耿　良，范　敬，高啟龍，俞　靜，花寶金

(1. 鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，河南省腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)科，鄭州　450008； 2. 河南中醫(yī)藥大學(xué)，鄭州　450008； 3. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院腫瘤科，北京　100050； 4.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院腫瘤科，北京　100053)

·論著·

人參皂苷Rg3和PEG-PLGA-Rg3納米微粒對Lewis肺癌小鼠的作用及其機(jī)制

耿良1，范敬2，高啟龍1，俞靜3，花寶金4△

(1. 鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，河南省腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)科，鄭州450008； 2. 河南中醫(yī)藥大學(xué)，鄭州450008； 3. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院腫瘤科，北京100050； 4.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院腫瘤科，北京100053)

[摘要]目的：觀察并比較20(R)-人參皂苷Rg3[20(R)-ginsenoside Rg3，Rg3]和聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)-聚乳酸羥基乙酸(poly lactic-co-glycolic acid，PLGA)-Rg3納米微粒(Rg3-N)對Lewis肺癌荷瘤小鼠的影響，探討它們體內(nèi)抗腫瘤作用的機(jī)制。方法： 建立小鼠Lewis肺癌動物模型，60只小鼠隨機(jī)分為人參皂苷Rg3納米微粒組(Rg3-N)、PEG-PLGA納米載體組(PEG)、20(R)-人參皂苷Rg3單體組(Rg3)、生理鹽水組(NS)和空白對照組(C)，每組12只，灌胃給藥共14 d。每隔2 d測量小鼠的體重并繪制小鼠體重變化曲線，觀察各組小鼠毛色、活動和精神狀態(tài)等一般情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天處死小鼠，計(jì)算抑瘤率和腫瘤質(zhì)量與體重比值；免疫組織化學(xué)法CD31抗體標(biāo)記來計(jì)算微血管密度(microvessel density，MVD)，以評價Rg3和Rg3納米緩釋微粒的體內(nèi)抗血管生成作用，并通過實(shí)時定量PCR、免疫組織化學(xué)和Western blot法檢測基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、Ki-67等血管新生和細(xì)胞增殖相關(guān)因子水平，以探討其體內(nèi)抗腫瘤作用的分子機(jī)制。結(jié)果： NS組和PEG組小鼠的體重呈現(xiàn)先升后降的趨勢，而其余3組小鼠的體重則呈現(xiàn)逐漸上升并保持穩(wěn)定的趨勢。相對于NS組，Rg3組和Rg3-N組小鼠的毛色更亮，精神狀態(tài)更好，更加活躍，一般狀況較好。PEG組、Rg3組和Rg3-N組的腫瘤質(zhì)量與NS組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但Rg3組和Rg3-N組的腫瘤質(zhì)量與體重比值和微血管密度明顯下降，與NS組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，Rg3組和Rg3-N組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與NS組相比，Rg3組和Rg3-N組的VEGF mRNA、MMP-9、HIF-1α、VEGF的蛋白表達(dá)顯著下降，且Rg3-N組上述各指標(biāo)相對于Rg3組有進(jìn)一步降低的趨勢，PEG組、Rg3組和Rg3-N組Ki-67的表達(dá)均未見明顯差異。結(jié)論： 人參皂苷Rg3和PEG-PLGA-Rg3納米微粒能抑制Lewis肺癌小鼠VEGF、MMP-9和HIF-1α的表達(dá)，從而間接地發(fā)揮它們的抗腫瘤作用，并改善小鼠的一般狀況；此外，PEG-PLGA納米微粒包埋可以增強(qiáng)Rg3的體內(nèi)抗腫瘤作用。

[關(guān)鍵詞]人參皂苷Rg3；納米粒子；癌，Lewis肺；血管生成

20(R)-人參皂苷Rg3[20(R)-ginsenosideRg3，Rg3]是扶正中藥人參的主要活性成分之一，具有抑制腫瘤新生血管形成[1]、調(diào)節(jié)免疫[2]、防止腫瘤復(fù)發(fā)、擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移的作用[3]，因而在國內(nèi)外受到廣泛關(guān)注。為了進(jìn)一步提高20(R)-人參皂苷Rg3的生物利用度和臨床療效，本研究用聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)/聚乳酸羥基乙酸(polylactic-co-glycolicacid，PLGA)納米載體包埋Rg3，制備出PEG-PLGA-Rg3納米微粒，并通過動物實(shí)驗(yàn)比較其與Rg3單藥對Lewis肺癌小鼠的影響。

1材料與方法

1.1藥物

人參皂苷Rg3單體由大連天富科技開發(fā)有限公司提供，純度>99%。Rg3納米微粒由北京交通大學(xué)生命科學(xué)與生物工程研究院制備，經(jīng)微孔濾膜法測定，微粒的載藥量較為滿意，達(dá)到每毫克微球載藥368μg，二者均用無菌PBS配置成混懸液，保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要試劑

反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時熒光定量PCR試劑盒購自美國Promega公司；Trizol購自美國Invitrogen公司；BCA蛋白定量試劑盒購自美國Pierce公司；β-actin單克隆抗體(#4970)購自美國CellSignaling公司；缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxiainduciblefactor-1α，HIF-1α)多克隆抗體(ab85886)、血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)多克隆抗體(ab46154)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinase-9，MMP-9)多克隆抗體(ab38898)、Ki-67多克隆抗體(ab66155)購自英國abcam公司；血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(plateletendothelialcelladhesionmolecule-1，PECAM-1/CD31)單克隆抗體(sc101454)購自美國SantaCruze公司。

1.3實(shí)驗(yàn)動物及分組

實(shí)驗(yàn)動物為健康雄性C57小鼠，4～6周齡，體重16～18g，共60只，購于中國科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，喂養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院清潔級動物室。隨機(jī)分為空白對照組(C)、生理鹽水組(NS)、PEG-PLGA納米載體組(PEG)、Rg3單體組(Rg3)和Rg3納米微粒組(Rg3-N)5組，每組12只。

瘤株：小鼠Lewis肺癌瘤株購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心。

1.4建立Lewis肺癌動物模型

參考文獻(xiàn)[4]方法，除C組外的每只小鼠右腋皮下接種0.2 mL瘤細(xì)胞懸液(約2×106個細(xì)胞)。

1.5動物處理方法

NS組于造模后第2天，給予生理鹽水灌胃,其余4組均于同日開始灌胃，參考臨床使用劑量和文獻(xiàn)[5-6]，Rg3組給予Rg3[40mg/(kg·d)]灌胃，PEG組予PEG-PLGA納米載體[40mg/(kg·d)]灌胃，Rg3-N組予Rg3納米微粒[40mg/(kg·d)]灌胃，C組給予生理鹽水灌胃，各組均為每日1次，每次0.2mL，共計(jì)14d。

1.6取材及檢測指標(biāo)

每隔2d測量小鼠的體重并繪制小鼠體重變化曲線，觀察各組小鼠毛色、活動和精神狀態(tài)等一般情況，計(jì)算各組小鼠的病死率，比較各組小鼠的總體生存情況。

于實(shí)驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天，摘眼球法取血后處死小鼠，剝離瘤組織并稱其質(zhì)量，計(jì)算抑癌率和腫癌質(zhì)量與體重比值，抑瘤率=(1-實(shí)驗(yàn)組平均瘤質(zhì)量/對照組平均瘤質(zhì)量)×100%，腫瘤質(zhì)量與體重比值=平均瘤質(zhì)量/平均小鼠體重×100%，取瘤組織進(jìn)行下列分子生物學(xué)指標(biāo)檢測。

1.7實(shí)時定量PCR法檢測VEGF基因表達(dá)

從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得小鼠VEGF的cDNA序列，設(shè)計(jì)引物序列如下：VEGF上游引物5′-ATGAACTTTCTGCTCTCTGG-3′，下游引物5′-TCAT-CTCTCCTATGTGCTGGC-3′；以β-actin為內(nèi)參，上游引物5′-ACTCGTCATACTCCTGCT-3′，下游引物5′-GAAACTACCTTCAACTCC-3′。

按照Trizol使用說明從瘤組織中提取細(xì)胞總RNA，以提取的總RNA為模板，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，并以之為模板采用實(shí)時熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行基因擴(kuò)增，熱循環(huán)參數(shù)：95 ℃，2min→(95 ℃，15s+60 ℃，60s)×40個循環(huán)→60 ℃，15s→95 ℃，15s。

以β-actin作為內(nèi)參，采用相對定量法，以2-ΔΔCt來表示處理組VEGFmRNA的轉(zhuǎn)錄水平，通過溶解曲線來確認(rèn)PCR反應(yīng)的特異性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8Westernblot法檢測MMP-9、HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)

使用RIPA裂解液提取瘤組織的總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，100 ℃變性10min后行SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，封閉后用相應(yīng)的的一抗(β-actin、MMP-9、HIF-1α、VEGF的稀釋倍數(shù)均為1 ∶1 000)及二抗進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，ECL(electro-chemi-luminescent)發(fā)光法顯色，曝光系統(tǒng)內(nèi)曝光3min，觀察蛋白條帶的表達(dá)。

1.9免疫組化法檢測MVD和Ki-67表達(dá)

CD31陽性標(biāo)準(zhǔn)和微血管計(jì)數(shù)參照文獻(xiàn)[7]方法進(jìn)行，任何被染成棕褐色的單個內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞團(tuán)，必須與相鄰的腫瘤細(xì)胞、微血管和結(jié)締組織邊界區(qū)分清楚才作為一個微血管計(jì)數(shù)，如果結(jié)構(gòu)不相連，其分支結(jié)構(gòu)也當(dāng)做一個微血管計(jì)數(shù)，管腔面積大于8個細(xì)胞且有較厚肌層的血管不做計(jì)數(shù)，背景中陽性表達(dá)的漿細(xì)胞和血細(xì)胞等根據(jù)形態(tài)進(jìn)行排除。光學(xué)顯微鏡下先在低倍視野下(×100)掃描整張切片，每張切片選擇5個微血管密集區(qū)，然后在高倍視野下(×400)隨機(jī)計(jì)數(shù)其中5個視野，取平均值列入分析。

實(shí)驗(yàn)步驟同前，Ki-67陽性細(xì)胞為細(xì)胞核被染成棕黃色或棕褐色的細(xì)胞，計(jì)算Ki-67陽性細(xì)胞在總細(xì)胞中的比例。計(jì)算參照文獻(xiàn)[8]方法進(jìn)行，每張切片在低倍鏡(×100)下隨機(jī)選取5個視野，在高倍鏡(×400)下對陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，取其均數(shù)，均數(shù)/細(xì)胞總數(shù)即為結(jié)果。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS15.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料描述用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，不同條件下組間比較采用重復(fù)測量方差分析，對計(jì)量資料和計(jì)數(shù)資料分別進(jìn)行配對t檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn), 所有的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組小鼠的體重變化曲線、一般情況和死亡情況

給藥前對各組小鼠的體重進(jìn)行分析，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各組間具有可比性。開始給藥后每2日稱小鼠體重，繪制小鼠的體重曲線(圖1)，發(fā)現(xiàn)NS組和PEG組小鼠的體重呈現(xiàn)先升后降的趨勢，而其余3組小鼠的體重則呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。相對于NS組，Rg3組和Rg3-N組小鼠的毛色更亮，精神狀態(tài)更好，更加活躍，一般狀況較好。實(shí)驗(yàn)過程中，NS、PEG、Rg3和Rg3-N組小鼠分別死亡4、3、1和2只。

2.2各組小鼠的抑瘤率和腫瘤質(zhì)量與體重比值

完整剝離小鼠的腫瘤稱其質(zhì)量，計(jì)算各組的抑瘤率，發(fā)現(xiàn)PEG組、Rg3組和Rg3-N組均未表現(xiàn)出明顯的抑瘤作用，但Rg3組和Rg3-N組的腫瘤質(zhì)量與體重比值明顯下降，與NS組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)， 提示Rg3和Rg3納米微粒可降低小鼠的腫瘤質(zhì)量與體重比值，且Rg3-N組較Rg3組有進(jìn)一步降低腫癌質(zhì)量與體重比重的作用(表1)。

2.3MVD

NS、PEG-PLGA、Rg3、Rg3-N組的MVD值分別為46.3±3.8、44.5±2.6、25.0±2.2、23.7±1.5(圖2)，PEG組與NS組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示PEG-PLGA納米載體對MVD可能無明顯影響，而Rg3組和Rg3-N組較NS組均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，Rg3-N組較Rg3組亦有降低趨勢但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4VEGF的基因表達(dá)

PEG、Rg3和Rg3-N組VEGFmRNA的轉(zhuǎn)錄水平分別為NS組的92.6%、67.2%和46.1%(圖3)，提示PEG-PLGA納米載體對VEGF基因的表達(dá)可能無明顯影響(P>0.05)，而Rg3和Rg3納米微粒給藥后VEGF基因的表達(dá)均下降且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且Rg3納米微粒組相較于Rg3組其表達(dá)亦明顯下降(P<0.05)。

表1　各組小鼠的腫瘤質(zhì)量、體重和腫瘤質(zhì)量與體重比值

C,normalcontrolgroup;NS,salinecontrolgroup;Rg3, 20(R)-ginsenosideRg3group;Rg3-N,PEG-PLGA-Rg3nanoparticlesgroup;PEG,PEG-PLGAgroup； *P<0.05, # P<0.01,comparedwithNSgroup.

C,normal control group; NS, saline control group; Rg3, 20(R)-ginseno side Rg3 group; Rg3-N, PEG-PLGA-Rg3 nanoparticles group; PEG, PEG-PLGA group.圖1　各組小鼠的體重曲線Figure 1　Body weight graph of each group mice

2.5MMP-9、HIF-1α、VEGF的蛋白表達(dá)

各組的內(nèi)參蛋白β-actin表達(dá)穩(wěn)定(圖4)，PEG組MMP-9、HIF-1α、VEGF的表達(dá)與NS組相比差別不明顯，提示40mg/(kg·d)的PEG-PLGA納米載體處理對MMP-9、HIF-1α、VEGF蛋白的表達(dá)可能無顯著影響，Rg3組和Rg3-N組與NS組相比以上3種蛋白的表達(dá)下降，提示40mg/(kg·d)的Rg3和Rg3納米微粒處理均能降低MMP-9、HIF-1α、VEGF的蛋白表達(dá)，且Rg3-N組與Rg3組相比有進(jìn)一步下降的趨勢。

2.6Ki-67陽性表達(dá)細(xì)胞比例

NS、PEG、Rg3、Rg3-N組Ki-67陽性表達(dá)細(xì)胞的比例分別為34.7%±4.2%、36.8%±3.5%、37.3%±1.6%、35.7%±3.2%(圖5)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，PEG、Rg3和Rg3-N組與生理鹽水組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，Rg3和Rg3-N組之間差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

A, NS group; B, PEG group; C, Rg3 group; D, Rg3-N group.圖2　各組小鼠瘤組織 MVD表達(dá)Figure 2　MVD expression in each group mice tumor tissue

*P<0.05, compared with NS group; △P<0.05, compared with Rg3 group. 圖3　各組小鼠的VEGF mRNA相對表達(dá)量Figure 3　Relative expression level of VEGF mRNA in each group mice

圖4　各組小鼠瘤組織中的蛋白表達(dá)Figure 4　Protein expression in each group mice tumour tissue

A, NS group; B, PEG group; C, Rg3 group; D, Rg3-N group.圖5　各組小鼠瘤組織 Ki-67表達(dá)Figure 5　Ki-67 expression in each group mice tumour tissue

3討論

本研究Rg3和Rg3納米微?？梢悦黠@降低荷瘤小鼠的MVD，但卻對荷瘤小鼠的腫瘤質(zhì)量沒有明顯的影響。MVD即微血管密度，是評價腫瘤組織血管生成的常用指標(biāo)，MVD降低提示腫瘤的血管生成受到抑制，腫瘤的血液供應(yīng)減少，理應(yīng)腫瘤縮小，但為何MVD降低的同時沒有帶來瘤體的縮小，針對此疑問，本研究發(fā)現(xiàn)盡管Rg3和Rg3-N組小鼠的絕對腫瘤質(zhì)量并不低于生理鹽水組，但此兩組小鼠的一般狀況更好，體重更大，因此本研究認(rèn)為絕對腫瘤質(zhì)量上的無差異是由于Rg3和Rg3納米緩釋微粒的干預(yù)可能改善了小鼠的體質(zhì)，使腫瘤能獲得的營養(yǎng)總量更多所導(dǎo)致，并非因?yàn)樗鼈儾痪哂锌鼓[瘤作用，它們的作用不能僅僅依據(jù)絕對的腫瘤質(zhì)量來說明，而應(yīng)與小鼠的整體情況結(jié)合起來綜合評價。因此本研究引入了腫瘤質(zhì)量與體重比值這個概念來共同說明Rg3的抗腫瘤作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管Rg3組和Rg3-N組的腫瘤質(zhì)量與NS組相比沒有明顯差異，但二組的腫瘤質(zhì)量與體重比值較NS組明顯下降，提示Rg3和Rg3納米微粒可能具有體內(nèi)的抗腫瘤活性。

對于Rg3和Rg3納米微粒降低MVD的內(nèi)在機(jī)制，分子生物學(xué)的結(jié)果顯示，這兩組的MMP-9、HIF-1α、VEGF表達(dá)均下降。MMPs對血管生成的意義除了“打開血管生成開關(guān)”外，還體現(xiàn)在降解基底膜，為內(nèi)皮細(xì)胞移行至血管生成部位打開通道[9]。HIF-1α、VEGF對腫瘤的血管新生乃至整體發(fā)展都具有十分重要的意義，HIF-1α作為迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一一個在特異性缺氧情況下發(fā)揮活性的轉(zhuǎn)錄因子，在腫瘤微環(huán)境的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中處于重要地位，不但能直接促進(jìn)VEGF轉(zhuǎn)錄，增加VEGFmRNA的穩(wěn)定性，上調(diào)VEGF表達(dá)，還能誘導(dǎo)環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,cox-2)、核因子κB(nuclearfactorκB，NF-κB)等炎性因子表達(dá)，繼而影響表皮生長因子(epidermalgrowthfactor，EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF)、血小板衍生生長因子(platelet-derivedgrowthfactor，PDGF)等促血管因子來促進(jìn)血管新生,以及誘導(dǎo)MMP表達(dá)上調(diào)而促進(jìn)腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移，影響整合素、鈣黏素等腫瘤黏附分子表達(dá)而促進(jìn)腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移等[10]。VEGF是目前公認(rèn)最重要的血管生成調(diào)節(jié)因子，除了最初發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)血管通透性的作用外，還可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)整合素-1、αV、β3、β5及其配體，介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和浸潤；可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分泌多種組織蛋白酶降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、運(yùn)動和血管腔樣結(jié)構(gòu)形成；近年來還發(fā)現(xiàn)VEGF可以動員內(nèi)皮祖細(xì)胞從骨髓進(jìn)入外周血，是血管生成的主要調(diào)控因子之一。因此本課題組認(rèn)為，Rg3和Rg3納米微粒的體內(nèi)抗血管活性可能來源于它們對MMP-9、HIF-1α、VEGF表達(dá)的抑制，它們除了可以通過抑制MMPs的活性來抑制內(nèi)皮細(xì)胞向血管生成部位的運(yùn)動外，還可以改善腫瘤局部的缺氧狀況而降低VEGF的表達(dá)。

腫瘤細(xì)胞的一大特征就是失去控制的惡性增殖，其惡性增殖的水平與其惡性程度呈正相關(guān)，因此本課題組還通過免疫組織化學(xué)方法檢測Ki-67，觀察各組腫瘤細(xì)胞的增殖率。Ki-67是一種與細(xì)胞周期有關(guān)的增殖細(xì)胞核抗原，同細(xì)胞的DNA半保留復(fù)制具有偶連性，在有絲分裂的G1，G2，S，M期都有表達(dá)，其中以G2期和M期表達(dá)最強(qiáng)。Ki-67的反義寡核苷酸可以抑制細(xì)胞的增生，提示Ki-67的陽性表達(dá)與細(xì)胞增殖密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)PEG、Rg3和Rg3-N組Ki-67的陽性表達(dá)率與生理鹽水組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，Rg3組和Rg3-N組之間差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示無論是PEG-PLGA納米載體，還是Rg3單體，以及Rg3納米緩釋微粒均不能直接抑制Lewis肺癌小鼠腫瘤細(xì)胞的增殖。

綜上所述，人參皂苷Rg3抗肺癌血管生成的作用不是通過直接的殺傷癌細(xì)胞或是抑制腫瘤的增殖，而是通過降低MMP-9、HIF-1α、VEGF等血管生成相關(guān)因子的表達(dá)，減少腫瘤對內(nèi)皮細(xì)胞的募集,以及改善動物的一般狀態(tài)來實(shí)現(xiàn)的，這與人參皂苷Rg3作為扶正中藥人參的有效成分相符，與中醫(yī)治療癌癥的原則——扶正培本治則也是相符的。Rg3納米微粒抑制腫瘤血管生成的作用并不弱于Rg3，考慮到每毫克的納米微粒僅載有368μg的Rg3原藥，我們有理由認(rèn)為Rg3的納米化包埋提高了Rg3的抗腫瘤活性。PEG-PLGA形成的親水/疏水二嵌段共聚物制備的納米藥物載體因其通過物理方式包載藥物和不改變藥物化學(xué)組分的優(yōu)點(diǎn)近年來受到廣泛關(guān)注，此外，它還具有粒徑小、水溶性高、載藥范圍廣、緩釋、無毒等優(yōu)點(diǎn)[11-12]，是腫瘤藥物新劑型研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。PEG-PLGA二嵌段共聚物含有親水和疏水兩部分結(jié)構(gòu)，PLGA組成納米粒的疏水內(nèi)核，通過物理結(jié)合的方式包載藥物，在體內(nèi)可緩慢無毒降解為CO2和水，因此具有緩釋作用；PEG因具有良好的生物相容性和無毒特點(diǎn)，常被用做納米粒的親水性外殼，主要用以提高納米微粒在溶液中的穩(wěn)定性。由于藥物被包裹在納米微粒的內(nèi)核，因而可以長效緩慢地釋放,并使那些水溶性差的藥物能高效地進(jìn)入機(jī)體組織[13]，從而更好地被機(jī)體利用。因此，本課題組推測經(jīng)過PEG-PLGA納米載體的包埋，Rg3在體內(nèi)能夠緩緩的釋放，從而達(dá)到更高的生物利用度和維持更長時間的血藥濃度，最終提高了Rg3的治療效果。在后續(xù)的研究中，還需要進(jìn)行相應(yīng)的體內(nèi)藥物代謝方面的實(shí)驗(yàn)來提供更有力的證據(jù)支持。

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(2015-10-22收稿)

(本文編輯：王蕾)

Preliminary study for the roles and mechanisms of 20(R)-ginsenoside Rg3 and PEG-PLGA-Rg3 nanoparticles in the Lewis lung cancer mice

GENG Liang1, FAN Jing2, GAO Qi-long1, YU Jing3, HUA Bao-jin4△

(1.DepartmentofIntegratedChineseandWestemMedicine,CancerHospitalAffiliatedtoZhengzhouUniversity,HenanCancerHospital,Zhengzhou450008,China; 2.HenanUniversityofChineseMedicine,Zhengzhou, 450008,China; 3.DepartmentofOncology,BeijingFriendshipHospitalAffiliatedtoCapitalMedicalUniversity,Beijing100050,China; 4.DepartmentofOncology,Guang’anmenHospital,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100053，China)

ABSTRACTObjective：To comparatively observe the effects of 20(R)-ginsenoside Rg3 and PEG-PLGA-Rg3 nanoparticles on the Lewis lung cancer mice and to explore the mechanisms of Rg3 and PEG-PLGA-Rg3 nanoparticle anti-cancer in vivo. Methods: Lewis lung cancer mouse model was established and 60 mice were randomly divided into 5 groups with twelve in each group: PEG-PLGA-Rg3 nanoparticles group(Rg3-N), PEG-PLGA group (PEG), Rg3 group (Rg3), normal control group(C), saline control group(NS), and received intragastric administration for 14 days. The weights of the mice were measured every 2 days and the weight curves were obtained. At the same time, the color pattern, activity and mental status were observed. The mice were sacrificed when the administration was over, and the effects of 20(R)-ginsenoside Rg3 and PEG-PLGA-Rg3 nanoparticles on tumor weight, and the tumor:weight ratios were analysed. In addition, the tumor microvessel density (MVD) was measured by immunohistochemical staining with anti-CD31 antibody to compare the effects of Rg3 and PEG-PLGA-Rg3 nanoparticles on the tumor angiogenesis in vivo. Furthermore, the levels of such angiogenesis and proliferation factors as MMP-9,HIF-1α,VEGF,Ki-67 were examined by RT-PCR, Western blot and immunohistochemistry to explore the internal molecular mechanisms of anti-tumor effects in vivo. Results: The trends of variation of the mice weights in NS group and PEG group were rising early but declining later. In contrast, the trends of the other three groups were rising early and became stable later. In comparison with NS group, the mice of Rg3 group and Rg3-N group had better general status: brighter color, more active and better spirit. Compared with NS group，the tumor weight in PEG group, Rg3 group and Rg3-N group showed no significant difference but the tumor:weight ratio and MVD in Rg3 group and Rg3-N group declined signi-ficantly (P<0.01). Besides, there was no significant difference between Rg3 group and Rg3-N group. At the same time, the level of VEGF mRNA, the protein expression of MMP-9, HIF-1α,VEGF in Rg3 group and Rg3-N group decreased compared with NS group. Furthermore, the level of each index above-mentioned in Rg3-N group was lower than that in Rg3 group. The expression of Ki-67 in PEG group,Rg3 group and Rg3-N group showed no significant difference compared with NS group. Conclusion: Rg3 and PEG-PLGA-Rg3 nanoparticle may suppress the expression of VEGF, MMP-9 and HIF-1α in Lewis lung cancer mice, thereby indirectly contributing to their antitumor effects and alleviating the mice’s general status. In addition, PEG-PLGA nanoparticles embedding can promote Rg3 antitumor effect in vivo.

KEY WORDSGinsenoside Rg3; Nanoparticles; Carcinoma, Lewis lung; Angiogenesis

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(81473638,30973839)資助Supported by the National Natural Science Foundation of China (81473638, 30973839)

[中圖分類號]R734.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號]1671-167X(2016)03-0496-06

doi:10.3969/j.issn.1671-167X.2016.03.021

△Correspondingauthor’se-mail,huabaojin@sohu.com

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-5-1815：10：00網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.4691.R.20160518.1510.002.html