楊秋月，徐相蓉，焦　潔，何麗華△ ，余善法△，谷桂珍，陳國順，周文慧，吳　輝，李艷紅

(1. 北京大學公共衛(wèi)生學院勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學系，北京　100191； 2. 河南省職業(yè)病防治研究院，鄭州　450052；3. 河南省舞鋼勞動衛(wèi)生職業(yè)病防治研究所，河南舞鋼　462500 )

·論著·

GRHL2基因多態(tài)性與噪聲性聽力損失易感性的關(guān)系

楊秋月1，徐相蓉1，焦?jié)?，何麗華1△，余善法2△，谷桂珍2，陳國順3，周文慧2，吳輝2，李艷紅2

(1. 北京大學公共衛(wèi)生學院勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學系，北京100191； 2. 河南省職業(yè)病防治研究院，鄭州450052；3. 河南省舞鋼勞動衛(wèi)生職業(yè)病防治研究所，河南舞鋼462500 )

[摘要]目的：探討粒狀頭樣2(grainyhead-like 2，GRHL2)基因多態(tài)性與噪聲性聽力損失(noise-induced hearing loss，NIHL)易感性的關(guān)系。方法： 使用病例對照研究方法，對某鋼鐵廠3 790名噪聲暴露作業(yè)人員進行流行病學調(diào)查和聽力學測試，通過相關(guān)標準和匹配條件，共確定286例病例作為病例組和286例作為對照組。根據(jù)《工作場所物理因素測量噪聲》(GBZ/T189.8-2007)檢測噪聲暴露強度，抽取病例組和對照組人群空腹外周靜脈血 2 mL，用于基因組 DNA抽提，通過中高通量SNP分型檢測技術(shù)檢測GRHL2基因的5個單核苷酸位點的多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)。分別采用t檢驗和卡方檢驗比較病例組和對照組之間計量資料和計數(shù)資料的差異，采用多元 Logistic 回歸分析GRHL2基因的5個SNP與NIHL的關(guān)系，利用Haploview軟件和Phase軟件進行基因單體型的構(gòu)建和分析。結(jié)果： 5個位點基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡。在共顯性模型下，調(diào)整累積噪聲暴露量(cumulative noise exposure，CNE)、身高、吸煙、飲酒和血壓狀況后，與攜帶rs3735715位點GG基因型個體相比，GA基因型發(fā)生 NIHL的危險性降低，OR=0.644(95% CI:0.442～0.939，P=0.022)；通過對CNE進行分層分析發(fā)現(xiàn)，在CNE≥ 98 dB(A)組，rs3735715位點與NIHL的患病風險仍有關(guān)，與攜帶GG型人群相比，OR值為0.509(95% CI: 0.281～0.923，P=0.030)。單體型分析顯示，四位點構(gòu)成的單體型在病例組與對照組之間分布差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)論： GRHL2基因單核苷酸多態(tài)性可能與NIHL易感性有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]GRHL2；多態(tài)現(xiàn)象，遺傳；聽覺喪失，噪聲性；疾病易感性

噪聲性聽力損失(noise-induced hearing loss，NIHL)是由于工人在工作場所暴露于高強度的噪聲，對內(nèi)耳的聽力機制造成不可逆的損害，從而引起的聽力損失。NIHL被列為現(xiàn)階段全球性最主要的職業(yè)病之一，已經(jīng)成為我國第三大高發(fā)職業(yè)病。NIHL是由于環(huán)境因素和基因因素共同作用導致的疾病，實驗動物研究表明,某些基因可以影響動物對噪聲的易感性[1]，大樣本量的人群研究發(fā)現(xiàn)在暴露相同的噪聲條件下，個體間的聽閾不盡相同[2-3]，表明噪聲性聽力損失存在明顯的個體易感性差異。近年來，越來越多的學者開始探討噪聲性聽力損失的易感性與相關(guān)基因的關(guān)系，從分子水平上探索預防NIHL的方法。

粒狀頭樣2(grainyhead-like 2，GRHL2)基因是導致常染色體顯性感音神經(jīng)性聽力損失的原因，影響DFNA28位點[4]，同時研究也證明其與年齡相關(guān)性聽力損失有關(guān)[5]?；蚓幋aGRHL2蛋白，在耳蝸管內(nèi)上皮細胞高表達，不僅在胚胎發(fā)育過程起關(guān)鍵作用，也在整個生命期維持上皮細胞的功能。利用斑馬魚轉(zhuǎn)座子介導的基因捕獲技術(shù)，發(fā)現(xiàn)GRHL2是通過調(diào)控內(nèi)耳上皮細胞間連接的發(fā)育，維持內(nèi)耳腔內(nèi)的組分和濃度，為耳石和半規(guī)管系統(tǒng)等的正常發(fā)育提供必需的環(huán)境，保證了聽力和平衡系統(tǒng)的功能[6]。

考慮到GRHL2在內(nèi)耳的重要性，本研究檢測了572例噪聲暴露作業(yè)人員GRHL2基因的多態(tài)性位點的基因型，探討GRHL2基因單核苷酸多態(tài)性與NIHL易感性之間的關(guān)聯(lián)。

1資料與方法

1.1研究對象

以中國河南省某鋼鐵企業(yè)的3 790名接觸噪聲工作人員作為研究對象。入選標準：(1) 累積噪聲工齡≥3年；(2) 噪聲暴露強度≥ 80 dB(A)。排除標準：(1) 有頭顱外傷史、家族性耳聾病史、耳毒性藥物使用史、中耳炎、腮腺炎、麻疹、耳膜穿孔等;(2)純音聽力測試聽力曲線為水平樣或近似直線、語言頻率聽力損失大于等于高頻聽力損失、偽聾等。

在滿足上述標準的前提下，將雙耳高頻(3、4、6 kHz)平均聽閾≥40 dB(A)的對象作為病例組,將任一耳語頻(0.5、1、2 kHz)的任一頻段聽閾均≤ 25 dB(A)，且純音聽力測試高頻平均聽閾<35 dB(A)的對象作為對照組。再根據(jù)同性別、年齡相差不超過5歲，接噪工齡相差不超過2年的匹配標準，為每例病例匹配1例對照，若無法滿足匹配條件，則不納入本研究，本研究共納入了病例286例，對照286例。

本研究開始前經(jīng)過河南省職業(yè)病防治研究院倫理委員會審核批準[國家自然科學基金(81372940)倫理審批號：2013001；國家科技支撐計劃(2014BAI

12B03) 倫理審批號：2013003]，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2流行病學調(diào)查和體格檢查

采取調(diào)查員詢問和自報相結(jié)合的方法進行問卷調(diào)查。調(diào)查表主要包括以下內(nèi)容：人口學特征，包括性別、年齡等；生活習慣，包括吸煙及飲酒；既往病史，包括家族性耳聾病史和中毒史等；藥物使用史，如氨基糖苷類抗生素等藥物使用；職業(yè)史，噪聲暴露情況等；現(xiàn)場測量身高等生理指標。

1.3純音聽力測試

參照GBZ49-2007的要求，使用As216聽力計(丹麥Interacoustics AS公司)，使用前進行校準，在本底值噪聲<25 dB(A)的隔音室內(nèi)，對研究對象進行雙耳0.5、1、2、3、4、6 kHz共6個頻率的純音氣導聽閾測試，測試結(jié)果進行年齡和性別修正。

1.4作業(yè)場所噪聲測量

采用Noisepro多功能個體噪聲劑量計(美國QUEST公司)測量工人8 h 等效連續(xù)聲級(A)。將個人聲暴露計設(shè)置為A計權(quán)，“S(慢)”檔，取值為等效聲級LAeq，按相關(guān)規(guī)定在工作場所進行布點及測量[7]。

1.5累積噪聲暴露量(cumulative noise exposure，CNE)的計算

根據(jù)職業(yè)史信息計算出每個對象的CNE，按公式計算[8]:

,

n為作業(yè)人員接觸噪聲作業(yè)的工作崗位總數(shù)，LAeq為等效連續(xù)A聲級，T為各段接噪工齡(年)。

1.6DNA提取

采集研究對象的2 mL外周血于EDTA抗凝管中，使用2 mL血液基因組DNA提取試劑盒(上海萊楓生物科技有限公司)提取外周血DNA，采用Implen P360超微量分光光度計(上海博誼生物科技有限公司)檢測DNA的濃度和純度。

1.7SNP的選擇和基因分型

根據(jù)HapMap database (http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/) 和dBSNP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)數(shù)據(jù)庫，選擇漢族人群最小等位基因頻率(minor allele frequency， MAF)>0.1的位點，結(jié)合相關(guān)文獻所報告的位點，本研究選定了5個位點。

采用上海天昊生物科技有限公司的SNPscanTM多重SNP分型試劑盒對SNP進行分型，ABI3730XL DNA 分析儀進行測序，采用 GeneMapper 4.1 軟件分析獲取各個SNP位點的基因型。

1.8統(tǒng)計學分析

使用SPSS20.0軟件進行分析，計量資料采用t檢驗；計數(shù)資料及Hardy-Weinberg平衡檢驗采用卡方檢驗；在共顯性模型下，分析基因型與NIHL之間的關(guān)系；使用Haploview4.2和Phase2.1軟件進行單體型分析；用多元Logistic回歸分析計算OR值和95%可信區(qū)間，雙側(cè)P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1病例組與對照組一般情況分析

病例組平均年齡(40.5±8.1)歲，平均工齡(18.9±9.1)年，雙耳高頻平均聽閾位移(hearing threshold level，HTL)(51.9±9.0) dB(A)，噪聲暴露強度范圍80.2～93.9 dB(A)，CNE范圍86.7～108.4 dB(A)；對照組平均年齡(39.8±8.1) 歲，平均工齡(18.3±8.8)年，雙耳高頻平均聽閾位移(11.7±10.7) dB(A)，噪聲暴露強度范圍80.1～93.9 dB(A)，CNE范圍87.9～107.9 dB(A)。病例組雙耳高頻平均聽閾位移高于對照組(t=48.55，P<0.001)，吸煙狀況(χ2=17.82，P<0.001)在兩組中分布差異有統(tǒng)計學意義(表1)。

表1　病例與對照組基本情況

*The measurement data were accorded with the normal distribution, the mean of the measurement data between case and control were compared with the studentt-test; # The frequency of categorical data between case and control was compared by Pearson’sχ2test.

2.2GRHL2基因位點多態(tài)性對NIHL的影響

SNP基因型頻率在對照組人群中分布均符合遺傳學Hardy-Weinberg平衡。采用Logistic回歸分析，對兩組間身高、CNE、飲酒、吸煙及高血壓狀況等因素進行校正，各位點基因型分布情況如表2所示。其中rs3735715位點基因型在病例組人群中分布為GG型94例(33.2%)、GA型126例(44.5%)和AA型63例(22.3%)，在對照組人群中分布分別為67例(23.8%)、154例(54.8%)和60例(21.4%)；GA基因型與GG基因型比較， NIHL發(fā)生的危險度降低(P=0.022，OR=0.644，95%CI: 0.442～0.939)，未發(fā)現(xiàn)其他4個位點與NIHL易感性存在統(tǒng)計學關(guān)聯(lián)。

表2　GRHL2基因單核苷酸多態(tài)性對NIHL易感性的影響

*Adjusted for height, CNE, hypertension, drinking status and smoking status; SNP, single nucleotide polymorphisms.

2.3rs3735715位點與噪聲聯(lián)合作用對NIHL的影響

以CNE進行分層(表3)，對混雜因素進行校正后，在CNE < 98 dB(A) 組時，未見rs3735715基因多態(tài)性與NIHL患病風險有關(guān)(P>0.05)；在CNE≥98 dB(A) 組時，攜帶GA基因型與GG基因型相比，發(fā)生NIHL的風險降低，OR值為0.509。

表3　噪聲暴露情況對rs3735715與NIHL之間關(guān)聯(lián)的影響

*Adjusted for height, hypertension, drinking status and smoking status; CNE, cumulative noise exposure.

2.4單體型分析

對GRHL2基因進行連鎖不平衡檢驗(linkage disequilibrium，LD)，建立單體型塊(haplotype block)，利用Phase2.1軟件分析haplotype block涵蓋的位點構(gòu)建單體型，得到個體可能的單體型。rs3735713、rs3824090、 rs3735714和rs3735715位點構(gòu)成單體型，4位點之間表現(xiàn)出強LD。單體型分析結(jié)果見表4(報告頻率>5%的單體型)， 其中常見單體型為GCCA，以其為參照，單體型ATTG、GCCG、ACTG和GCTG發(fā)生NIHL的風險差異無統(tǒng)計學意義。

表4　GRHL2單體型與NIHL關(guān)聯(lián)分析

*Adjusted for height, CNE, hypertension, drinking status and smoking status.

3討論

本研究發(fā)現(xiàn)位于3′UTR 區(qū)的rs3735715位點表現(xiàn)出對NIHL的患病風險的影響，攜帶GA基因型的個體患NIHL的風險是GG型的0.644倍。3′UTR 區(qū)對基因的表達有調(diào)控作用，但基因多態(tài)性具體如何對NIHL的發(fā)生產(chǎn)生影響，需要更深入的體內(nèi)外實驗研究進行探討。在Konings等[9]對瑞典和波蘭人群基因多態(tài)性與噪聲易感性的關(guān)聯(lián)研究中，GRHL2基因的SNP基因型分布在噪聲易感組和噪聲耐受組差異無統(tǒng)計學意義，可能因為種族的差異，不同種族人群的同一基因同一位點的突變率而不同。Li等[10]對中國噪聲暴露工作人員的研究，發(fā)現(xiàn)rs611419位點的AT/TT基因型表現(xiàn)出保護作用，而本研究未發(fā)現(xiàn)此位點與NIHL之間的關(guān)系，可能是由于研究對象的來源不同，本研究對象均來源于鋼鐵廠，而此研究的對象則為機械制造廠和化纖廠；對于病例的定義不同，本研究將高頻聽損> 40 dB(A)作為病例入選標準，而此研究則為>25 dB(A)。以上原因可能導致了不同研究結(jié)果間的差異性。

由于NIHL是基因與環(huán)境共同作用導致的疾病，以噪聲為最主要的環(huán)境因素，基因與NIHL易感性之間的關(guān)系受噪聲暴露強度的影響[11]。本研究發(fā)現(xiàn)在CNE ≥ 98 dB(A)組，rs3735715 與NIHL的患病風險有關(guān)，攜帶GG基因型的個體患NIHL的風險更高，低于 98 dB(A) 組并未發(fā)現(xiàn)上述關(guān)系，此現(xiàn)象可能是由于噪聲暴露人員在強噪聲水平下更易患NIHL[12]。單個SNP可能只存在微效作用，獨立分析可能無法檢測出其潛在的作用，因此本研究進行了單體型分析。本研究構(gòu)建了GRHL2基因的單體型，探討其與NIHL之間的關(guān)系，然而未發(fā)現(xiàn)與NIHL患病易感性相關(guān)的單體型。

由于考慮到種族不同，相同的聯(lián)系結(jié)果定于基因水平，不需要單核苷酸多態(tài)性也得到相同結(jié)果[13]。盡管本研究發(fā)現(xiàn)的與NIHL易感性有關(guān)的位點與Li等[10]研究不同，但仍可視為研究結(jié)果得到了重復，表明GRHL2基因可能是NIHL的易感基因，同時需要考慮噪聲接觸水平對基因與NIHL易感性關(guān)聯(lián)的影響，但結(jié)果仍需在更多的研究中得到重復，此外，需要進行相關(guān)分子學研究，分析基因型影響表型改變的生理機制。

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(2016-02-18收稿)

(本文編輯：王蕾)

Association between grainyhead-like 2 gene polymorphisms and noise-induced hearing loss

YANG Qiu-yue1, XU Xiang-rong1, JIAO Jie2, HE Li-hua1△, YU Shan-fa2△, GU Gui-zhen2, CHEN Guo-shun3, ZHOU Wen-hui2, WU Hui2, LI Yan-hong2

(1. Department of Occupational and Environment, Peking University School of Public Health, Beijing 100191, China; 2. Henan Provincial Institute for Occupational Health, Zhengzhou 450052, China；3. Henan Provincial Wugang Institute for Occupational Health, Wugang 462500, Henan, China)

ABSTRACTObjective： To investigate association between genetic polymorphism in the grainyhead-like 2 gene (GRHL2) and noise-induced hearing loss (NIHL) in the Chinese population. Methods: A matched case-control association study was employed, In which, 3 790 workers exposed to continuous and steady-state occupational noise in a steel factory participated. The questionnaires were adopted to collect individual features and audiometry tests performed. In the sstudy, 286 subjects were diagnosed as cases, Which were each designated on the basis of the matched criterion, and 286 paired samples were selected finally. Noise intensity was measured according to the standards given in ‘Measurement of Noise in the Workplace’(Occupational Health Standard of the People’s Republic of China, GBZ/T189.8-2007). Cumulative noise exposure (CNE) was calculated, according to monitoring data on A-weighed sound pressure level and employment time. Genomic DNA was obtained from peripheral blood samples using 2 mL DNA extraction Kit following the manufacturer’s protocol. Five single nucleotide polymorphisms (SNPs) of GRHL2 were genotyped by multiplex SNP genotyping kit. The continuous variables and categorical variables were analyzed by t-test and chi-square test respectively. Multivariate Logistic regression was used to test the association between genetic frequency and disease status, with adjustments for the possible confounding variables. The haplotypes were established and their frequencies in the two groups were assessed by haploview and phase softwares. Results: All the five SNPs (rs3735713, rs3824090, rs3735714, rs3735715 and rs611419) were in Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) (P>0.05). The subjects carrying rs3735715 GG genotype had a higher NIHL risk than those carrying the GA genotype under the co-dominant model (OR=0.644, 95% CI: 0.442-0.939, P=0.022) after adjustment for height, blood pressure, drinking status and smoking status. After being stratified by CNE, in the CNE ≥ 98 dB (A) group, rs3735715 polymorphism was associated with the NIHL under the co-dominant model (OR=0.509, 95% CI: 0.281-0.923, P=0.026) after adjustment for height, blood pressure, drinking status and smoking status as well. However, no statistical significant difference was found in variant genotypes of the other SNPs between the case and control subjects. Four-locus (rs3735713, rs3824090, rs3735714 and rs3735715) haplotypes were constructed, and no risk or protective haplotypes was identified. Conclusion: It is suggested that GRHL2 polymorphisms may be associated with development of NIHL.

KEY WORDSGRHL2; Polymorphism, genetic; Hearing loss, noise-induced; Disease susceptibility

基金項目:國家自然科學基金(81372940)和國家科技支撐計劃(2014BAI12B03)資助Supported by the National Natural Science Foundation of China (81372940) and Research Fund from National Science and Technology Infrastructure Program of China (2014BAI12B03)

Corresponding author△s’ e-mail， alihe2009@126.com， yu-shanfa@163.com

[中圖分類號]R126.9

[文獻標志碼]A

[文章編號]1671-167X(2016)03-0409-05

doi:10.3969/j.issn.1671-167X.2016.03.006

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-5-1815：21：16網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.4691.R.20160518.1521.016.html