孫璐璐　朱立楠　鄭冠龍　朱方旭　郭雪冬　Lugo Oke　張忠臣　金正勛（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱　150030；第一作者：sunlulu_1990@163.com；通訊作者：zxjin326@hotmail.com）

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水稻籽粒硝態(tài)氮和銨態(tài)氮積累特性及氮肥調(diào)控研究

孫璐璐朱立楠鄭冠龍朱方旭郭雪冬Lugo Oke張忠臣金正勛*
（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱150030；第一作者：sunlulu_1990@163.com；*通訊作者：zxjin326@hotmail.com）

摘要：選用5個粳稻品種，通過田間和盆栽試驗，分析水稻籽粒中硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量的品種間差異和籽粒中分布特點、灌漿過程中積累動態(tài)變化及其與施氮量和谷氨酰胺合成酶活性間的關(guān)系。結(jié)果表明，精米中硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量品種間有顯著差異，銨態(tài)氮含量高于硝態(tài)氮；硝態(tài)氮和銨態(tài)氮主要分布在籽粒的米糠層里，在籽粒中呈由外到內(nèi)逐漸降低的變化趨勢；隨著施氮量的增加，精米中硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量都大幅度增加，增幅高達114.1%～203.0%，但增加的幅度因品種不同而異；隨灌漿進程的推進，籽粒硝態(tài)氮含量逐漸增多直至成熟，但硝態(tài)氮的日積累量和銨態(tài)氮含量隨灌漿進程逐漸上升，達到峰值后又逐漸下降，呈單峰曲線變化，抽穗后25 d達到峰值，硝態(tài)氮含量高的品種日積累量顯著大于含量低的品種，銨態(tài)氮含量高的品種灌漿前期積累量少于含量低的品種，而灌漿后期的積累量高于含量低的品種；籽粒谷氨酰胺合成酶活性與硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量及硝態(tài)氮日積累量間均呈顯著或極顯著正相關(guān)。

關(guān)鍵詞：水稻；硝態(tài)氮；銨態(tài)氮；積累特性；氮肥調(diào)控

已有研究［1-2］表明，硝酸鹽、亞硝酸鹽和生物堿是合成強致癌物質(zhì)亞硝胺的前體物，人和動物均可利用硝酸鹽、亞硝酸鹽和胺等含氮物質(zhì)合成亞硝胺。聯(lián)合國世界衛(wèi)生組織和糧農(nóng)組織（WHO/FAO）1973年規(guī)定［3］，每kg人體質(zhì)量的硝態(tài)氮日允許攝入量為0～1.06 mg，亞硝態(tài)氮為0～0.04 mg。歐共體食物科學(xué)委員會（SCF）1992年又將亞硝態(tài)氮的允許量降低到0～0.02 mg［4］。

水稻是世界上重要的糧食作物，有約1/2的人口以稻米為主食［5］。中國是世界上水稻總產(chǎn)量最高的國家，同時也是最大的稻米消費國［6］。作物體內(nèi)的硝態(tài)氮和銨態(tài)氮主要來自于根吸收的氮肥，大量施用氮肥已成為水稻取得高產(chǎn)更高產(chǎn)的重要手段之一。然而，大量施用氮肥增產(chǎn)的同時，是否會造成水稻籽粒中硝態(tài)氮、銨態(tài)氮過度積累，進而危害人體健康，迄今未見研究報道。因此，分析水稻籽粒中硝態(tài)氮、銨態(tài)氮分布特點和品種間差異，在灌漿過程中籽粒硝態(tài)氮、銨態(tài)氮積累動態(tài)變化以及與施氮量和氮代謝關(guān)鍵酶活性間的關(guān)系等對生產(chǎn)安全食用稻米具有重要意義。

1　材料與方法

1.1供試材料與田間試驗設(shè)計

選用五優(yōu)稻4號、松粳3號、松粳6號、松粳9號、松粳12號等5個粳稻品種為材料，于2013年在黑龍江省五常市民樂鄉(xiāng)紅光村進行田間試驗。試驗采用裂區(qū)試驗設(shè)計，肥料為主區(qū)，品種為副區(qū)，6 m行長，8行區(qū)，3次重復(fù)。4月6日播種，播種量為每盤催芽籽150 g，大棚盤育苗。5月15日人工插秧，插秧密度為行距30 cm、株距13 cm，每叢插4棵苗。施氮量設(shè)3個水平：不施任何肥料（CK）；施純N 90 kg/hm2（L）；施純N 135 kg/hm2（H）。N∶P2O5∶K2O為1∶0.5∶0.8。磷肥全部作基肥，鉀肥50%作基肥、50%作穗肥。氮肥45%作基肥、25%作分蘗肥、30%作穗肥。其他田間管理同常規(guī)生產(chǎn)。

收獲時以小區(qū)為單位混收脫粒，待自然干燥3個月后磨糙米，糙米經(jīng)1.7 mm分級篩過篩后，使用韓國雙龍公司生產(chǎn)的三立式全自動精米機將糙米分別加工成精米率為85%和90%的精米。用旋渦式粉碎機粉碎糙米和不同精米率的精米，供籽粒硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量和全氮含量測定。

1.2盆栽試驗設(shè)計

選用五優(yōu)稻4號和松粳6號2個粳稻品種為材料，于2014年在哈爾濱東北農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)進行盆栽試驗，盆規(guī)格為長100 cm、寬40 cm、高60 cm。根據(jù)供試品種的生育期進行分期播種，以期使抽穗期盡可能一致，大棚盤育苗，單粒等距離點播催芽籽，5月9日選取長勢一致的秧苗，行距25 cm，株距10 cm，單株插秧，每盆插12棵苗，每個品種插3盆，正常水肥管理。

抽穗時每個供試品種選取長勢相近、且同日抽的穗掛牌標(biāo)記，待抽穗后的第10 d、15 d、20 d、25 d、30 d、35 d分別取掛牌標(biāo)記的稻穗8個，迅速放入液氮中，然后各稻穗中選取灌漿一致的穗中部籽粒30粒，在低溫下去殼去胚后放入凍存管里，置于-80℃冰柜里保存，用于籽粒硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量測定和谷氨酰胺合成酶活性測定。

1.3測定方法

采用張福強［7］改進的酚二磺酸法測定籽粒硝態(tài)氮，采用靛酚藍比色法［8］測定銨態(tài)氮。用半微量凱氏定氮法測定籽粒全氮含量。參照金正勛等［9］方法測定籽粒谷氨酰胺合成酶活性。

表1　品種間精米硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、全氮含量多重比較

表2　糙米和不同精米率稻米硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量比較?。é蘥/g）

2　結(jié)果與分析

2.1精米硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、全氮含量的品種間差異

由表1可見，不同品種間精米硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量、全氮含量以及硝態(tài)氮與全氮、銨態(tài)氮與全氮、無機氮與全氮的百分比等F值均達到極顯著水平，說明供試品種間這些性狀有極顯著的遺傳差異。進一步多重比較可知，松粳12號硝態(tài)氮含量、松粳6號銨態(tài)氮含量、松粳9號全氮含量分別極顯著高于其他品種，增幅分別比最低的松粳6號和五優(yōu)稻4號高1.6倍、1.3倍和1.1倍；松粳12號硝態(tài)氮與全氮的百分比、松粳6號銨態(tài)氮與全氮的百分比最大，而松粳6號和五優(yōu)稻4號最小，而且差異達到極顯著水平；硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量松粳12號都較高，五優(yōu)稻4號都較低，松粳6號是一高一低；硝態(tài)氮含量和硝態(tài)氮與全氮百分比的變異系數(shù)最大，全氮含量變異系數(shù)最小。說明不同基因型品種間稻米積累的硝態(tài)氮量和轉(zhuǎn)化能力有顯著的差異，其積累量高低受控于遺傳基因，而且品種間稻米硝態(tài)氮含量變異遠大于銨態(tài)氮含量的變異。

2.2糙米和不同精米率稻米硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量比較

由表2可見，五優(yōu)稻4號和松粳6號糙米的硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量最高，其次是90%精米率的稻米，而85%精米率的稻米最低，其差異都達到極顯著水平。與糙米相比，90%精米率的五優(yōu)稻4號和松粳6號稻米硝態(tài)氮含量分別降低46.5%和45.3%，銨態(tài)氮含量分別降低82.5%和78.5%；85%精米率的稻米硝態(tài)氮含量分別降低69.4%和68.0%，銨態(tài)氮含量分別降低86.8%和85.7%；與90%精米率的稻米相比，85%精米率的稻米硝態(tài)氮含量分別降低42.8%和41.5%，銨態(tài)氮含量分別降低24.8%和33.6%。說明硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量是由籽粒表層到內(nèi)逐漸降低。

由表2還可見，五優(yōu)稻4號的糙米硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量都高于松粳6號，但90%精米率的稻米中硝態(tài)氮含量是五優(yōu)稻4號高于松粳6號，而銨態(tài)氮含量是松粳6號高于五優(yōu)稻4號，當(dāng)糙米加工成85%精米率時2個品種間硝態(tài)氮含量沒有差異，銨態(tài)氮含量差異較小。

2.3施氮量對精米硝態(tài)氮和銨態(tài)氮及全氮含量的影響

表3　施氮量對精米硝態(tài)氮和銨態(tài)氮及全氮含量的影響

表4　灌漿過程中籽粒硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量變化?。é蘥/g）

由表3可見，5個粳稻品種精米硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量均隨施氮量的增加而極顯著上升，全氮含量雖然因品種不同既有顯著增加的，如五優(yōu)稻4號、松粳3和松粳9號，也有差異不大的，如松粳6號無肥和低肥處理間、松粳12號低肥和高肥處理間差異都不顯著，但總體上看還是增加的。與對照相比，當(dāng)施氮量為90 kg/ hm2時，硝態(tài)氮含量增幅為66.18%～90.52%，平均增加74.90%；銨態(tài)氮含量增幅為9.47%～50.84%，平均增加30.42%；全氮含量增幅為1.66%～6.44%，平均提高3.60%；當(dāng)施氮量為135 kg/hm2時，硝態(tài)氮含量增幅為114.1%～203.0%，平均提高169.2%；銨態(tài)氮含量增幅為52.33%～99.31%，平均增加78.80%；全氮含量增幅為4.13%～11.58%，平均提高6.63%。與施氮量90 kg/hm2相比，當(dāng)施氮量135 kg/hm2時，硝態(tài)氮含量增幅達28.83%～75.02%，平均增加53.73%；銨態(tài)氮含量增幅達11.15%～77.18%，平均增加39.11%；全氮含量增幅達1.02%～4.82%，平均提高2.92%。說明施氮量對精米硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量影響很大，隨著施氮量的增加精米硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量都大幅度地增加，而且增加的幅度因品種不同而異，全氮含量雖然顯著增加，但增加幅度較小。

2.4灌漿過程中籽粒硝態(tài)氮和銨態(tài)氮積累動態(tài)變化

由表4可見，灌漿過程中五優(yōu)稻4號和松粳6號籽粒硝態(tài)氮含量變化趨勢都一致，表現(xiàn)為隨灌漿進程積累量逐漸增多直至成熟，但日積累的量是隨灌漿進程逐漸上升，達到峰值后又逐漸下降，呈單峰曲線變化，2個品種都在抽穗后25 d達到峰值，而且硝態(tài)氮含量高的品種五優(yōu)稻4號日積累量和灌漿同時期硝態(tài)氮含量顯著或極顯著高于含量低的品種松粳6號。說明灌漿過程中籽粒硝態(tài)氮積累量是隨灌漿進程持續(xù)增加，灌漿時間越長積累的量也越多，而且含量高的品種具有更快的積累速度。

灌漿過程中五優(yōu)稻4號和松粳6號籽粒銨態(tài)氮含量均隨灌漿進程逐漸增加，達到峰值后又逐漸下降，呈單峰曲線變化，都在抽穗后25 d達到峰值，抽穗后10 ～25 d籽粒中的銨態(tài)氮含量松粳6號極顯著高于五優(yōu)稻4號，但抽穗后30～35 d卻相反。說明灌漿成熟過程中不同品種間籽粒銨態(tài)氮代謝在時間和程度上均有差異，銨態(tài)氮含量高的品種灌漿前期積累量少于含量低的品種，而灌漿后期含量高的品種積累量多于含量低的品種。

2.5籽粒谷氨酰胺合成酶活性與硝態(tài)氮和銨態(tài)氮積累關(guān)系

由表5可見，水稻灌漿過程中，2個品種的籽粒谷氨酰胺合成酶活性變化趨勢基本一致，表現(xiàn)為隨著灌漿進程酶活性逐漸上升，達到峰值后又逐漸降低，但仍然維持與灌漿中前期同樣的水平，呈單峰曲線變化，五優(yōu)稻4號和松粳6號分別在抽穗后30 d和25 d到達峰值，說明酶活性達到峰值的時間因品種而異。就酶活性高低而言，抽穗后10～25 d的谷氨酰胺合成酶活性松粳6號顯著或極顯著高于五優(yōu)稻4號，但抽穗后30～35 d卻是五優(yōu)稻4號極顯著高于松粳6號，說明既有灌漿中前期酶活性大的品種，也有灌漿中后期酶活性大的品種。

由表6可見，灌漿過程中籽粒谷氨酰胺合成酶活性與硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量及硝態(tài)氮日積累量間均呈正相關(guān)。其中，松粳6號的硝態(tài)氮含量、五優(yōu)稻4號的硝態(tài)氮日積累量與谷氨酰胺合成酶活性的相關(guān)性未達顯著水平外，其他均達到顯著或極顯著水平。說明籽粒谷氨酰胺合成酶活性與硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量及硝態(tài)氮日積累量間有密切關(guān)系，酶活性高有利于促進硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的積累。

表5　灌漿過程中籽粒谷氨酰胺合成酶活性變化?。║/grain）

3　討論

谷氨酰胺合成酶是氮代謝過程中具有多功能的酶，參與調(diào)控很多氮代謝的過程。谷氨酰胺合成酶活性的降低可導(dǎo)致植物體內(nèi)很多氮代謝及糖代謝過程受到影響。張亞麗等［10］研究表明，不同品種對硝態(tài)氮吸收存在著明顯的基因型差異。Larmur等［11］研究表明，不同品種間植株氮的再轉(zhuǎn)運速率差異明顯。本試驗結(jié)果表明，不同品種間稻米硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量存在很大的遺傳差異，籽粒中硝態(tài)氮含量高的品種具有更快的積累速度，積累量和速度都取決于品種的遺傳特性；灌漿過程中籽粒谷氨酰胺合成酶活性與硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量及硝態(tài)氮日積累量間有密切關(guān)系，酶活性高有利于促進硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的積累，而且不同灌漿時期和品種間酶活性大小有極顯著的遺傳差異。這就說明，稻米積累硝態(tài)氮和銨態(tài)氮量的多少取決于品種的遺傳特性，積累量高的品種具有相關(guān)的高功能基因和酶活性。徐振華［12］研究表明，品種間有性雜交后代籽粒谷氨酰胺合成酶活性能產(chǎn)生超親變異，而且酶活性高低與該基因mRNA表達量有密切關(guān)系，也進一步說明基因在氮代謝和硝態(tài)氮積累上起重要的調(diào)控作用。因此，通過品種間雜交育種和基因操作等選育籽粒硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量低的品種是生產(chǎn)綠色安全稻米的最經(jīng)濟有效的途徑。

另外，過量施用氮肥所導(dǎo)致的蔬菜硝態(tài)氮吸收與還原轉(zhuǎn)化不平衡是產(chǎn)生累積的根本原因，吸收與生長不協(xié)調(diào)更使累積過程加?。?3］。由本試驗結(jié)果可知，不施氮肥生產(chǎn)的精米中硝態(tài)氮含量較低，但隨著施氮量的增加，精米中硝態(tài)氮含量大幅度增加，其增幅高達114.1%～203.0%。這就說明，單施過量的氮肥和不合理的施用是促進作物硝態(tài)氮積累的重要原因。前人的研究結(jié)果表明，不施氮處理的玉米植株硝態(tài)氮含量低于施氮處理［14］；硼鉬脅迫將抑制大豆葉片硝酸還原酶活性，增加硝態(tài)氮含量［15］；在菠菜中鉀素含量高的器官，硝態(tài)氮還原轉(zhuǎn)化速度快，氮肥和鉀肥配施可以降低蔬菜的硝態(tài)氮含量［16-17］；抽穗后25 d時增施磷肥和鉀肥的處理籽粒非蛋白氮含量下降［18］，表明不同營養(yǎng)元素對作物氮素吸收利用和積累都起不同的作用。從本試驗結(jié)果也可知，不同灌漿時期籽粒中硝態(tài)氮和銨態(tài)氮積累的量和速度不僅品種間有顯著的遺傳差異，而且隨施氮量的增加，硝態(tài)氮和銨態(tài)氮增加的幅度因品種和施氮量不同而異。因此，在綠色優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)水稻栽培中不僅要控制氮肥施用量，而且還應(yīng)根據(jù)品種對氮素營養(yǎng)的反應(yīng)特性，更加注意氮肥施用時期及配施其他元素肥料，以協(xié)調(diào)水稻籽粒灌漿成熟過程中的碳氮代謝，充分發(fā)揮其籽粒積累淀粉和蛋白質(zhì)的生理功能，促進非蛋白氮的轉(zhuǎn)化是降低籽粒硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量的重要調(diào)控途徑。

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Study on Accumulation Characteristics of Nitrate-N and Ammonia-N in Grain of Rice and Regulation of N-fertilizer

SUN Lulu，ZHU Linan，ZHENG Guanlong，ZHU Fangxu，GUO Xuedong，Lugo Oke，ZHANG Zhongchen，JIN Zhengxun*
（Agricultural College，Northeast Agriculture University，Harbin 150030，China；1st autor：sunlulu_1990@163.com；*Corresponding author：zxjin326@hotmail.com）

Abstract：Based on the field and pot culture experiment of five japonica rice varieties，the content and distribution character of nitrate-N and ammonia-N in the endosperm，their variable trend during the grain filling period and the correlations of N-fertilizer with the enzyme activity of GS among different varieties were analyzed.The results indicated that there was a difference between nitrate-N and ammonia-N content in the mature grain among the rice varieties.The content of ammonia-N is higher than nitrate-N，which both mainly located in rice bran and showed a decline trend from outside to inside.Increasing the N-fertilizer amount led to the increase in the nitrate-N and ammonia-N level by 114.1%～203.0%depending on different varieties；As application of N-fertilizer level raised，each content showed a significant growth.During the filling period，the nitrate-N content in endosperm kept raising until the mature stage，while the accumulation amount of nitrate-N and the content of ammonia-N showed a unimodal curve trend with peak value appearring at the 25th day after heading.Comparing with low nitrate-N content varieties，the daily average growth of nitrate-N was extremely higher than the high content varieties.However，the daily average growth of ammonia-N was lower than the high ammonia-N content varieties at early grain filling stage，but higher at late stage than the low Ammonia-N content varieties.The enzyme activity of GS showed significant difference among different variaties at each stage，having a outstanding positive linear correlation to the content and accumulation rate of ammonia-N and nitrate-N.

Key words：rice；nitrate-N；ammonia-N；accumulation characteristics；N-fertilizer regulation

中圖分類號：S511

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-8082（2016）01-0025-05

收稿日期：2015－09－21

基金項目：科技部“十二五”科技支撐計劃項目（2011BA D16B11-02YJ02）；“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技支撐計劃項目（2013BAD20B04-2S）