楊曉懷++李永紅++張森泉++汪洪忠++陳紅娜++周志豪

摘 要：通過抽樣檢測判斷農(nóng)作物、農(nóng)產(chǎn)品是否含有轉(zhuǎn)基因成分，實(shí)現(xiàn)從本土種植地的田間作物及農(nóng)產(chǎn)品終端開展檢測進(jìn)行追溯，從而掌握農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全狀況。該文系統(tǒng)地闡述了農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測的必要性、監(jiān)測范圍和方法、樣品制備、檢測方法分析、田間作物抽樣檢測、風(fēng)險(xiǎn)檢測處置等。通過科學(xué)應(yīng)用田間作物及農(nóng)產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分抽制樣方法，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測的規(guī)范有效。

關(guān)鍵詞：生物育種；風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測；抽制樣；誤差控制

中圖分類號 S188 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）11-0028-06

Application of Specimen Preparation Method for Detection of Transgenic Component in Agriculture Bio-security Surveiuance

Yang Xiaohuai et al.

（Shenzhen Agricultural Science and Technology Promotion Center，Shenzhen 518000，China）

Abstract：In genetically modified organisms risk monitoring， through sampling， whether crops， agricultural products contain genetically modified ingredients from local gardens field crops and agricultural terminals to carry out the trace detection， so as to grasp the agricultural genetically modified organisms safety conditions. Risk of genetically modified （gm） detection in addition to the following general sampling theory， should consider about the sampling of the test method of detection limit and the legal tolerance of the samples of genetically modified ingredients. Through scientific application of field crops and agricultural transgenic component specimen preparation method， realizes the agricultural genetically modified organisms safety risk monitoring specification is effective.

Key words：Biological breeding； Risk monitoring；Specimen preparation； Error control

1 農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測必要性

世界人口持續(xù)增長、資源短缺、生態(tài)環(huán)境惡化等因素嚴(yán)重威脅著糧食生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展。轉(zhuǎn)基因生物育種技術(shù)打破了不同物種間的界限，能夠有目的地、快速地將不同物種間的優(yōu)良性狀集中到一個(gè)品種上，拓寬作物遺傳改良可資利用的基因來源，縮短育種周期[1]。因此，將傳統(tǒng)作物育種技術(shù)（改良種質(zhì)）、新型轉(zhuǎn)基因技術(shù)（獲得新型性狀）、分子標(biāo)記輔助選擇育種（加速育種進(jìn)程）相結(jié)合，將是增加世界糧食產(chǎn)量最有希望的技術(shù)戰(zhàn)略。我國在農(nóng)作物常規(guī)育種方面有較好基礎(chǔ)，但單純依靠常規(guī)技術(shù)已無法突破當(dāng)前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的技術(shù)瓶頸，唯有實(shí)現(xiàn)常規(guī)育種與生物技術(shù)的結(jié)合才能實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)升級和跨越式發(fā)展，滿足當(dāng)前高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆、抗病蟲新品種培育的需要。生物技術(shù)的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用還能促進(jìn)傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)向醫(yī)藥、化工、能源、環(huán)保等領(lǐng)域的拓展，在緩解資源約束、實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)增長方式的轉(zhuǎn)變中發(fā)揮更大的作用。因此，推進(jìn)現(xiàn)代種業(yè)生物技術(shù)的研究、應(yīng)用與產(chǎn)業(yè)化，是著眼于我國現(xiàn)實(shí)和未來農(nóng)業(yè)發(fā)展的重大戰(zhàn)略，是確保國家糧食安全的必然選擇。

目前，我國在發(fā)展轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)上采取的是“研究上大膽，推廣上慎重”的基本策略，根據(jù)我國轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例等法律法規(guī)，未經(jīng)批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品禁止進(jìn)口或流入市場，以防污染種子、生物鏈和食物鏈；我國要求對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實(shí)施從田間到餐桌全程管理，已批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品需要按規(guī)定標(biāo)識。概括地說，轉(zhuǎn)基因作物監(jiān)管主要包括播種前的種子監(jiān)管，播種后的田間監(jiān)管，以及口岸、加工企業(yè)和貿(mào)易市場的監(jiān)管。

開展轉(zhuǎn)基因生物風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測，通過抽樣檢測判斷農(nóng)作物、農(nóng)產(chǎn)品是否含有轉(zhuǎn)基因成分：一方面，是從本土種植地的田間作物開展監(jiān)測，另一方面，因市場交易的復(fù)雜性，從農(nóng)產(chǎn)品終端開展檢測進(jìn)行追溯，可掌握轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品食用安全狀況。目前深圳市監(jiān)測手段通常采取實(shí)驗(yàn)室PCR定性方法檢測、田間作物試紙條快速檢測方法等為主。自2002年起，我市開展轉(zhuǎn)基因生物安全風(fēng)險(xiǎn)評估，系統(tǒng)和持續(xù)地對田間作物及農(nóng)產(chǎn)品開展例行監(jiān)測、普查、潛在風(fēng)險(xiǎn)分析、建立風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測數(shù)據(jù)庫等，并將田間作物及農(nóng)產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分抽制樣方法應(yīng)用在全市農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測方面。

2 深圳市現(xiàn)代生物育種技術(shù)應(yīng)用狀況

深圳是國外轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品入境的重要口岸，又是國內(nèi)相關(guān)產(chǎn)品出口的重要通道，所涉作物品種多、數(shù)量大。據(jù)海關(guān)初步統(tǒng)計(jì)，近年來每年從美國、巴西、阿根廷等國進(jìn)口大豆、玉米、油菜籽等約300萬t，其中85%是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，從事糧油加工的大型企業(yè)每年使用來自巴西、阿根廷、美國等的轉(zhuǎn)基因大豆約180萬t，所生產(chǎn)的品牌食用油產(chǎn)品不僅占據(jù)了深圳的糧油市場，在全國也占有一定的市場份額，而且有部分出口到港澳等地。深圳又是我國重要的生物高科技戰(zhàn)略基地，一些國內(nèi)知名的育種研發(fā)基地也相繼落戶深圳。截至2015年末，深圳市轄區(qū)內(nèi)從事進(jìn)口轉(zhuǎn)基因大豆、油菜籽等粗、深加工的大型企業(yè)十多家，此外，深圳還有為數(shù)較多從事相關(guān)技術(shù)研發(fā)、產(chǎn)品生產(chǎn)及經(jīng)營的企業(yè)、科研院所。隨著農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)發(fā)展及其產(chǎn)品商業(yè)化進(jìn)程加快，被批準(zhǔn)實(shí)施的試驗(yàn)項(xiàng)目和進(jìn)入商業(yè)化應(yīng)用的生物品種將逐步增加，提高了我市對轉(zhuǎn)基因生物環(huán)境釋放、生產(chǎn)性試驗(yàn)的風(fēng)險(xiǎn)評估要求，也催生了我市開展農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測的需求。

3 風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測范圍及方法

3.1 監(jiān)測品種及范圍 根據(jù)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管需要，深圳在全市范圍開展專項(xiàng)風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測。監(jiān)測范圍覆蓋農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物研發(fā)單位，種子生產(chǎn)經(jīng)營單位，進(jìn)口轉(zhuǎn)基因生物加工企業(yè)，糧油專業(yè)市場和集散地、農(nóng)產(chǎn)品批發(fā)市場、超市等。根據(jù)當(dāng)前轉(zhuǎn)基因作物生產(chǎn)應(yīng)用現(xiàn)狀及目前檢測機(jī)構(gòu)承檢范圍，我市具備轉(zhuǎn)基因成分檢測資質(zhì)的檢測機(jī)構(gòu)包括：農(nóng)業(yè)部農(nóng)作物種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（深圳）、深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測研究院、深圳市通量檢測科技有限公司、深圳市華測檢測技術(shù)股份有限公司等。

目前，列入我國第一批實(shí)施標(biāo)識管理的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物目錄主要有5大類作物17種產(chǎn)品，而結(jié)合當(dāng)前世界轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)應(yīng)用發(fā)展實(shí)際及我市區(qū)域作物種植特點(diǎn)、市場交易產(chǎn)品范圍等因素，本區(qū)域監(jiān)測的農(nóng)作物品種更為廣泛，主要包括：水稻、玉米、油菜、大豆、辣椒、番茄、番木瓜、馬鈴薯等8大類作物品種，具體監(jiān)測對象包括：水稻種子、大米及米制品；玉米種子、玉米及其制品；大豆及其制品；番木瓜；辣椒；番茄；油菜；以玉米或水稻為主要原料的飼料等（表1）。

3.2 檢測方法分類 當(dāng)前，轉(zhuǎn)基因檢測方法根據(jù)檢測對象劃分大致可分為4類：生物體水平、DNA水平、mRNA水平和蛋白質(zhì)水平。

3.2.1 生物體水平 即蟲測法，以轉(zhuǎn)基因作物的器官飼喂害蟲，觀察害蟲的死亡率[2]、發(fā)育狀況等。此法條件高，檢測能力有限，占用空間大，所需時(shí)間長，但最為直觀。

3.2.2 mRNA水平 在轉(zhuǎn)錄水平檢測外源基因的表達(dá)情況，主要采用Northern雜交。即用已知序列的DNA或RNA標(biāo)記探針與mRNA序列互補(bǔ)成雜交雙鏈，通過探針標(biāo)印記即可檢出雜交體。

3.2.3 蛋白質(zhì)水平 在翻譯水平檢測外源基因的表達(dá)情況，主要方法有酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）、雙向電泳、Western雜交、層析及免疫印跡等。近年來農(nóng)業(yè)部推行快速試紙條檢測方法，即是應(yīng)用免疫層析原理，在樣品溶解獲取蛋白后，樣品溶液中的特定蛋白與標(biāo)記的抗體發(fā)生抗原-抗體的特異性的結(jié)合作用，流經(jīng)檢測帶時(shí)抗原-抗體復(fù)合物被固定在檢測帶上的捕獲抗體結(jié)合，聚集形成肉眼可見的條帶，顯示陽/陰檢測結(jié)果。目前，試紙條可適用于大豆、玉米、棉花、油菜、苜蓿等農(nóng)作物中轉(zhuǎn)基因成分的快速定性檢測。采用免疫層析法快速檢測樣品中轉(zhuǎn)基因蛋白，整個(gè)過程只需5～10min。檢測靈敏度可達(dá)0.1%，而且具有成本低、檢測方法快速簡單的優(yōu)點(diǎn)。因不同作物類型樣品成分組成差異巨大，葉片中的葉綠素、稻谷中的多酚、玉米糊中的淀粉等都會對檢測結(jié)果造成影響，且不同試紙的靈敏度和特異性有所不同，容易導(dǎo)致假陽性、假陰性和流動(dòng)不暢等各種問題，還受檢測靶標(biāo)種類少等局限，目前較適用于部分田間作物的葉片檢測，且經(jīng)篩選出來的陽性葉片樣品需進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室PCR定性檢測確認(rèn)。

3.2.4 DNA水平 檢測轉(zhuǎn)基因作物基因組中是否含有外源基因。常用方法有定性定量PCR、DNA測序、Southern雜交以及基因芯片技術(shù)等。目前，實(shí)驗(yàn)室檢測較為常用的為實(shí)時(shí)熒光定量PCR （Quantitative Real-time PCR），全稱“聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)”，是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法[3]，通過內(nèi)參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。定性PCR轉(zhuǎn)基因食品重組DNA的基本結(jié)構(gòu)包括啟動(dòng)子、目的基因、終止子和標(biāo)記基因。由于目的基因種類繁多，所以先用轉(zhuǎn)基因食品最常用的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子CaMV35S、轉(zhuǎn)錄終止子NOS及抗生素抗體基因NPTII3個(gè)序列來設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，對結(jié)果陽性者可再檢測目的基因。在轉(zhuǎn)基因成分檢測中，PCR技術(shù)存在檢測成本較高、耗時(shí)較長的問題，但由于具有檢測范圍廣、靈敏度高、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，僅需微量的DNA就可以同時(shí)檢測多個(gè)樣品，在轉(zhuǎn)基因成分檢測中應(yīng)用較廣。

4 風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測的樣品制備

4.1 確定樣品制備原則 在滿足檢驗(yàn)最低抽檢量要求、待測樣品能代表總體抽樣對象特征為基本前提下，滿足以下原則：

4.1.1 動(dòng)態(tài)化 根據(jù)轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)，分析隱患分布及變化情況，及時(shí)調(diào)整監(jiān)測品種、監(jiān)測區(qū)域、監(jiān)測參數(shù)和監(jiān)測頻率。

4.1.2 防污染 轉(zhuǎn)基因成分檢測以遺傳物質(zhì)DNA為模板，需重點(diǎn)避免樣品受到外部污染、交叉污染和損失。制備技術(shù)和裝置在樣品制備過程中不破壞樣品代表性，不改變樣品組成。

4.1.3 同概率 原始樣品的各部分以相同的概率進(jìn)入最終樣品，保證樣品具有代表性。

4.1.4 合理性 應(yīng)根據(jù)待測特性、原始樣品的量及粒度以及待采樣抽樣對象的性質(zhì)，如：植株、鮮農(nóng)產(chǎn)品、加工品、液體等不同情況，確定樣品制備的步驟及應(yīng)采用的技術(shù)。

4.1.5 規(guī)范性 針對不同作物（如玉米、油菜）、樣品形態(tài)（種子、粉末和油）、檢測方法確定抽樣方法及樣品大小，引用通性規(guī)則（靜批抽樣與動(dòng)批抽樣，均勻批與不勻批抽樣）。

4.2 樣品制備流程 轉(zhuǎn)基因檢測樣品抽樣包括以下環(huán)節(jié)：采樣前分析、實(shí)驗(yàn)室樣品制備、樣品信息采集、樣品保存及檢測等，因此，抽樣標(biāo)準(zhǔn)必須規(guī)范以上各個(gè)環(huán)節(jié)。

4.2.1 采樣前數(shù)據(jù)分析 采樣前，根據(jù)轉(zhuǎn)基因生物安全風(fēng)險(xiǎn)輿情分析數(shù)據(jù)，確定抽樣目標(biāo)，調(diào)查抽樣對象的來源、種類、批次、生產(chǎn)日期、總量、包裝堆積形式、運(yùn)輸情況、貯存條件、貯存時(shí)間、所監(jiān)測品種可能存在的成分逸散和污染情況，以及其他影響抽樣對象發(fā)生變化的材料。

4.2.2 取樣分類 按照不同樣品類型，采取不同的樣品制備方法（采樣、保存），根據(jù)轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)測目標(biāo)，通行的檢測樣品一般分為三類：（1）原始材料：種子、植株、水果等；（2）初級加工品：大豆豆粕、米粉或豆粉、動(dòng)物飼料等；（3）深度加工品：植物油、番茄醬等。但是，深加工產(chǎn)品外源基因片段降解、食用添加劑、其他原材料混雜等因素干擾，提高了檢測難度，也相對影響了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4.2.3 實(shí)驗(yàn)室樣品制備 采樣時(shí)，選擇不與樣品發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的材料制成的采樣器，如果采樣時(shí)間較長，中間樣品用密封容器保存，盛樣容器要依據(jù)被檢抽樣對象的性質(zhì)而定。

4.2.4 樣品信息采集 采樣后，要及時(shí)記錄樣品名稱、規(guī)格型號、批號、等級、產(chǎn)地、采樣基數(shù)、采樣部位、采樣人、采樣地點(diǎn)、日期、天氣、生產(chǎn)廠家名稱及詳細(xì)通訊地址等內(nèi)容。

4.2.5 樣品保存 樣品量應(yīng)滿足檢測及備查的需要，把樣品等量分成2份，1份供檢測用，1份留作備查。每份樣品量至少應(yīng)為檢驗(yàn)需要量的3倍。保存：（1）惰性的包裝材質(zhì)，合適的包裝形式，貼上有規(guī)定內(nèi)容的標(biāo)簽，樣品制成后應(yīng)盡快檢驗(yàn)。（2）備檢樣品一般貯存在低溫低濕的環(huán)境下，水分含量較大的番茄、圓椒等樣品可在-20℃保存90d，如需延長保存，則需在-80℃環(huán)境，以保證蛋白質(zhì)分子和DNA的完整性；油菜、玉米等種子，大豆粉、玉米油等干燥密封的樣品，則可以在4℃環(huán)境下保存。根據(jù)特殊需要和樣品特性，可以適當(dāng)延長和縮短。

4.2.6 樣品檢測 根據(jù)特定檢測目的，結(jié)合檢測的時(shí)效要求，確定檢測手段，如：實(shí)時(shí)熒光定量PCR、快速試紙條監(jiān)測方法等，并對檢測結(jié)果進(jìn)行分析與處理，實(shí)現(xiàn)監(jiān)測目標(biāo)。

5 PCR檢測的抽制樣方法分析

5.1 抽制樣檢測原理 轉(zhuǎn)基因風(fēng)險(xiǎn)檢測的抽樣除遵循一般的抽樣理論以外，還必須考慮以下幾方面：（1）轉(zhuǎn)基因成分檢測以DNA遺傳物質(zhì)為模板，樣品制備以生物最小遺傳單位為基礎(chǔ)，與種子顆粒大小密切相關(guān)；（2）樣品大小需根據(jù)轉(zhuǎn)基因檢測極限、二項(xiàng)分布和最小顆粒重等綜合計(jì)算；（3）轉(zhuǎn)基因成分檢測靈敏度高，經(jīng)PCR擴(kuò)增，能將目的基因或某一DNA片段在數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至上萬倍，即能在100萬個(gè)細(xì)胞中檢出1個(gè)靶細(xì)胞。為此，防止樣品污染乃重中之重，取樣器材在不同批次樣品的抽取過程中要注意清洗；貯存樣品的容器或包裝要一次性使用或溶劑反復(fù)清洗；（4）遵循檢測極限原理，樣本容量不小于檢測極限要求；（5）考慮國家轉(zhuǎn)基因標(biāo)識的閾值和法律規(guī)定，樣本容量不小于閾值要求的最低樣本量。

所謂檢測極限，是指檢測方法能夠準(zhǔn)確識別的最低含量。目前的定性PCR方法檢測極限一般在0.1%左右。也就是說，1 000粒種子中有一粒轉(zhuǎn)基因種子就可以準(zhǔn)確檢測出來，低于這個(gè)含量將不準(zhǔn)確。同時(shí)，PCR反應(yīng)體系中，至少要有一個(gè)以上轉(zhuǎn)基因DNA分子拷貝，才有可能得到陽性結(jié)果，這是理論檢測極限。

不同的檢測方法檢測極限不同，抽樣必須滿足檢測方法的極限要求。定性PCR檢測極限一般為0.1%左右，而定量PCR極限一般為反應(yīng)體系中有20個(gè)基因組拷貝（百分含量需要根據(jù)不同物種的基因組大小進(jìn)行換算）。

目前，我國采取較為嚴(yán)格的定性標(biāo)識制度，只要轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)能夠檢測到轉(zhuǎn)基因成分，就認(rèn)為是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。歐洲、日本等國家采取定量標(biāo)識制度，樣品中轉(zhuǎn)基因成分含量高于規(guī)定閾值則需要標(biāo)識為轉(zhuǎn)基因。歐盟國家的轉(zhuǎn)基因標(biāo)識閾值[4]是0.9%，巴西、澳大利亞等的是1%，日本加拿大等的是5%。閾值越低，檢測的樣本量要求越高。

5.2 抽制樣誤差控制 在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品成分檢測過程中，抽樣關(guān)系到檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，涉及到較復(fù)雜的統(tǒng)計(jì)學(xué)和分子生物學(xué)原理。檢測結(jié)果是樣品的特性反映，而樣品能否代表總體的實(shí)際情況將取決于抽樣的效果。抽樣必須要有代表性，抽樣量在抽樣成本控制等條件下，必須足夠大，以便含量低的成分也能被檢測到。因此，一個(gè)科學(xué)的抽樣方案必須考慮如何獲得有代表性的樣本以及抽多少樣的問題。抽樣方案還必須針對具體情況，解決具體問題（如種子、大田抽樣問題等）。

5.3 抽制樣標(biāo)本量 在確定實(shí)驗(yàn)室樣品大小時(shí)，將定性檢測和定量檢測分開考慮（檢測極限不同）；將均勻批和不均勻批要分開考慮（抽樣誤差不同）。

5.3.1 定性檢測 從樣品總體中只要檢出至少包括一粒陽性種子（成分），即定義為陽性樣品。由于PCR定性檢測的極限值（LOD）為0.1% [5]，因此，分析樣品1 000粒種子中有1粒是陽性是最低條件。

根據(jù)以上分析，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因種子的定性檢測（在通用檢測極限0.1%假定下），置信度為95%時(shí)，最低樣本量為3 000粒種子；置信度為99%時(shí)，則至少5 000粒左右。即：磨樣3 000粒種子，檢測100次可得到95次正確結(jié)果；磨樣5 000粒種子，檢測100次可得到99次正確結(jié)果。

最低抽樣量可以用種子粒數(shù)表示，在實(shí)際操作應(yīng)用中，為方便取樣，一般最低取樣量以重量為單位，便于稱量（表3）。

如果不是種子，而是粉狀物或液體等，則以經(jīng)驗(yàn)LOD≥20個(gè)拷貝為原則。為了應(yīng)用方便，通常以基本顆粒數(shù)不少于10 000為計(jì)數(shù)基礎(chǔ)。根據(jù)《NY/T 673-2003 轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測 抽樣》規(guī)定，一般情況下，按照表4確定送檢樣品的最小量。特殊情況下，可適當(dāng)增減。

6 田間作物轉(zhuǎn)基因成分抽樣檢測

轉(zhuǎn)基因作物是應(yīng)用生物技術(shù)對農(nóng)作物基因組進(jìn)行改造獲得的。雖然我國對轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物商業(yè)化種植持謹(jǐn)慎的態(tài)度，但全國乃至全球的轉(zhuǎn)基因作物種植面積仍然快速增加，推廣的轉(zhuǎn)基因品系不斷增多。隨著對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估及相關(guān)法規(guī)相繼出臺，田間作物的轉(zhuǎn)基因成分風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測和檢測鑒定顯得越來越重要。目前，常用快速試紙條檢測方法對葉片進(jìn)行初步篩選檢測，再用實(shí)驗(yàn)室PCR檢測法進(jìn)行二次確認(rèn)。

6.1 確定本土作物生長周期 與農(nóng)產(chǎn)品監(jiān)測的隨機(jī)性不同，田間作物監(jiān)測需根據(jù)田間作物種植區(qū)域性特點(diǎn)，結(jié)合本土作物的生長周期，確定監(jiān)測時(shí)間，以保證監(jiān)測及時(shí)性、有效性和針對性。一是在播種前開展種子轉(zhuǎn)基因成分檢測，二是在作物開花期前開展田間作物葉片抽樣，及時(shí)防范違規(guī)種植的轉(zhuǎn)基因作物通過種子、花粉等傳播途徑擴(kuò)散外源基因、造成環(huán)境污染。作物抽樣時(shí)間規(guī)律如下：

水稻：喜溫怕寒，適宜在廣東省種植。我市水稻一年兩熟，分為早造、晚造。早造生育期一般為120～130d，3月下旬開始種植，清明前后插秧；晚造生育期一般為150～160d以上，7月下旬開始播種，12月中旬收割。

玉米：四季均可種植，春玉米的主要生育期為3-6月，冬種玉米播種期為11月上旬（晚稻收割后），次年3月中旬成熟。

油菜：廣東省油菜種植規(guī)模較小，主要以冬油菜為主，生育期一般為130～290d，播種期為10月下旬或11月上旬。

辣椒：在我市一年四季均可種植，但春夏季節(jié)雨量較多，容易傳染病害，加之為避開臺風(fēng)，宜秋冬季種植。

番茄：在我市一年四季均可種植，播種一般為8-9月，9-10月份移栽，11月中旬開始采收。

6.2 田間作物風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測的樣品制備方法

6.2.1 確定取樣地點(diǎn)選擇 按照通用原則，針對種植同一作物品種的，1.33hm2以下的大田采用5點(diǎn)法，選取具有代表性的5個(gè)單位調(diào)查取樣 [6]；1.33hm2以上的大田，按每0.267hm2左右作為一個(gè)調(diào)查取樣單位，確定該大田作物的調(diào)查取樣單位總量。

田間作物一般片塊分布較均勻，目前較通用的是采取點(diǎn)狀取樣法，即從田塊四角的2條對角線的交駐點(diǎn)（田塊正中央），以及交駐點(diǎn)到4個(gè)角的中間點(diǎn)等5點(diǎn)取樣；或者，在離田塊四邊4～10步遠(yuǎn)的各處，隨機(jī)選擇5個(gè)點(diǎn)取樣。

6.2.2 采樣點(diǎn)選擇 采樣時(shí)使用GPS定位系統(tǒng)，用油漆、標(biāo)記物或其他方法標(biāo)記定位取樣點(diǎn)。

6.2.3 樣品保存及檢測準(zhǔn)備 葉片裝入標(biāo)簽登記好的干凈塑料袋內(nèi)干燥保存，另外，準(zhǔn)備2mL離心管、離心管架、粉碎機(jī)、一次性杯子、一次性筷子，提取液、蒸餾水、滴管等材料。

6.2.4 進(jìn)行葉片快速檢測[7] （1）用清洗處理后的剪刀等裁剪工具，對葉片樣品進(jìn)行均勻及初步碾碎；（2）取長2cm，寬0.5cm的葉片各2份，分別放置于2根2mL離心管中；（3）加入0.5mL的純凈水，用一次性筷子上下搓碎葉片直到液體呈現(xiàn)淡綠色，并依此在白紙上做好樣品信息標(biāo)記；（4）將試紙條帶箭頭的一端朝下，注意試紙條下端浸入液面的深度不超過0.5cm；（5）觀察液面上升，3min后取出觀察；（6）結(jié)果判斷并記錄：在同等條件下檢測樣品，若試紙上分別出現(xiàn)控制線C和檢測線T，則結(jié)果為陽性（+），只出現(xiàn)一條控制線C，為陰性（-），C線未出現(xiàn)，則操作失誤或試紙條失效。

7 風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測處置

7.1 推動(dòng)轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因風(fēng)險(xiǎn)追溯制度的建立和實(shí)施 轉(zhuǎn)基因種子生產(chǎn)基地、轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)基地、加工企業(yè)等應(yīng)當(dāng)建立轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)檔案，記載供應(yīng)商信息、生產(chǎn)批次、產(chǎn)量、銷量及供貨方提供的轉(zhuǎn)基因成分檢測情況說明，加強(qiáng)轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測，并建立農(nóng)產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分檢測（送檢/自檢）制度，完善不合格產(chǎn)品的處理措施。對產(chǎn)出的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品要建立完善的質(zhì)量追溯制度。

7.2 建立信息預(yù)警通報(bào)及防控機(jī)制 建立監(jiān)測數(shù)據(jù)庫和數(shù)據(jù)信息化平臺，捕捉國內(nèi)外轉(zhuǎn)基因安全事件，實(shí)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警實(shí)時(shí)反應(yīng)。著重對海量信息的篩選、分析、確證，實(shí)現(xiàn)對轉(zhuǎn)基因生物安全進(jìn)行全程的動(dòng)態(tài)監(jiān)測和溯源，及時(shí)發(fā)現(xiàn)可能潛在的安全隱患，并針對性的對該品種開展田間作物或農(nóng)產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因成分抽樣監(jiān)測，掌握暴露風(fēng)險(xiǎn)水平。

7.3 開展農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物風(fēng)險(xiǎn)等級評估 根據(jù)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全突發(fā)事件可能發(fā)生的數(shù)量、規(guī)模及其危害程度進(jìn)行預(yù)測、分析、評估，對人類、動(dòng)植物、微生物和生態(tài)環(huán)境的危險(xiǎn)程度，將農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物分為以下4個(gè)等級：安全等級I：尚不存在危險(xiǎn)；安全等級Ⅱ：具有低度危險(xiǎn)；安全等級Ⅲ：具有中度危險(xiǎn)；安全等級Ⅳ：具有高度危險(xiǎn)。

通過不同評估等級，確定預(yù)警級別，按特別嚴(yán)重、嚴(yán)重、較嚴(yán)重和一般等4個(gè)等級的預(yù)警分級響應(yīng)，分別啟動(dòng)相應(yīng)應(yīng)急預(yù)案。對安全等級Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的轉(zhuǎn)基因生物，在廢棄物處理和排放之前應(yīng)當(dāng)采取可靠措施將其銷毀、滅活，以防止擴(kuò)散和污染環(huán)境；發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因生物擴(kuò)散、殘留或者造成危害的，必須立即采取有效措施加以控制、消除。

7.4 加強(qiáng)科普宣傳教育 轉(zhuǎn)基因技術(shù)作為一項(xiàng)新技術(shù)，研究和應(yīng)用起步晚，公眾對轉(zhuǎn)基因技術(shù)及安全管理情況還不夠了解，監(jiān)管責(zé)任主體可通過媒體、公眾活動(dòng)日、專家座談會等多種渠道，宣傳農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)基本知識及農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物法律法規(guī)及安全管理制度等，及時(shí)向社會傳遞科學(xué)、權(quán)威、客觀的信息。

參考文獻(xiàn)

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[2]Hofte H，Whitreley H R. Insecticadal crystal proteins of Bacihus thuringiensis[J].Microbiol Rev.2010，53：242-255.

[3]權(quán)潔霞，陳長法. 轉(zhuǎn)基因植物的PCR檢測[J].植物雜志，2011，07：26-31.

[4]張忠民. 轉(zhuǎn)基因食品標(biāo)識閾值問題研究[J].食品科學(xué)，2015，09.

[5]Jia S-R，Jin W-J. International debate on biosafety of genetically modified crops：Scientific review on several cases of debate[J].J Agric Biotechnol，2013，11：1-5.

[6]Becan MW，F(xiàn)lavell RB，Chilton ND.A chimaetic antibiotic resistance gene as a seletable marker for a plant cell transformation[J].Nature，2009，304：184-187.

[7]許明，程祖鋅，黃志偉.一種適于轉(zhuǎn)基因水稻PCR檢測的微量DNA快速提取法[J].生物技術(shù)通報(bào)，2010，03：128-131.

（責(zé)編：張長青）