崔一喆　王秋菊*　李　悅　蘇　景　周亞強(qiáng)　張宇辰

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶163319；2.黑龍江省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，哈爾濱150069)

籠養(yǎng)和散養(yǎng)蛋雞小腸細(xì)菌菌群區(qū)系的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳分析

崔一喆1王秋菊1*李悅1蘇景2周亞強(qiáng)1張宇辰1

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶163319；2.黑龍江省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，哈爾濱150069)

摘要：本試驗(yàn)對籠養(yǎng)和散養(yǎng)蛋雛雞和成年蛋雞的小腸中細(xì)菌種類進(jìn)行分析。取8周齡雛雞和30周齡產(chǎn)蛋雞整個(gè)小腸內(nèi)容物，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)分析，結(jié)合指紋克隆，研究雞小腸細(xì)菌菌群的DNA指紋圖譜。結(jié)果顯示，共從蛋雞的腸內(nèi)容物中分離出39株細(xì)菌，有4個(gè)菌門，包括變形菌(2株，5.1%)，擬桿菌(4株，10.2%)，放線菌(5株，12.8%)和厚壁菌門(21株，53.8%)，以及7個(gè)環(huán)境樣品(不可培養(yǎng)細(xì)菌)。不同階段蛋雞不同腸段存在不同的細(xì)菌種類，在成年母雞和自由放養(yǎng)雞腸道中的細(xì)菌種類比雛雞和籠養(yǎng)雞豐富。所有分離細(xì)菌中，共分離得到10株乳酸菌，除陪伴糞球菌外，其余9株乳桿菌作為微生態(tài)制劑后備菌保存。結(jié)果提示，飼養(yǎng)模式和飼養(yǎng)階段對蛋雞腸道中細(xì)菌群落種類分布有很大影響，散養(yǎng)模式細(xì)菌群落更豐富，成年雞較雛雞腸道細(xì)菌多。

關(guān)鍵詞：蛋雞；籠養(yǎng)；散養(yǎng)；PCR-DGGE；菌群鑒定

家禽腸道是一個(gè)復(fù)雜而多樣的生態(tài)環(huán)境，其體內(nèi)微生物超過400種，這些微生物對宿主的正常發(fā)育和營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收起著重要的作用。長期以來，由于微生物形態(tài)過于簡單，缺乏明顯的外部特征，人們對環(huán)境中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的了解不多。隨著基于16S rDNA分子技術(shù)的發(fā)展，更全面更深入地了解微生物菌落結(jié)構(gòu)成為可能，其中變性梯度凝膠電泳/溫度梯度凝膠電泳(DGGE/TGGE)技術(shù)被用于檢測人類[1]、豬[2]、雞[3]等動(dòng)物胃腸道主要細(xì)菌的結(jié)構(gòu)和多樣性[4]。腸道菌群失調(diào)會(huì)減弱機(jī)體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收率，降低機(jī)體免疫力，削弱腸道的屏障功能[5]，影響畜禽的生長和健康，所以對腸道微生物是否會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物腸道功能紊亂等相關(guān)研究十分迫切。目前，對宿主與腸道微生物之間相互作用的了解非常有限，直接限制了對動(dòng)物腸道微生物與腸道功能的研究。因此，本研究通過特定細(xì)菌物種通用引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)方法，對籠養(yǎng)和散養(yǎng)的雛雞及產(chǎn)蛋雞所有腸道內(nèi)容物菌群16S rDNA V3區(qū)進(jìn)行PCR-DGGE指紋圖譜比較分析，研究不同飼養(yǎng)方式下不同生長階段蛋雞十二指腸、空腸、回腸和盲腸中細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)和多樣性的發(fā)育性變化，旨在為了解家禽腸道菌群結(jié)構(gòu)和分離特異性有益菌提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物與樣品采集

試驗(yàn)動(dòng)物分別選自大慶興和牧業(yè)蛋雞養(yǎng)殖場的籠養(yǎng)蛋雞和大慶林甸散養(yǎng)蛋雞，品種均為海藍(lán)灰蛋雞系。隨機(jī)選取體重相近的8和30周齡的籠養(yǎng)與散養(yǎng)蛋雞各25只，剖殺，取全部小腸，同時(shí)分別取相同周齡飼養(yǎng)方式相同的每5只雞的十二指腸、空腸、回腸和盲腸的腸道內(nèi)容物并分別混勻，按每管1 g分裝至5 mL離心管中，-20 ℃保存。

1.2DNA提取

采用十二烷基硫酸鈉(SDS)高鹽抽提法提取樣品基因組DNA[6]。用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(上海海博生物有限公司)進(jìn)行過柱純化和溶解，最終總DNA溶于30 μL無菌水中，-20 ℃保存。

1.3細(xì)菌16S rDNA片段的PCR擴(kuò)增

以樣品基因組DNA為模板，采用細(xì)菌通用引物GC-338F和518R擴(kuò)增樣品16S rDNA高變區(qū)序列(表1)[7]。

PCR擴(kuò)增體系(50 μL)為：10× PCR buffer 5 μL；dNTP(2.5 mmol/L)3.2 μL；rTaq(5 U/μL)0.4 μL；GC-338F(20 mmol/L)1 μL；518R(20 mmol/L)1 μL；模板DNA 50 ng；補(bǔ)ddH2O至50 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；最終72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用OMEGA公司DNA Gel Extraction Kit純化回收。

PCR儀為Biometra公司生產(chǎn)的T-Gradient，凝膠成像儀為Bio-Rad公司的Gel-Doc2000凝膠成像系統(tǒng)。

表1　引物及序列

1.4PCR產(chǎn)物的DGGE分析

取10 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析。采用變形梯度為35%～55%、濃度為8%的聚丙烯酰胺凝膠，化學(xué)變性劑為100%尿素7 mol/L和40%(體積分?jǐn)?shù))的丙烯酰胺，在1×TAE緩沖液中150 V、60 ℃下電泳5 h。

1.5DGGE圖譜中優(yōu)勢條帶的回收與測序

用滅菌的手術(shù)刀切下待回收DGGE條帶，采用OMEGA公司Poly-Gel DNA Extraction Kit回收目的條帶。以2 μL回收產(chǎn)物為模板，338F/518R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將重新擴(kuò)增的DNA片段切膠回收、純化后，連接到PMD18-T載體上，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性克隆，菌液由北京華大基因研究中心對插入的細(xì)菌16S rDNA片段進(jìn)行序列測定。

1.6數(shù)據(jù)分析

用Quantity One軟件對雞各段腸道分離的細(xì)菌的PCR-DGGE指紋圖譜進(jìn)行條帶計(jì)數(shù)和模擬，在GenBank中使用Blast程序進(jìn)行同源性比較，獲得最相似典型菌株的16S rDNA序列。

2結(jié)果與分析

2.1PCR產(chǎn)物的DGGE分析結(jié)果

分別從8和30周齡籠養(yǎng)和散養(yǎng)蛋雞的十二指腸、空腸、回腸和盲腸內(nèi)容物中提取總DNA，經(jīng)電泳分析，各腸道內(nèi)容物總DNA分子質(zhì)量相近，均在2 000 bp以上，說明總DNA提取一致。以雞各腸道內(nèi)容物提取的細(xì)菌總DNA為模版，以GC-338F和518R為引物擴(kuò)增16S rDNA序列，得到約200 bp的DNA片段用于DGGE分析。

樣品16S rDNA PCR產(chǎn)物的DGGE分析結(jié)果如圖1。小腸內(nèi)容物的特定菌群分析表明，細(xì)菌通用引物擴(kuò)增的16個(gè)樣本中均得到16S rDNA V3區(qū)片段，利用上述已得到片段16S rDNA V3區(qū)進(jìn)行PCR-DGGE指紋圖譜和聚類分析。不同飼養(yǎng)模式不同年齡雞小腸腸道細(xì)菌種類豐富，且不相同。所有樣品總共分離出35條條帶，十二指腸、空腸、回腸和盲腸中細(xì)菌總條帶數(shù)，8周齡籠養(yǎng)雛雞分別為8、12、8和9條，散養(yǎng)雛雞分別有8、13、14和9條；籠養(yǎng)成年蛋雞分別有13、12、9和9條，散養(yǎng)成年蛋雞分別有16、15、13和10條。各雞各腸道中雖然有些共性條帶，但30周齡成年蛋雞腸道菌種數(shù)量多于8周齡雛雞，散養(yǎng)雞腸道細(xì)菌總數(shù)多于籠養(yǎng)雞，且均以十二指腸中細(xì)菌總數(shù)差別最大。

8和30代表周齡；字母F表示散養(yǎng)，C表示籠養(yǎng)；1～4、5～8、9～12、13～16分別為各雞十二指腸、空腸、回腸和盲腸細(xì)菌。

8 and 30 mean week of age; F means free range and C means cage range; 1 to 4, 5 to 8, 9 to 12, and 13 to 16 mean bacteria from duodenum, jejunum, ileum and cecum of chicken, respectively.

圖1DGGE條帶分析結(jié)果

Fig.1Analysis results of DGGE bands

2.2各樣品之間的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性

從各雞小腸中共分離出39株菌，根據(jù)各腸道中總細(xì)菌種屬數(shù)量中的相同細(xì)菌種屬的比例，進(jìn)行菌種遺傳相似系數(shù)計(jì)算，非加權(quán)分組平均法(UPGMA)聚類圖如圖2所示。

不同飼養(yǎng)模式雛雞和成年蛋雞不同腸道中細(xì)菌群落的組成有很大差異。相同周齡相同腸道組織中菌種遺傳相似系數(shù)很低，30周齡散養(yǎng)和籠養(yǎng)蛋雞小腸中細(xì)菌菌種相似系數(shù)為18.9%～33.5%；8周齡散養(yǎng)和籠養(yǎng)蛋雞小腸中細(xì)菌菌種相似系數(shù)為17.0%～33.3%。相同飼養(yǎng)模式下，不同周齡蛋雞相同腸道組織中菌種相似系數(shù)較高。散養(yǎng)條件下，8和30周齡蛋雞各腸道細(xì)菌菌種相似系數(shù)為19.4%～35.2%；籠養(yǎng)條件下，8和30周齡蛋雞各腸道細(xì)菌菌種相似系數(shù)為33.1%～49.1%，明顯高于散養(yǎng)條件下不同周齡蛋雞腸道菌群分布的相似性，說明籠養(yǎng)環(huán)境相對穩(wěn)定，散養(yǎng)環(huán)境復(fù)雜，散養(yǎng)環(huán)境下雞只采食的細(xì)菌類別可變性較大。菌群相似性指數(shù)是測量群落間或樣方間相似程度指數(shù)指標(biāo)，相似性指數(shù)的高低說明細(xì)菌群落相似程度，也可間接地說明共性菌群以外的菌群情況。由上述結(jié)果中可知，不同飼養(yǎng)環(huán)境不同周齡雞腸道菌群組成差別較大，飼養(yǎng)模式、周齡及腸道部位均影響雞腸道中細(xì)菌的多樣性。

2.3主要電泳條帶的序列測定

DGGE凝膠條帶回收后，以338F/518R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得約200 bp的DNA片段。PCR產(chǎn)物純化后連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性克隆測序。指紋圖譜中分別割膠回收測序結(jié)果見表2，測序結(jié)果與GenBank中的序列進(jìn)行比對，得到條帶所代表的細(xì)菌類型，繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3所示。在39個(gè)測序結(jié)果中，與GenBank數(shù)據(jù)庫中微生物的同源性絕大多數(shù)大于92%，有的同源性甚至達(dá)到100%。

經(jīng)鑒定，蛋雞小腸中細(xì)菌種類分為4個(gè)菌門，為變形菌(Proteobacteria)、擬桿菌(Bacteroidetes)、放線菌(Actinobacteria)、厚壁菌(Firmicutes)以及環(huán)境樣品(environmental samples)。其中2株變形菌(占總菌比例5.1%)為魯氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterlwoffii)(條帶8)和哥假黃單胞菌(Pseudoxanthomonasmexicana)(條帶21)，均僅在散養(yǎng)雞腸道中檢測到，分別為8周齡雛雞的空腸和30周齡成年蛋雞的回腸中。4株擬桿菌(占總菌比例10.2%)，為藍(lán)斑擬桿菌(Bacteroidesplebeius)(條帶2)、丁酸弧菌(Butyricimonasvirosa)(條帶13_2)、克拉副普氏菌(Paraprevotellaclara)(條帶14)和Alistipesputredinis(條帶33)，其中條帶2為相似度89%的藍(lán)斑擬桿菌亞種，與條帶3同源的丁酸弧菌存在各雞的小腸中；條帶14為相似度72%的克拉副普氏菌變種，在散養(yǎng)雞腸道中和8周齡的籠養(yǎng)雞空腸中檢測到；而條帶33同源菌Alistipesputredinis僅在成年蛋雞小腸中發(fā)現(xiàn)。

圖2　UPGMA聚類圖

5株放線菌(占總菌比例12.8%)包括2株陰道加德菌(Gardnerellavaginalis)(條帶28和29)，3株螺旋鏈霉菌(Streptomycesspiralis)(條帶30、31和32)，其中條帶28和29是相似度92%的變種，同源于陰道加德菌；條帶30、31和32為相似度100%的同源螺旋鏈霉菌；條帶28同源的陰道加德菌和條帶30、31和32同源的螺旋鏈霉菌存在各雞小腸中；而陰道加德菌(條帶29)僅在30周齡散養(yǎng)成年蛋雞腸道中發(fā)現(xiàn)。

本試驗(yàn)分析的39株細(xì)菌中，有21株為厚壁菌(占總菌比例53.8%)，是蛋雞小腸中的優(yōu)勢菌群。其中乳酸菌屬(Lactobacillus)共有10株(占總菌比例25.6%)，是厚壁菌中的優(yōu)勢菌屬(占47.6%)，包括3株鳥乳酸菌(Lactobacillusaviaries)、3株棉子糖乳酸菌(Lactococcusraffinolactis)、1株敏捷乳桿菌(Lactobacillusagilis)、1株陪伴糞球菌(Coprococcuscomes)、1株同代乳桿菌(Lactobacillusequigenerosi)和1株嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)。30周齡散養(yǎng)和籠養(yǎng)成年蛋雞小腸中各檢測到7株乳酸菌，而8周齡的雛雞小腸中分別檢測到5株(散養(yǎng))和6株(籠養(yǎng))。各雞小腸均有的共同乳酸菌為3種，分別是鳥乳酸菌(條帶4、5和23)、棉子糖乳酸菌(條帶6和25)和同代乳桿菌(條帶15_1)；其中條帶4和條帶23相似性僅為31%，與鳥乳酸菌相似性僅為27%，而他們與條帶5的相似性達(dá)98%，說明條帶4和23為鳥乳酸菌的新種；條帶15與同代乳桿菌的相似性僅為36%，在各雞小腸中均檢測到，為雞腸道中共同菌種；棉子糖乳酸菌(條帶6_1和6_2)在各雞小腸中存在，但在十二指腸中未檢測到，是雞后段小腸中存在的共同菌種。敏捷乳桿菌(條帶11)、陪伴糞球菌(條帶12)和嗜酸乳桿菌(條帶34)為不同日齡雞特有的乳酸菌種。其中條帶11與敏捷乳桿菌相似度為87%，是敏捷乳桿菌的亞種，僅分離自8周齡籠養(yǎng)和散養(yǎng)的小雞腸道中，30周齡成年雞腸道中未發(fā)現(xiàn)；條帶12與陪伴糞球菌的相似度為70%，是陪伴糞球菌的變種，僅分離自30周齡籠養(yǎng)和散養(yǎng)的成年蛋雞小腸中，8周齡雛雞腸道中未發(fā)現(xiàn)；條帶34與嗜酸乳桿菌相似性為84%，是嗜酸乳桿菌的亞種，僅在散養(yǎng)30周齡雞的十二指腸中檢測到，在其他雞腸道中均未檢測到，是散養(yǎng)成年雞小腸中特有菌種。

厚壁菌中有6株梭菌屬(Clostridium)(占總菌的15.4%)，分別為普氏梭桿菌(Fusobacteriumplautii)(條帶1)、第三梭狀芽孢桿菌(Clostridiumtertium)(條帶7)、緩腐梭菌(Clostridiumlentocellum)(條帶17)、艱難梭菌(Clostridiumdifficile)(條帶24)、煎盤梭菌(Clostridiumsartagoforme)(條帶26)和不規(guī)則梭菌(Clostridiumirregulare)(條帶27)。其中普氏梭桿菌、第三梭狀芽孢桿菌和煎盤梭菌在各雞小腸中檢測到，是雞的共同梭菌；而條帶1與普氏梭桿菌相似性為92%，是普氏梭桿菌的亞種，條帶17與緩腐梭菌相似性為90%，是緩腐梭菌的亞種，條帶26與煎盤梭菌相似性為90%，為煎盤梭菌的亞種。條帶7與第三梭狀芽孢桿菌相似度僅為32%，僅在成年蛋雞腸道中檢測到，雛雞小腸中不存在或未檢出；條帶27與不規(guī)則梭菌相似性為89%，是不規(guī)則梭菌變種，僅在散養(yǎng)雛雞小腸中發(fā)現(xiàn)，而在其他雞小腸中未檢出；條帶24與艱難梭菌相似性為85%，是艱難梭菌變種，是雛雞小腸共同菌株，而在成年散養(yǎng)蛋雞小腸中未發(fā)現(xiàn)。厚壁菌中還有4株菌，分別為魯梅利桿菌(Rummeliibacillusstabekisii)、普氏糞桿菌(Faecalibacteriumprausnitzii)以及加洛鏈球菌(Streptococcusgallolyticus)。這4株菌在散養(yǎng)成年蛋雞小腸中均檢測到，且與普氏糞桿菌同源的條帶9是散養(yǎng)成年蛋雞小腸中特有菌屬，而與魯梅利桿菌同源的條帶3和與加洛鏈球菌同源的條帶10在散養(yǎng)雛雞小腸中也檢測到。

另在雞腸道中檢測到7株環(huán)境樣品(占總菌比例17.9%)是不可培養(yǎng)菌(uncultured bacterium)(條帶13_1、16、18、19、20、22和35)，且這7株菌相似性均高于97%，在各雞小腸中均有發(fā)現(xiàn)，普遍存在雞腸道中。

以上結(jié)果說明，飼養(yǎng)模式和腸道部位影響雞腸道細(xì)菌的結(jié)構(gòu)。

表2　細(xì)菌種屬分析結(jié)果

續(xù)表2條帶編號(hào)BandNo.最相似菌株名稱Themostsimilarstrains’name登錄號(hào)AccessionNo.相似度Similarity/%菌門Bacterialphylum23鳥乳酸菌LactobacillusaviariesNR_044703.198厚壁菌Firmicutes24艱難梭菌ClostridiumdifficileNR_074454.1100厚壁菌Firmicutes25棉子糖乳球菌LactococcusraffinolactisNR_044359.1100厚壁菌Firmicutes26煎盤梭菌ClostridiumsartagoformeNR_026490.199厚壁菌Firmicutes27不規(guī)則梭菌ClostridiumirregulareNR_029249.1100厚壁菌Firmicutes28陰道加德菌GardnerellavaginalisNR_044694.196放線菌Actinobacteria29陰道加德菌GardnerellavaginalisNR_044694.196放線菌Actinobacteria30螺旋鏈霉菌StreptomycesspiralisNR_044142.1100放線菌Actinobacteria31螺旋鏈霉菌StreptomycesspiralisNR_044142.1100放線菌Actinobacteria32螺旋鏈霉菌StreptomycesspiralisNR_044142.299放線菌Actinobacteria33AlistipesputredinisNR_025909.199擬桿菌Bacteroidetes34嗜酸乳桿菌LactobacillusacidophilusNR_075049.199厚壁菌Firmicutes35不可培養(yǎng)菌UnculturedbacteriumJX183818.1100環(huán)境樣本Environmentalsamples

3討論

腸道微生物可通過養(yǎng)分的利用和胃腸道系統(tǒng)的發(fā)育來影響宿主的營養(yǎng)、健康和生長性能。腸道微生物菌群的組成，會(huì)對宿主的健康和生長產(chǎn)生影響。對人類[8]、豬[9]、雞等的研究結(jié)果均證實(shí)不同個(gè)體腸道菌群指紋圖譜有差異，即使是飼養(yǎng)于相同環(huán)境、飼喂相同飼料、相互接觸的同齡雞，都會(huì)表現(xiàn)出不同的帶譜，說明宿主因素對腸道菌群的組成影響很大。由于動(dòng)物種類[10]、飼養(yǎng)環(huán)境、溫度[11]等均影響腸道菌群結(jié)構(gòu)，且基于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法很難全面地反映或比較腸道菌群的結(jié)構(gòu)特征，本研究采用先進(jìn)且有效的DGGE技術(shù)對籠養(yǎng)和散養(yǎng)模式下8和30周齡海藍(lán)褐蛋雞十二指腸、空腸、回腸和盲腸內(nèi)容物中細(xì)菌組成進(jìn)行研究，分析不同飼養(yǎng)方式下蛋雞腸道中微生物類群發(fā)育性變化。從所有雞整個(gè)小腸中發(fā)現(xiàn)35個(gè)菌屬的細(xì)菌，散養(yǎng)雞較籠養(yǎng)雞小腸中細(xì)菌種屬相對較多，散養(yǎng)雛雞整個(gè)小腸中細(xì)菌總數(shù)較籠養(yǎng)雛雞的多7株，而散養(yǎng)成年蛋雞比籠養(yǎng)成年蛋雞小腸細(xì)菌總數(shù)多11株；相同飼養(yǎng)模式，成年雞腸道菌群較雛雞階段豐富，主要表現(xiàn)在十二指腸中細(xì)菌數(shù)量相差較多，空腸之后的腸道中細(xì)菌總數(shù)相差不多。如散養(yǎng)條件下，雛雞十二指腸細(xì)菌有8株，成年蛋雞有16株；籠養(yǎng)條件下，雛雞十二指腸有8株細(xì)菌，成年蛋雞有13株，證實(shí)禽的生活環(huán)境對腸道中菌的生存有很大影響。

為了開發(fā)動(dòng)物用益生菌制劑菌，在各個(gè)腸道均存活的乳酸菌株將作為后備菌進(jìn)行研究。本研究從雞各腸道分離出乳酸菌株共10株。目前，關(guān)于同代乳桿菌的研究報(bào)道僅有3篇[12-14]，且均是從馬的腸道中分離出來或是做成微生態(tài)制劑飼喂馬。對該菌進(jìn)行生物學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)，同代乳桿菌具有高耐酸耐膽鹽能力，可以在pH為3.0的環(huán)境存活，對腸上皮細(xì)胞黏附力高達(dá)60%以上，沒有致病性，且能夠降低馬血液膽固醇含量和尿素含量，可作為益生菌進(jìn)行開發(fā)。本研究首次從籠養(yǎng)蛋雛雞腸道中分離出同代乳桿菌，根據(jù)以上研究結(jié)果顯示，同代乳桿菌可以作為蛋雞用微生態(tài)制劑的后備菌在未來試驗(yàn)中進(jìn)一步研究。鳥乳酸菌僅在Waters等[15]的一篇綜述中提到過，作為微生態(tài)制劑菌，沒有發(fā)現(xiàn)其他的相關(guān)研究報(bào)道。關(guān)于敏捷乳桿菌的研究有3個(gè)，最早的研究是Palop等[16]研究發(fā)現(xiàn)一株敏捷乳桿菌R16能夠在含有芥末籽提取物的環(huán)境中生長，并可以降解硫甙，說明該菌具有一定的生命抗性和生物活性；Baele等[17]證實(shí)敏捷乳桿菌為鴿子腸道中乳酸菌屬的重要組成部分；最近的研究，即Stephenson等[18]研究發(fā)現(xiàn)，敏捷乳桿菌為肉雞腸道常駐乳酸菌屬菌株，具有高黏附和定植力，并具有高效表達(dá)抗菌蛋白的功能。本研究發(fā)現(xiàn)了敏捷乳桿菌，通過以上研究的對比，說明該菌在禽類腸道具有很好的定植的能力和適應(yīng)性，因此敏捷乳桿菌可作為微生態(tài)制劑菌進(jìn)行進(jìn)一步研究。

圖3　雞腸道菌群系統(tǒng)發(fā)育樹

關(guān)于棉子糖乳球菌的研究都是近2年的，且均為發(fā)酵牛奶中關(guān)于該菌的研究[19-20]，至今沒有從禽腸道中分離鑒定該菌的研究，但Meslier等[19]的研究中提到棉子糖乳球菌為環(huán)境中的常見乳酸菌，而本研究在雞腸道中分離出該菌，根據(jù)前人研究它的促發(fā)酵作用，該菌具有微生態(tài)制劑后備菌的特性，具體應(yīng)用效果有待于進(jìn)一步研究。關(guān)于陪伴糞球菌的研究，多數(shù)為20世紀(jì)90年代前的[21]，最近的僅有1篇，為Graessler等[22]的研究，均是說明陪伴糞球菌在腸道中數(shù)量的增多與克羅恩氏病(節(jié)段性腸炎)有關(guān)，因此該菌不可作為微生態(tài)制劑菌。

此外，雞各腸道還有3株非乳酸菌屬共同菌，為1株魯梅利桿菌和2株陰道加德菌。而其中陰道加德菌，有多個(gè)研究表明該菌為致病菌[23-24]，會(huì)產(chǎn)生生殖道炎癥，因此不可作為益生菌制劑后備菌研究。目前，直接研究魯梅利桿菌菌屬的報(bào)道僅有2篇[25-26]，均是從土壤中分離并鑒定的，但是Vaishampayan等[25]分離出的魯梅利桿菌，經(jīng)測定嚴(yán)格需氧，耐高鹽，28～32 ℃生長良好；而Her等[26]分離出的魯梅利桿菌菌株不耐鹽(NaCl<1.5%)，也不耐酸(pH 5～10)，不具有微生態(tài)制劑制備菌的優(yōu)良特性。因此，本研究分離出的芽孢桿菌屬魯梅利桿菌是否可作為微生態(tài)制劑制備菌，有待于進(jìn)一步的研究確定。

4結(jié)論

① 飼養(yǎng)模式和飼養(yǎng)階段對雞腸道中細(xì)菌種類分布有很大影響，散養(yǎng)模式細(xì)菌種類更豐富，成年雞較雛雞腸道細(xì)菌多；腸道不同腸段決定細(xì)菌種類的多樣性和特異性，尤其是小腸入口的十二指腸是各雞細(xì)菌種類差異最明顯的腸段。

② 本研究分離鑒定出9株乳酸菌和1株芽孢桿菌，其中除同代乳桿菌已在馬屬動(dòng)物上作為微生態(tài)制劑制備菌應(yīng)用過外，鳥乳酸菌、敏捷乳桿菌、棉子糖乳球菌及魯梅利桿菌是否可作為微生態(tài)制劑制備菌，均有待于進(jìn)一步的研究確定，可作為后備菌保存。

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(責(zé)任編輯田艷明)

Intestinal Bacterial Flora of Chicken Fed in Cage and Free Range by Polymerase Chain Reaction and Denaturing Gradient Gel Electrophoresis Analysis

CUI Yizhe1WANG Qiuju1*LI Yue1SU Jing2ZHOU Yaqiang1ZHANG Yuchen1

(1. College of Animal Science and Veterinary, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China;2. Heilongjiang Province Animal Epidemic Prevention and Control Center, Harbin 150069, China)

Abstract:This study investigated the structural diversity of intestinal bacterial flora in young and adult chicken fed in cage and free range separately. Intestinal samples were collected from 8 and 30 weeks old chickens. Polymerase chain reaction and denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE ) was used, in combination with cloning and sequencing of amplified fragments to produce bacterial flora DNA fingerprints. Total of 39 strains were isolated from the intestinal contents of chicken, including 4 sulfer bacteria as 2 Proteobacteria strains (5.1%), 4 Bacteroidetes strains (10.2%), 5 Actinobacteria strains (12.8%) and 21 Firmicutes strains (53.8%), as well as 7 environmental samples (uncultured bacterium). And bacteria species were various in different intestine parts of different chicken, bacteria in adult hens and chicken fed in free range was richer than bacteria in young chicken and chicken fed in cage. Ten Lactobacillus stains were isolated. Coprococcus was excluded but the rest of nine Lactobacillus species were saved to study for probiotics. Results indicate that feeding mode and chicken age have a great influence on the intestinal bacterial community composition, and more bacterial species exist in adult hens’ intestinal tract and fed in free range.[Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016, 28(6)：1677-1686]

Key words:chicken; cage range; free range; PCR-DGGE; flora identification

doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2016.06.007

收稿日期：2015-12-17

基金項(xiàng)目：黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(C201444，C2015040)；黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)校培育課題(XZR2014-05)

作者簡介：崔一喆(1979—)，男，黑龍江雞西人，講師，博士，主要從事動(dòng)物腸道疾病及營養(yǎng)調(diào)控研究。E-mail: cuiyizhe1979@126.com *通信作者：王秋菊，副教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail: wqj_9@163.com

中圖分類號(hào)：S811.6

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-267X(2016)06-1677-10

*Corresponding author, associate professor, E-mail: wqj_9@163.com