郭由兵，程廷才，李開和，盧燕回，王衛(wèi)峰，夏慶友*

（1.家蠶基因組生物學國家重點實驗室，西南大學，重慶 400715；2.中國煙草總公司廣西壯族自治區(qū)公司，南寧 530022）

打頂期煙草組織基因表達分析及打頂對腋芽基因表達的影響

郭由兵1，程廷才1，李開和2，盧燕回2，王衛(wèi)峰2，夏慶友1*

（1.家蠶基因組生物學國家重點實驗室，西南大學，重慶 400715；2.中國煙草總公司廣西壯族自治區(qū)公司，南寧 530022）

打頂是煙葉生產(chǎn)重要的技術(shù)環(huán)節(jié)之一。為了研究煙草（Nicotiana tabacum）打頂期基因表達模式，選取廣西大寧地區(qū)曬黃煙現(xiàn)蕾期10個打頂或非打頂?shù)慕M織樣本，構(gòu)建鏈特異總RNA測序文庫，利用Illumina HiSeq 2000完成測序。通過質(zhì)量控制，獲得9千多萬條測序數(shù)據(jù)，分析獲得50 706個基因的表達信息。篩選組織特異和打頂差異表達基因，共富集687個組織特異表達基因和444個腋芽打頂差異表達基因，為煙草組織基因表達模式和打頂分子響應機制研究提供數(shù)據(jù)支撐，也為調(diào)控煙草營養(yǎng)和生殖生長提供分子靶標。

煙草；打頂；轉(zhuǎn)錄組；生長調(diào)控

煙草（Nicotiana tabacum）是以收獲煙葉為主的經(jīng)濟作物，在其營養(yǎng)生長后期，莖頂形成生殖中心，大量營養(yǎng)物質(zhì)集中到頂端，影響煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。在煙葉生產(chǎn)過程中，打頂抹杈是抑制生殖生長和促進營養(yǎng)生長的有效措施，將引起煙草植株一系列生理生化響應，如增加營養(yǎng)元素的吸收利用、代謝物質(zhì)的積累[1-2]。研究人員利用miRNA測序技術(shù)分析煙草根部對打頂響應的分子機制，發(fā)現(xiàn)打頂差異基因主要涉及激素代謝、轉(zhuǎn)錄、應激反應等[3-4]。楊潔等[5]報道打頂可影響腋芽內(nèi)激素的含量和腋芽的生長，而楊惠娟等[6]報道了打頂差異蛋白能促進光合作用、增強植株抗性。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，3個煙草品種[Basma Xanthi (BX, Oriental)，K326 (Flue-cured)，TN90 (Burley)]的基因組測序完成，共鑒定到9萬多個基因[7]。但迄今為止，打頂期全基因組范圍的基因表達模式卻鮮有報道。本研究采用RNA-seq技術(shù)，對煙草根、莖、葉、腋芽、花蕾、頂芽等組織進行轉(zhuǎn)錄組分析，比較打頂和非打頂樣品的基因表達差異，為揭示煙草打頂響應分子機制和調(diào)控營養(yǎng)和生殖生長提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗選用廣西大寧地區(qū)曬黃煙作為試驗材料。收集現(xiàn)蕾期打頂3 d的根、莖、葉、腋芽等4份樣品，同期未打頂根、莖、葉、腋芽、頂芽和花蕾等6份樣品，共10份組織樣本。所有樣本用液氮保存，用于提取總RNA。

1.2 Illumina測序文庫構(gòu)建

參照TRIZOL Reagent (Cat#15596-018, Life technologies, Carlsbad, CA, US)提取總RNA，采用RNase-Free DNase Set (Cat#79254, QIAGEN, GmBH, Germany)純化。使用Agilent 2100檢查RNA完整性和純度。采用TruSeq? Stranded Total RNA kit (Cat#RS-122-2201, Illumina, CA, US)構(gòu)建Paired-end測序文庫，使用Illumina HiSeq 2000完成測序。

1.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

使用軟件fqtrim (v0.9.4, http://ccb.jhu.edu/ software/fqtrim/index.shtml)去除ployA，Bowtie（version 2.2.5）[8]去除rRNA序列，Trimmamotic（Version 0.36）[9]去除接頭、低質(zhì)量堿基和長度較短的讀段(Reads)，fastqc (v0.11.2, http://www. bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)檢測數(shù)據(jù)質(zhì)量。處理后的數(shù)據(jù)使用RSEM[10](v1.2.22)比對到煙草K326（Nicotiana tabacum K326）的參考基因集上，對樣本中的基因表達定量。煙草K326的參考基因集數(shù)據(jù)下載自煙草基因組數(shù)據(jù)庫(http://solgenomics.net)[11]。通過腳本程序abundance_estimates_to_matrix.pl將基因表達結(jié)果整合成表達矩陣，并采用TMM（M值的截尾均值，Trimmed Mean of M-values）方法均一化。采用軟件edgeR[12]鑒定樣本間差異表達的基因，腳本程序get_tissue_enriched_DE_one_vs_all.pl分析各樣本富集的高表達基因。

1.4 GO和KEGG注釋與富集分析

基因功能注釋使用Trinonate流程(v2.0.2, http:// trinotate.github.io/)完成，采用KAAS（KEGG自動注釋系統(tǒng)，KEGG Automatic Annotation Server）[13]對基因進行KEGG（京都基因和基因組百科全書，Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）注釋。通過WEGO (在線基因本體注釋圖示，Web Gene Ontology Annotation Plot)[14]比較打頂差異表達基因的功能。GO（基因本體，Gene Ontology）和KEGG富集通過程序GO_seq[15]軟件完成。以上perl腳本來自Trinity[16]軟件，相關(guān)圖表由軟件R和Excel生成。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)統(tǒng)計

經(jīng)過質(zhì)量控制的測序數(shù)據(jù)比對到參考基因集上，共獲得50 706個基因的表達信息。由于參考序列僅為基因集，不能代表全基因組，因此各個樣本的比對率較低（表1）。樣本間比對率存在差異，如 打頂樣本中，葉和根的比對率為23.38%和31.94%，其余樣本的比對率都在35%以上。以FPKM（每百萬測序片段覆蓋每千堿基片段數(shù)，F(xiàn)ragments Per Kilobase per Million）值大于等于2為限，各樣本表達的基因占總基因數(shù)的2/3（66.84%）以上，表達的轉(zhuǎn)錄本占總轉(zhuǎn)錄本數(shù)的1/3（36.63%）以上。為避免高表達和零表達基因的干擾，對FPKM矩陣進行l(wèi)og10(FPKM+1)轉(zhuǎn)化（圖1），結(jié)果顯示基因在各樣本中的表達相對均衡。上述結(jié)果表明，盡管各樣本測序數(shù)據(jù)和比對率存在差異，但基因表達相對均衡，其結(jié)果可用于下游分析。

表1 RNA-seq數(shù)據(jù)統(tǒng)計Table 1 Summary of RNA-seq data

圖1 各樣本中表達基因分布Fig. 1 Distribution of expressed genes in each sample

2.2 組織特異基因表達模式分析

通過差異表達基因分析，獲得煙草組織特異表達的基因，即在某一組織高表達且與其他所有組織都有顯著差異的基因。利用組織特異表達基因的FPKM值繪制熱圖（圖2），結(jié)果顯示根部含有數(shù)目較多的特異表達基因，暗示地上部分和地下部分在基因表達上的差異，在轉(zhuǎn)錄水平上揭示了煙草根部組織的特異性。葉片中存在一類高表達的基因，且在花蕾、腋芽、芽和莖中也有表達，功能注釋顯示這些基因可能與光合作用及色素合成代謝相關(guān)。

2.3 組織特異表達基因功能注釋

圖2 組織差異基因表達模式Fig. 2 Expression patterns of tissue-specific genes

通過軟件GO_seq對特異表達基因進行GO富集。相較于其他組織，根部有較多的特異表達基因，主要涉及響應刺激物（GO:0050896 response to stimulus）、物質(zhì)運輸（GO:0006810 transport）、氧化還原（GO:0055114 oxidation- reduction process）、天然免疫（GO:0045087 innate immune response）和細胞程序性死亡（GO: 0012501 programmed cell death）等。其中煙草生物堿合成過程中的腐胺N甲基轉(zhuǎn)移酶全部在根部特異表達，和生物堿合成相關(guān)的腐胺、聚胺等物質(zhì)合成相關(guān)基因也在根部特異表達，表明煙草根系是生物堿合成的重要場所。氧化還原過程中的血紅素結(jié)合、氧化還原酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶等相關(guān)酶類，在根部都特異表達，暗示根部存在特殊的氧化還原保護機制。這與研究人員報道的生物堿和抗氧化基因在根部上調(diào)表達是一致的[3,7]。葉片特異表達的基因主要和光合作用相關(guān)，組成包括葉綠體、類囊體膜以及光合體系等組分，涉及光合作用、光呼吸、丙酮酸代謝等生物學過程，包括果糖二磷酸醛縮酶、醛裂解酶、果糖1,6-二磷酸1-磷酸酶等功能基因。這些基因的特異表達是葉片進行光合作用的分子基礎?；ɡ偬禺惐磉_的基因主要涉及苯酸鹽羥化降解、天冬氨酸代謝等生物學過程，相應的分子功能為酵母賴氨酸脫氫酶（GO:0004753 saccharopine dehydrogenase activity）、丙氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶（GO:0008453 alanine- glyoxylate transaminase activity）、alpha-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（GO:0046556 alpha-L- arabinofuranosidase activity）和天冬氨酰合酶（GO: 0004066 asparagine synthase activity）等。這些基因的表達，暗示花蕾中存在復雜的物質(zhì)代謝過程。

腋芽位于煙草莖上葉的腋部，具有萌發(fā)成分枝的潛力。腋芽組織特異表達的基因主要是與環(huán)境響應、轉(zhuǎn)錄和幾丁質(zhì)酶活性等功能相關(guān)，主要包括水份或壓力應激相應，DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子等功能，可能與基因表達調(diào)控相關(guān)。參與幾丁質(zhì)酶降解過程的幾丁質(zhì)酶也在腋芽中富集表達，幾丁質(zhì)是僅次于纖維素的細胞內(nèi)最豐富的有機化合物，其降解在細胞營養(yǎng)循環(huán)中發(fā)揮著重要作用。這些結(jié)果暗示打頂期的腋芽正加快物質(zhì)循化和功能分化。

利用KAAS對基因集進行KEGG功能注釋，共注釋11 318個基因。組織特異表達基因的KEGG富集分析顯示，葉中富集到的ALDO、rbcS、GAPA、FBP等基因與光合作用相關(guān)（表2），GGAT參與碳固定和氨基酸代謝[17]，DOX1參與長鏈脂肪酸a氧化的起始步驟，與植物抗菌或其他病原反應相關(guān)[18]。

表2 組織特異表達基因KEGG注釋富集Table 2 Enrichment of KEGG annotation of tissue-specific genes

2.4 打頂差異基因分析

利用edgeR軟件，以樣本間基因表達差異倍數(shù)大于等于4，且基因在樣本間差異顯著的P值小于等于0.001（即P-vlaue≤1e-3和|log2(FC)|≥2）為標準，計算樣本間的基因表達差異。比較葉、莖、腋芽、根四組打頂與未打頂樣本的基因表達差異，發(fā)現(xiàn)腋芽中差異基因最多，莖、根中存在少量差異基因，暗示打頂對腋芽的影響遠大于其他組織。同時，打頂腋芽和頂芽僅有16個差異表達基因，暗示打頂后腋芽的頂端優(yōu)勢抑制解除，替代頂芽成為新的生長點。以未打頂?shù)囊秆繛閰⒄諛颖荆▓D3），打頂腋芽和未打頂腋芽相比，上調(diào)152個基因，其中105個在芽中同樣也上調(diào)，約占69.08%，下調(diào)292個基因，其中245個在芽中也同樣上調(diào)，約占83.90%，暗示這些基因在頂芽萌發(fā)和打頂后腋芽發(fā)育中起著關(guān)鍵作用。

圖3 打頂處理的腋芽和頂芽差異表達基因數(shù)量比較Fig. 3 Comparison of differentially expressed genes in apical buds and axillary buds upon topping

2.5 打頂差異基因的功能注釋

比較腋芽打頂差異表達基因的GO功能注釋（圖4），結(jié)果顯示打頂上調(diào)的基因主要分布在GO注釋的細胞組分類目下，涉及細胞壁、細胞質(zhì)部分、蛋白復合物、轉(zhuǎn)運載體和形態(tài)學構(gòu)成等。打頂下調(diào)的基因主要分布在GO注釋的分子功能和生物學過程類目下，涉及的生物學過程有DNA結(jié)合，蛋白質(zhì)結(jié)合，RNA合成和轉(zhuǎn)錄，應激和耐受性，激素響應和抗毒素的合成等。RNA合成和轉(zhuǎn)錄受抑制，延緩細胞功能的進一步分化；激素和抗毒素的合成下降，減緩頂端優(yōu)勢，促進腋芽生長。腋芽中的細胞組分類蛋白上調(diào)則是腋芽向營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)變的開始，暗示打頂后腋芽由先前的功能分化向營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)變。

圖4 腋芽打頂差異表達基因GO功能注釋Fig. 4 GO functional output of differentially expressed genes after topping in axillary buds

表3 腋芽打頂差異表達基因KEGG注釋富集Table 3 Enrichment of KEGG annotation differentially expressed genes in axillary buds after topping

依據(jù)KAAS的注釋結(jié)果，對腋芽打頂差異表達基因進行KEGG富集分析（表3）。與未打頂腋芽相比，打頂腋芽中的基因表達模式發(fā)生了顯著變化。上調(diào)的組蛋白H2A、H4為核小體組裝因子，可導致核內(nèi)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重塑[19-20]；RPS10為線粒體中核糖體的組成部分之一，上調(diào)表達導致線粒體大小亞基比例失調(diào)，影響植株的休眠與復蘇[21-22]；TIP和PIP為水通道蛋白，可維系細胞內(nèi)水分平衡，其上調(diào)表達可增進細胞對水分的吸收[23-24]；LHCA3為光合作用觸角蛋白，以較慢的速率吸收紅光[25]，暗示打頂后腋芽中光合作用也受到影響。打頂腋芽下調(diào)的TPS和sacA參與海藻糖和蔗糖的代謝，有研究顯示TPS與冬小麥耐寒特性相關(guān)[26]；WRKY33和HSFF為轉(zhuǎn)錄因子，WRKY33參與植物與病原菌的相互作用[27]；PRR5抑制植物的避蔭反應，影響植物周期節(jié)律[28]。

3 討 論

本研究采集打頂期10個組織樣本，基于RNA-Seq技術(shù)，獲得50 706個基因的表達信息。由于公共數(shù)據(jù)庫中煙草基因組的注釋信息并不完整，因此，將測序數(shù)據(jù)比對到基因集上，分析基因表達模式。分析中測序數(shù)據(jù)比對到基因集上的比對率較低，可能是由于參考基因集僅來自根和葉[7]，且根、葉與環(huán)境接觸較多，取樣過程中難免存在污染，同時基因表達具有的時期和條件的特異性，共同導致分析的組織中根和葉的比對率不高。即使如此，以FPKM值大于等于2為限，超過總基因和轉(zhuǎn)錄本的2/3（66.84%）和1/3（36.63%）是表達的。各樣本表達基因數(shù)目和FPKM分布相對均衡，數(shù)據(jù)可以用于比較分析。

分析組織特異表達基因發(fā)現(xiàn)，根和葉中含有較多的特異基因（351和208個），這與根和葉具有活躍代謝活動的組織特性是相符的[7]。與其他組織相比，根部有較多的特異基因表達，在轉(zhuǎn)錄水平上揭示了地上組織與地下組織的區(qū)別。對特異表達基因功能注釋發(fā)現(xiàn)，根部特異表達的基因多參與環(huán)境響應、氧化還原以及物質(zhì)運輸，從轉(zhuǎn)錄水平反映了根與環(huán)境的緊密接觸和在植株攝取營養(yǎng)中的關(guān)鍵作用。另外，生物堿合成相關(guān)的基因在根部富集表達，暗示根部是生物堿合成的重要場所，這與先前的報道是一致的[7]。作為光合作用的主要場所，葉片中富集表達了一系列的酶、葉綠體組分、暗反應等光合作用相關(guān)的基因?；ɡ僮鳛樯称鞴伲患磉_的基因中較多地涉及苯酸鹽羥化降解、天冬氨酸類氨基酸代謝等相關(guān)過程，暗示花蕾中存在較為復雜的生殖代謝過程[29]。與此對應，腋芽中特異表達的基因除與環(huán)境相關(guān)，還包括轉(zhuǎn)錄因子，能調(diào)控相關(guān)基因的表達，暗示腋芽有進一步分化或增殖的潛力[2,30]。

打頂抹杈是煙草生產(chǎn)的重要技術(shù)環(huán)節(jié)，可以打破生殖與營養(yǎng)生長的平衡，使較多的營養(yǎng)富集到葉片中，從而提高煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)。比較打頂對各組織中基因表達的影響，發(fā)現(xiàn)腋芽中含有較多的差異基因，根、莖及葉等組織中基因表達差異不明顯，打頂后腋芽中的基因表達模式更趨向于頂芽。這些結(jié)果暗示打頂后如不及時抹杈，腋芽可能取代頂芽成為新的生長中心，根、葉等組織不再產(chǎn)生明顯變化，無法實現(xiàn)提高葉片產(chǎn)量的目標，從轉(zhuǎn)錄水平證實了打頂后抹杈的必要[31-34]。

4 結(jié) 論

本研究采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，對10個煙草組織樣本進行轉(zhuǎn)錄組測序，獲得超過5萬個基因的表達信息，揭示各組織樣本的基因表達特征以及植株對打頂?shù)捻憫獧C制。結(jié)果表明根部主要富集生物堿等物質(zhì)合成代謝相關(guān)基因，葉片富集光合作用相關(guān)基因。比較打頂差異表達基因，顯示腋芽具有440余差異表達基因，明顯高于其他組織樣本，暗示打頂主要影響煙草腋芽生長發(fā)育。

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Analysis of Expressed Genes at the Topping Stage and Effects of Topping to Genes Expression in Axillary Buds in Nicotiana tabacum

GUO Youbing1, CHENG Tingcai1, LI Kaihe2, LU Yanhui2, WANG Weifeng2, XIA Qingyou1*

(1. State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. China Tobacco Guangxi Zhuang Autonomous Region Corporation, Nanning 530022, China)

Topping is one of the important technical procedures of Nicotiana tabacum production. In order to study the gene expression patterns at the topping stage in Nicotiana tabacum, we selected the Daning tobacco growing area in Guangxi and collected ten tissue samples at the topping stage. The samples were used to extract total RNAs and to construct stranded specific total RNA sequencing library and to sequence using the Illumina HiSeq 2000 sequencer. Through quality control, more than 91 million clean reads were obtained and a total of 50706 genes were detected to be expressed from ten tissues at the topping stage. After normalization, screening for tissue-specific and genes differentially expressed among tested tissues, a total of 687 genes were identified to be tissue-specifical and 444 genes showed differential expression before and after topping. Above data and results will not only provide some support for exploring the molecular responses of topping, but also provide molecular targets for the regulatiion of Nicotiana tabacum vegetative and reproductive growth.

Nicotiana tabacum ; topping; transcriptome; growth regulation

S572.03

1007-5119（2016）06-0014-07

10.13496/j.issn.1007-5119.2016.06.003

廣西壯族自治區(qū)煙草公司科技創(chuàng)新項目“廣西賀州大寧曬煙基因組測序、表達譜芯片和代謝組學研究”(GYK201226)

郭由兵（1989-），男，碩士研究生，研究方向為生物信息學。E-mail：gyoubing@yeah.net。*通信作者，E-mail：xiaqy@swu.edu.cn

2016-05-06

2016-09-30