葉建新　林　航　穆軍山　崔曉萍

南京軍區(qū)福州總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科　福建醫(yī)科大學(xué)福總臨床醫(yī)學(xué)院　福州　350025

熱射病大鼠中eNOS和iNOS 基因的表達(dá)

葉建新林航穆軍山崔曉萍

南京軍區(qū)福州總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科福建醫(yī)科大學(xué)?？偱R床醫(yī)學(xué)院福州350025

【摘要】目的研究熱射病大鼠中內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)基因的表達(dá)。方法構(gòu)建經(jīng)典型和勞力型熱射病大鼠模型，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測不同熱射病大鼠模型的腦、肝、腎和心臟組織中eNOS和iNOS 基因的表達(dá)情況。結(jié)果2種熱射病大鼠中，eNOS和iNOS mRNA在腦、肝、腎和心臟組織中的表達(dá)量均高于對照組；eNOS mRNA在勞力型熱射病大鼠各器官中的表達(dá)量高于經(jīng)典型熱射病大鼠(P<0.05)；iNOS mRNA在經(jīng)典型熱射病大鼠的腦、肝和腎組織中的表達(dá)量低于勞力型熱射病大鼠(P<0.05)，在心臟組織中，二者無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)論eNOS和iNOS mRNA的上調(diào)表達(dá)在熱射病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

【關(guān)鍵詞】內(nèi)皮型一氧化氮合酶；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶；熱射病；大鼠

熱射病(heat stroke，HS)是一種致死率較高的中暑類型，80歲以上患者病死率可達(dá)80%，具有發(fā)病快的特征，早期受影響的器官主要是腦、肝、腎和心臟[1]。NO是生物體內(nèi)調(diào)節(jié)血管舒張、細(xì)胞免疫等的重要信號因子。在熱射病發(fā)病機(jī)制中伴隨NO含量的異常。內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)是調(diào)節(jié)機(jī)體NO含量的重要蛋白[2]，因此本文構(gòu)建熱射病大鼠，并研究在熱射病大鼠的腦、肝、腎和心臟中eNOS和iNOS的表達(dá)情況。

1材料和方法

1.1材料人工實(shí)驗(yàn)環(huán)境模擬艙(本院實(shí)驗(yàn)研究中心)；分光光度計(jì)；RT-6000全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國Bio-rad公司)；Powlab/8sp生理記錄儀(澳大利亞instruments公司)；大鼠直腸溫度傳感器(北京渠道科學(xué)器材有限公司)；ZH-PP型計(jì)算機(jī)控制動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)(美國通用限公司)。

1.2方法

1.2.1熱射病大鼠模型制備：選擇SPF級♂SD大鼠90只(本院動(dòng)物研究中心提供)，體質(zhì)量(190±11.4)g，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，溫度為23 ℃，濕度(55±5)%，并進(jìn)行15 min/d、30 m/min的跑臺(tái)適應(yīng)性訓(xùn)練。隨機(jī)選擇10只為正常對照組(NC組)，40只構(gòu)建經(jīng)典型熱射病(classic heat stroke，CHS)大鼠模型，40只構(gòu)建勞力型熱射病(exertional heat stroke，EHS)大鼠模型。NC組維持原有飼養(yǎng)條件，CHS組和EHS組于40 ℃模擬艙中飼養(yǎng)，濕度(65±0.5)%，EHS組進(jìn)行30 m/min的跑臺(tái)訓(xùn)練，每運(yùn)動(dòng)30 min休息10 min。實(shí)驗(yàn)期間禁食禁水8 h。

1.2.2生理指標(biāo)測量和標(biāo)本采集：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后分別測量3組大鼠的直腸體溫(core temperature，Tr)、呼吸頻率(respiratory rate，RR)、平均動(dòng)脈壓(mean arterial pressure，MAP)和心率(heart rate，HR)。活殺大鼠，取出腦、肝、腎和心臟組織置于液氮中保存。

1.2.3mRNA提取與cDNA制備：分別從保存的腦、肝、腎和心臟組織中取100 mg組織置于液氮中研磨，利用mRNA提取試劑盒提取mRNA，利用一步法cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國天根公司)獲得cDNA。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測各組織中eNOS和iNOS表達(dá)水平：利用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行real-time PCR實(shí)驗(yàn)。引物分別為：eNOS-F：5’-ACGCCCGTCTTCCACCA-3’；eNOS-R：5’-ACGCCTTCACTCGCTTCG-3’；iNOS-F：5’-CCTCGGCTCCAGCATGTAC-3’；iNOS-R：5’-CATTGGAAGTGAAGCGTTTCG-3’；GAPDH-F：5’-GTGCTGAGTATGTCGTGGAGTC-3’；GAPDH-R：5’-CAGTTGGTGGTACAGGAGGC-3’。反應(yīng)條件為90 ℃ 5 s，57 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，重復(fù)45個(gè)循環(huán)。利用2-△△t進(jìn)行計(jì)算。

2結(jié)果

2.1正常大鼠與熱射病大鼠的生理指標(biāo)CHS組和EHS組的直腸體溫、呼吸頻率、平均動(dòng)脈壓和心率均高于正常大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與CHS組相比，EHS組直腸體溫、呼吸頻率、平均動(dòng)脈壓和心率較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1　正常大鼠與熱射病大鼠的生理指標(biāo)比較±s)

注：與NC組相比，①P<0.05；與CHS組相比，②P<0.05

2.2正常大鼠與熱射病大鼠各器官eNOS mRNA表達(dá)水平CHS組和EHS組大鼠的腦組織中eNOS mRNA表達(dá)水平分別為對照組的1.34和1.69倍，在肝臟組織中分別為對照組的1.46和1.73倍，在腎組織中分別為對照組的1.68和1.88倍，在心臟組織中分別為對照組的1.68和1.75倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)，CHS組大鼠腦、肝、腎和心臟組織中eNOS mRNA表達(dá)水平均低于EHS組(P<0.05)。見圖1。

圖1　eNOS mRNA相對表達(dá)量

2.3正常大鼠與熱射病大鼠各器官iNOS mRNA表達(dá)水平CHS組和EHS組大鼠的腦組織中iNOS mRNA表達(dá)水平分別為對照組的1.14和1.33倍，在肝臟組織中分別為對照組的1.346和1.65倍，在腎組織中分別為對照組的1.52和1.87倍，在心臟組織中分別為對照組的1.44和1.76倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)，CHS組大鼠的腦、肝和腎組織中eNOS mRNA表達(dá)水平均低于EHS組(P<0.05)，但在心臟組織中，CHS組與EHS組無明顯差異(P>0.05)。見圖2。

圖2　iNOS mRNA相對表達(dá)量

3討論

熱射病發(fā)病迅速，前期具有頭暈乏力、體溫升高(≥40 ℃)、皮膚干熱等病征，繼而可引發(fā)永久性神經(jīng)損傷和外周組織損傷，是致死率較高的中暑疾病。熱射病分為經(jīng)典型熱射病和勞力型熱射病。其中經(jīng)典性熱射病多見于老年人及免疫功能受損人群，多由長時(shí)間暴露于高溫高濕度環(huán)境造成。勞力性熱射病多見于運(yùn)動(dòng)員和士兵等年輕個(gè)體，由在高溫高濕度環(huán)境中劇烈長時(shí)間運(yùn)動(dòng)造成[3-5]。

本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建經(jīng)典型熱射病和勞力型熱射病大鼠模型，對熱射病的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行研究。通過測定對照組、CHS組和EHS組大鼠的直腸體溫、呼吸頻率、平均動(dòng)脈壓和心率發(fā)現(xiàn)，CHS組和EHS組大鼠的直腸體溫、呼吸頻率、平均動(dòng)脈壓和心率均高于對照組，且EHS組也高于EHS組，這與不同類型熱射病的臨床病征相符，說明所構(gòu)建的經(jīng)典型熱射病和勞力型熱射病大鼠模型可以用于研究熱射病的相關(guān)病理特征。

熱射病早期出現(xiàn)功能異常的器官主要是腦、肝、腎和心臟，主要表現(xiàn)為腦部神經(jīng)受損、肝功能衰竭、腎衰竭及心臟衰竭等現(xiàn)象。NO作為細(xì)胞信號因子參與調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)的多種生理活動(dòng)，包括神經(jīng)傳遞、血管舒張、細(xì)胞免疫和細(xì)胞微環(huán)境的構(gòu)建等[6]。當(dāng)機(jī)體內(nèi)NO含量增加，可能神經(jīng)細(xì)胞受損，腦組織損傷，過度炎癥反應(yīng)甚至器官功能衰竭。在熱射病病人中，常伴NO含量異常增高的現(xiàn)象，因此，NO含量可能是導(dǎo)致熱射病病人全身炎癥反應(yīng)綜合征及其介導(dǎo)多器官功能障礙綜合征的重要誘因之一。

機(jī)體調(diào)節(jié)NO含量主要依賴于內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)。eNOS是一種鈣調(diào)節(jié)蛋白，主要存在于動(dòng)脈血管壁的內(nèi)皮細(xì)胞，其合成的NO主要參與調(diào)節(jié)血管收縮，保持血壓穩(wěn)定和血流正常供應(yīng)[7]。iNOS在正常情況下表達(dá)量較低，當(dāng)有細(xì)胞因子、藥物及脅迫條件處理時(shí)，表達(dá)量增加，主要參與單核巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)的炎癥反應(yīng)過程中血管生成，也參與平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中的血管擴(kuò)張及生成[8]。因此，本文重點(diǎn)研究了在不同熱射病大鼠的腦、肝、腎和心臟中eNOS和iNOS的表達(dá)情況。

通過real-time PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與正常大鼠相比，熱射病大鼠的腦、肝、腎和心臟中的eNOS mRNA表達(dá)水平明顯增高，且在勞力型熱射病大鼠的各器官中，eNOS mRNA表達(dá)水平高于經(jīng)典型熱射病大鼠。與肝、腎和心臟相比，熱射病大鼠腦中eNOS mRNA的表達(dá)水平增加幅度較小，這可能是由于腦部主要的NO調(diào)節(jié)酶是以同為鈣調(diào)性的神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)為主造成的。與eNOS mRNA表達(dá)趨勢類似，在正常組大鼠各器官中，iNOS mRNA表達(dá)水平低于熱射病大鼠，且經(jīng)典型熱射病大鼠的腦、肝和腎組織中iNOS mRNA表達(dá)水平低于勞力型熱射病。值得注意的是，在心臟組織中，勞力型熱射病大鼠的iNOS mRNA表達(dá)水平與經(jīng)典型熱射病大鼠無顯著性差別(P>0.05)，說明iNOS在不同熱射病大鼠模型的心臟組織中的功能差異并不明顯。本文結(jié)果顯示，eNOS和iNOS在熱射病大鼠中表達(dá)量均有所上調(diào)，在熱射病大鼠的腦、肝、腎和心臟中均發(fā)揮重要作用。

4參考文獻(xiàn)

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(收稿 2015-06-02)

The expressions of eNOS and iNOS mRNA in heat stroke rats

YeJianxin，LinHang，MuJunshan，CuiXiaoping

DepartmentofNeurology，F(xiàn)uzhouGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand，PLAandClinicalMedicalCollegeofFujianMedicalUniversity，F(xiàn)uzhou350025，China

【Abstract】Objective To observe the expressions of eNOS and iNOS mRNA in heat stroke rats.Methods We constructed classic heat stroke rats model and exertional heat stroke rats model，then real-time PCR was used to value the expression of eNOS and iNOS mRNA in brain，liver，kidney and heart in heat stroke rats and normal rats.Results The expressions of eNOS and iNOS mRNA in brain，liver，kidney and heart in heat stroke rats were higher than those in normal rats，the expression of eNOS was lower in classic heat stroke rats than that in exertional heat stroke rats.iNOS mRNA expressed more in brain，liver and kidney in exertional heat stroke rats than classic heat stroke rats，but there was no significant difference in heart between the two models.Conclusion The elevate expressions of eNOS and iNOS mRNA influence the progress of heat stroke.

【Key words】eNOS；iNOS；Heat stroke；Rat

基金項(xiàng)目：南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)科技創(chuàng)新課題(編號：MS130)

【中圖分類號】R-332

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號】1673-5110(2016)11-0007-02