, signal transduction, vesicular transport and cell proliferation. Some anxs are expressed in the growth and environment (thermal and salinity)-dependent manner. In this study, bioinformatic approaches were used for sequence analysis of Neobenedenia melleni anxb1 (nmanxb1). And RT-qPCR was used to detect the mRNA expressions of nmanxb1 responding to the developmental and environmental changes. The results revealed that NmANXB1 was consist of 4 similar repeats made up of α helices, which contained 3 type II Ca2+binding sites, 6 type III Ca2+binding sites, and a KGD motif. Phylogenetic analysis of the amino acid sequences of some anxs showed that nmanxb1 grouped with other the parasitic helminth anxs belonging to group B. The results of RT-qPCR suggested that nmanxb1 mRNA was mainly expressed in the egg. Thermal stress (cold or hyperthermal stress) caused obviously increased nmanxb1 mRNA expressions in the egg, and hyperthermal and low salinity strss elevated significantly its expressions in the adult. It suggests that nmanxb1 may be involved in development and adaptation to adverse environmental conditions.

Key wordsnmanxb1; sequence anlysis; gene expression; Neobenedenia melleni

收稿日期：2015-09-16；修回日期：2015-09-30

基金項(xiàng)目：國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(2012AA10A403)；“水產(chǎn)”浙江省重中之重開(kāi)放基金(xkzsc1417)

作者簡(jiǎn)介：馬文靜，研究方向?yàn)樗a(chǎn)分子生物學(xué)，E-mail: mawenjing0802@163.com; 通信作者：史雨紅，副教授，研究方向?yàn)樗a(chǎn)分子生物學(xué)，E-mail: shiyuhong0517@163.com。

中圖分類(lèi)號(hào)Q51；Q78

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)2095-1736(2016)03-0005-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.03.005