朱九濱, 李爽芹, 梁寶東, 李湘利

(濟(jì)寧學(xué)院生命科學(xué)與工程系，山東曲阜 273155)

菌株0206產(chǎn)PHA的發(fā)酵條件優(yōu)化

朱九濱, 李爽芹, 梁寶東, 李湘利

(濟(jì)寧學(xué)院生命科學(xué)與工程系，山東曲阜 273155)

摘要[目的]優(yōu)化菌株0206產(chǎn)PHA株的發(fā)酵條件。[方法]以菌株0206為試驗(yàn)菌株，對(duì)碳源、氮源、培養(yǎng)基pH和培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行了單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)。[結(jié)果]從活性污泥中分離篩選到高產(chǎn)PHA的菌株0206，通過生理生化鑒定，菌株0206為芽孢桿菌屬，菌株0206產(chǎn)PHA最優(yōu)發(fā)酵條件為葡萄糖10 g/L，硫酸銨10 g/L，氯化鈉2 g/L，培養(yǎng)基pH 7.0，培養(yǎng)時(shí)間48 h。[結(jié)論]優(yōu)化了菌株0206產(chǎn)PHA的發(fā)酵條件，為PHA的發(fā)酵提供參考。

關(guān)鍵詞PHA；生理生化鑒定；發(fā)酵條件優(yōu)化

聚羥基脂肪酸酯(PHA)作為一種新穎的生物材料,其生物組織相容性和可降解性已得到人們的認(rèn)可,具有良好的應(yīng)用前景[1]。PHA因具有優(yōu)越的理化性質(zhì),近年來在電學(xué)、光學(xué)、生物醫(yī)學(xué)等高技術(shù)領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用[2-3]。

PHA在生物體內(nèi)作為碳源和能源的貯藏物而存在[4]。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)PHA在國(guó)內(nèi)外都有大量研究,但在生產(chǎn)過程中仍存在一系列問題,尤其是生產(chǎn)能力低和生產(chǎn)成本過高[5],這制約了生物發(fā)酵生產(chǎn)PHA工業(yè)的擴(kuò)大和PHA的應(yīng)用。筆者以從活性污泥中篩選出來的產(chǎn)PHA菌株0206為試驗(yàn)菌株,通過優(yōu)化發(fā)酵條件,比較不同發(fā)酵條件下的活菌數(shù),旨在為PHA的發(fā)酵提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1菌株。菌株0206：濟(jì)寧學(xué)院生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心分離獲得。

1.1.2培養(yǎng)基。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[6]：牛肉膏5 g，蛋白胨5 g，NaCl 2 g，水1 000 mL，pH 7.5。生理生化鑒定培養(yǎng)基：蛋白胨水培養(yǎng)基、明膠液化試驗(yàn)培養(yǎng)基、石蕊牛奶試驗(yàn)培養(yǎng)基、葡萄糖利用試驗(yàn)培養(yǎng)基、甲基紅試驗(yàn)培養(yǎng)基、過氧化氫酶試驗(yàn)培養(yǎng)基。

1.2菌株0206的生理生化鑒定對(duì)篩選出的菌株按照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[7]進(jìn)行菌落形態(tài)和生理生化特征鑒定。

1.3菌株0206產(chǎn)PHA的發(fā)酵條件優(yōu)化

1.3.1單因素試驗(yàn)

1.3.1.1碳源對(duì)菌株0206產(chǎn)PHA的影響。分別用葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、淀粉(接入量為10 g/L)代替牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中的碳源，接入1 mL搖瓶培養(yǎng)的高產(chǎn)PHA菌株的菌液，搖瓶培養(yǎng)36 h后，吸取1 mL菌液加入裝有9 mL無菌水的試管中，以此為10-1稀釋菌懸液，用旋渦振蕩器混勻。按上述操作順序，分別制成10-2～10-7梯度稀釋菌懸液。取0.1 mL適當(dāng)稀釋的菌懸液涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48h后，對(duì)培養(yǎng)基中的菌落數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，做3個(gè)平行，計(jì)算原培養(yǎng)液中的活菌總數(shù)，并結(jié)合熒光顯微鏡觀察菌株的熒光強(qiáng)度，以確定不同碳源對(duì)菌株產(chǎn)PHA的影響，從而確定最佳碳源。

在確定最佳碳源的基礎(chǔ)上，用同樣的方法研究碳源濃度對(duì)菌株0206生長(zhǎng)和產(chǎn)PHA的影響，從而確定該碳源的最適濃度。

1.3.1.2氮源對(duì)菌株0206產(chǎn)PHA的影響。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基在確定碳源及其濃度的基礎(chǔ)上，分別用酵母粉、精氨酸、NH4Cl、尿素、硫酸銨(接入量10 g/L)代替優(yōu)化碳源后培養(yǎng)基中的氮源，按“1.3.1.1”的方法確定最佳氮源及其最適濃度。

1.3.1.3培養(yǎng)基pH對(duì)菌株0206產(chǎn)PHA的影響。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基在確定最佳碳源、氮源的基礎(chǔ)上，調(diào)節(jié)不同初始pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，按“1.3.1.1”的方法確定培養(yǎng)基的最佳初始pH。

1.3.1.4培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株0206產(chǎn)PHA的影響。以最佳碳源、氮源代替牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中的碳源和氮源，調(diào)節(jié)最佳初始pH，接入1 mL搖瓶培養(yǎng)的高產(chǎn)PHA菌株的菌液，搖瓶培養(yǎng)24、30、36、42、48、54、60 h后，按“1.3.1.1”的方法測(cè)試不同培養(yǎng)時(shí)期菌株0206的生長(zhǎng)狀況和產(chǎn)PHA情況。

1.3.2正交試驗(yàn)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇碳源、氮源、培養(yǎng)基pH及培養(yǎng)時(shí)間為影響因素，設(shè)計(jì)4因素3水平L9(34)的正交試驗(yàn)。按表1進(jìn)行正交試驗(yàn)，每組試驗(yàn)做3個(gè)平行，以活菌數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定產(chǎn)PHA菌株的最佳發(fā)酵條件。

表1　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平

2結(jié)果與分析

2.1形態(tài)特征和生理生化鑒定

2.1.1形態(tài)特征。高產(chǎn)PHA菌株0206在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)見圖1。該菌的菌落形態(tài)特征：菌落較小，呈圓形，中間凸起，邊緣光滑，不透明，黃色，表面較干燥，易于挑取。

圖1　菌株0206菌落形態(tài)Fig.1　Colony morphology of strain 0206

2.1.2生理生化鑒定。按照菌落特征和生理生化鑒定結(jié)果，參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，并對(duì)其進(jìn)行芽孢染色，將菌株0206初步鑒定為芽胞桿菌屬(BacillusCohn)(表2)。

表2植株0206生理生化鑒定結(jié)果

Table2Physiologicalandbiochemicalidentificationresultsofstrain0206

鑒定項(xiàng)目Identificationitems鑒定結(jié)果Identificationresults鑒定項(xiàng)目Identificationitems鑒定結(jié)果Identificationresults明膠液化Gelatinliguefaction液化吲哚試驗(yàn)Indoletest+石蕊牛奶Litmusmilk胨化葡萄糖利用Glucoseutilization產(chǎn)酸甲基紅試驗(yàn)Methylredtest-革蘭氏染色紫色(+)過氧化氫酶Catalase+

注：“+”表示陽性，“-”表示陰性。

Note:“+”indicatespositive,“-”indicatesnegative.

2.2菌株0206產(chǎn)PHA的發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1單因素試驗(yàn)

2.2.1.1碳源對(duì)菌株0206產(chǎn)PHA的影響。由圖2可知，不同碳源對(duì)菌株0206的影響不同，葡萄糖的平均活菌數(shù)最大。在確定菌株最佳碳源(葡萄糖)的基礎(chǔ)上，測(cè)定葡萄糖的初始濃度對(duì)菌株0206的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著葡萄糖濃度的增加，活菌數(shù)呈增加趨勢(shì)，當(dāng)葡萄糖濃度在6～10g/L時(shí)，活菌數(shù)呈增加趨勢(shì)，當(dāng)葡萄糖濃度在10～14g/L時(shí)，活菌數(shù)呈減少趨勢(shì)，結(jié)合在熒光顯微鏡下觀察的熒光強(qiáng)度，確定最佳碳源濃度為10g/L。

圖2　不同碳源對(duì)菌株0206菌落數(shù)的影響Fig.2　Effects of different carbon sources on colony number of strain 0206

圖3　葡萄糖濃度對(duì)菌株0206菌落數(shù)的影響Fig.3　Effects of glucose concentration on colony number of strain 0206

圖4　不同氮源對(duì)菌株0206菌落數(shù)的影響Fig.4　Effects of different Nifrogen sources on colony number of strain 0206

2.2.1.2氮源對(duì)菌株0206產(chǎn)PHA的影響。由圖4可知，不同氮源對(duì)菌株0206的影響不同，其中，有機(jī)氮源酵母粉和無機(jī)氮源硫酸銨的平均活菌數(shù)較多，且差別不大，但在熒光顯微鏡下硫酸銨對(duì)菌株0206的熒光強(qiáng)度比酵母粉對(duì)菌株0206的熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，綜合考慮，選擇無機(jī)氮源硫酸銨為最佳氮源。在確定最佳氮源(硫酸銨)的基礎(chǔ)上，測(cè)定硫酸銨的初始濃度對(duì)菌株0206的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可知，隨著硫酸銨濃度的增加，活菌數(shù)呈增加趨勢(shì)，當(dāng)硫酸銨濃度在6～10g/L時(shí)，活菌數(shù)呈增加趨勢(shì)，當(dāng)硫酸銨濃度在10～14g/L時(shí)活菌數(shù)呈下降趨勢(shì)，結(jié)合在熒光顯微鏡下觀察的熒光強(qiáng)度，確定最佳氮源濃度為10g/L。

圖5　硫酸銨濃度對(duì)菌株0206菌落數(shù)的影響Fig.5　Effects of ammonium sulphate concentration on colony number of strain 0206

2.2.1.3培養(yǎng)基pH對(duì)菌株0206產(chǎn)PHA的影響。由圖6可知，不同培養(yǎng)基初始pH對(duì)菌株0206的影響不同，當(dāng)pH為6.0～7.0時(shí)，活菌數(shù)呈上升趨勢(shì)，當(dāng)pH為7.0～8.0時(shí)，活菌數(shù)呈下降趨勢(shì)，結(jié)合在熒光顯微鏡下觀察的熒光強(qiáng)度，確定最佳初始pH為7.0。

圖6　培養(yǎng)基初始pH對(duì)0206菌株菌落數(shù)的影響Fig.6　Effects of culture medium initial pH on colony number of strain 0206

2.2.1.4培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株0206產(chǎn)PHA的影響。由圖7可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，活菌數(shù)呈增加趨勢(shì)，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間在24～48h時(shí)，活菌數(shù)呈增加趨勢(shì)，熒光強(qiáng)度增加，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間在48～60h時(shí)，活菌數(shù)呈下降趨勢(shì)，熒光強(qiáng)度減弱，故PHA的積累與菌體生長(zhǎng)呈明顯的正相關(guān)，故確定最佳培養(yǎng)時(shí)間為48h。

圖7　培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株0206菌落數(shù)的影響Fig.7　Effects of incubation time on colony number of strain 0206

2.2.2正交試驗(yàn)。由表3可知，對(duì)菌株0206生長(zhǎng)的影響由大到小依次為A、D、B、C，即葡萄糖添加量影響最大，培養(yǎng)時(shí)間次之，培養(yǎng)基pH影響最小。方差分析表明，4個(gè)因素中，葡萄糖對(duì)菌株影響較顯著，培養(yǎng)基pH的影響較小。菌株0206發(fā)酵條件的最優(yōu)組合為A2B2C2D2。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)，在該條件下平均活菌數(shù)為2.59×109CFU/mL，較9組試驗(yàn)最高組所得的菌落數(shù)(2.45×109CFU/mL)高，故確定最優(yōu)發(fā)酵條件為葡萄糖10g/L，硫酸銨10g/L，氯化鈉2g/L培養(yǎng)基pH為7.0，培養(yǎng)時(shí)間為48h。

表3　正交試驗(yàn)結(jié)果

3結(jié)論與討論

該研究通過形態(tài)特征及生理生化鑒定可以得出，產(chǎn)PHA菌株0206為芽孢桿菌屬，對(duì)碳源、氮源、培養(yǎng)基初始pH和培養(yǎng)時(shí)間分別進(jìn)行單因素和正交試驗(yàn)分析，結(jié)果顯示菌株0206產(chǎn)PHA最佳發(fā)酵條件為葡萄糖10g/L，硫酸銨10g/L，氯化鈉2g/L,培養(yǎng)基pH7.0，培養(yǎng)時(shí)間48h。

該研究是基于實(shí)驗(yàn)室搖瓶培養(yǎng)的條件下完成的，鑒于大規(guī)模發(fā)酵的工藝條件與搖瓶有較大差別，經(jīng)搖瓶篩選出來的高產(chǎn)突變株未必在發(fā)酵罐內(nèi)也高產(chǎn)，因此，關(guān)于PHA高產(chǎn)菌株的生產(chǎn)試驗(yàn)還有待于進(jìn)一步研究。該試驗(yàn)雖只對(duì)一株菌進(jìn)行了研究，但仍可為其他產(chǎn)PHA菌株的培養(yǎng)提供參考。

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Optimization of Fermentation Conditions of PHA-producing Strain 0206

ZHU Jiu-bin, LI Shuang-qin, LIANG Bao-dong et al

(Life Science and Engineering Department of Jining University, Qufu, Shandong 273155)

Abstract[Objective] The aim was to study fermentation conditions of PHA-producing strain. [Method] With strain 0206 as test material, fermentation conditions about carbon, nitrogen, pH value and the culture time were analyzed by single factor experiment and orthogonal experiment. [Result] High PHA-producing strain 0206, which was isolated from activated sludge filter, was identified as Bacillus cohn through the physiological-biochemical identification. After optimization, fermentation conditions were: 10 g/L glucose, 10 g/L ammonium sulfate, 2 g/L NaCl, medium pH 7.0, incubation time for 48 hours. [Conclusion] The study provides reference for fermentation of PHA.

Key wordsPHA; Physiological-biochemical identification; Fermentation condition optimization

基金項(xiàng)目濟(jì)寧學(xué)院青年科研基金項(xiàng)目(2012QNKJ08)。

作者簡(jiǎn)介朱九濱(1980- ),男,山東濱州人,講師,碩士,從事微生物學(xué)教學(xué)和研究。

收稿日期2016-04-06

中圖分類號(hào)Q 93

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)12-123-03