高染染劉倩孫文良孫志勇劉浩田朝光

（1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院 教育部工業(yè)發(fā)酵微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2. 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308）

粗糙脈孢菌蛋白表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建研究

高染染1，2劉倩2孫文良2孫志勇2劉浩1田朝光2

（1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院 教育部工業(yè)發(fā)酵微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2. 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308）

旨在將模式絲狀真菌粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）構(gòu)建為蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)。通過真菌雜交技術(shù)構(gòu)建出粗糙脈孢菌六突變?nèi)笔Ь闘Q-1（Δ3βG∷Δ2cbh∷Δhis3）作為蛋白表達(dá)宿主菌株。該宿主菌株可以用纖維二糖作為誘導(dǎo)物誘導(dǎo)纖維素酶啟動(dòng)子表達(dá)，同時(shí)又消除了葡萄糖苷酶蛋白的背景條帶，有利于目標(biāo)蛋白表達(dá)純化。構(gòu)建了分別含有粗糙脈孢菌自身強(qiáng)啟動(dòng)子（Pcbh-1、Pcbh-2和Ptef-1）的3個(gè)新的高效表達(dá)載體，該載體帶有融合標(biāo)簽蛋白tev-6×his-gfp，能高效方便的篩選陽性轉(zhuǎn)化子，有利于后續(xù)目標(biāo)蛋白純化。以纖維素酶GH3-4和CBH-1為例，通過重組表達(dá)菌株纖維二糖誘導(dǎo)發(fā)酵液進(jìn)行酶活測定、SDS-PAGE電泳分析和Western blotting檢測顯示，重組蛋白GH3-4-GFP和CBH-1-GFP成功進(jìn)行了表達(dá)和分泌，分泌水平分別為2.77和2.83 mg/L。Pcbh-1啟動(dòng)子重組蛋白表達(dá)水平最高，說明在纖維二糖誘導(dǎo)體系中啟動(dòng)子Pcbh-1的啟動(dòng)效率最高，初步建立了粗糙脈孢菌纖維二糖誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)表達(dá)體系。

絲狀真菌；粗糙脈孢菌；蛋白表達(dá)系統(tǒng)；纖維二糖；強(qiáng)啟動(dòng)子

蛋白質(zhì)生產(chǎn)是生物技術(shù)的重要組成部分，主要包括工業(yè)酶和蛋白質(zhì)類藥物抗體疫苗等，發(fā)展蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)研究擁有重要的戰(zhàn)略意義和巨大的市場需求［1，2］。在各種表達(dá)系統(tǒng)中，絲狀真菌蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)潛力巨大、專利前景廣闊。隨著真菌分子遺傳技術(shù)和菌種改良策略的進(jìn)步，尤其是真菌基因組學(xué)的發(fā)展，利用絲狀真菌生產(chǎn)蛋白越來越受到關(guān)注［3，4］。絲狀真菌系統(tǒng)是優(yōu)秀的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)，目前國際上40%-50%工業(yè)酶的生產(chǎn)來自絲狀真菌［5］。真菌蛋白質(zhì)表達(dá)和分泌能力是其他系統(tǒng)所無法比擬的，它作為細(xì)胞工廠可高效表達(dá)分泌胞外蛋白，具有表達(dá)量大、胞外分泌率高、蛋白質(zhì)分子折疊和修飾系統(tǒng)接近高等真核細(xì)胞等特點(diǎn)［6］。盡管絲狀真菌擁有強(qiáng)大的蛋白質(zhì)表達(dá)分泌機(jī)制，但異源的非真菌蛋白質(zhì)生產(chǎn)仍然面臨著巨大問題，主要是異源蛋白表達(dá)水平很低，經(jīng)常徘徊在每升毫克級(jí)，而且部分蛋白質(zhì)不能夠表達(dá)［5］，新的表達(dá)系統(tǒng)研究是近年來生物技術(shù)領(lǐng)域的競爭焦點(diǎn)之一［7］。

近些年來，由于任何單一菌種都不能滿足不同工業(yè)蛋白質(zhì)生產(chǎn)的需求，曲霉和木霉各有優(yōu)點(diǎn)和局限，因此更多的絲狀真菌加入到蛋白質(zhì)表達(dá)宿主菌的候選名單，包括粗糙脈孢菌Neurospora［8-10］和鐮刀霉Fusarium［11］等。粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）是研究微生物遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的模式真菌，是唯一的一個(gè)擁有基因組序列、功能基因組工具和全基因組基因敲除突變體庫的絲狀真菌［12］，同時(shí)又是天然的纖維素快速降解菌，能夠利用木糖、纖維二糖、寡糖等組分其蛋白質(zhì)分泌能力與里氏木霉的野生型菌株相仿［13，14］，并且擁有較好的遺傳學(xué)研究基礎(chǔ)，是利用分子生物學(xué)改造構(gòu)建纖維素酶生產(chǎn)菌株和生產(chǎn)其他目的蛋白的理想菌種，在分子改造方面由于具有完善的有性循環(huán)，便于轉(zhuǎn)化，雜交等遺傳操作，所以利用粗糙脈孢菌構(gòu)建蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)，在基因工程操作上具有明顯優(yōu)勢。目前已經(jīng)有開發(fā)粗糙脈孢菌作為蛋白質(zhì)表達(dá)體系的研究，其中包括表達(dá)生產(chǎn)植物蛋白、疫苗抗體和內(nèi)切葡聚糖酶等［8-10］。本研究將利用粗糙脈孢菌良好的基因組研究資源和全基因組基因敲除突變體庫，從載體和宿主改造兩方面開展研究，以初步建立纖維二糖誘導(dǎo)的粗糙脈孢菌蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 本研究所用的粗糙脈孢菌Neurospora crassa單基因突變株，野生型菌株FGSC2489和質(zhì)粒pMF272均購自美國真菌遺傳保藏中心（Fungal Genetics Stock Center，F(xiàn)GSC）。3個(gè)β-葡萄糖苷酶基因（NCU00130、NCU04952和NCU08755）缺失的三突變體菌株（3ΔβG）由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建得到，組氨酸缺陷型纖維二糖水解酶雙突變?nèi)笔Ь昙慈蛔兙軎?cbhΔhis3由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建得到。大腸桿菌（Escherichia coli）Top10購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.1.2 試劑 限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購自New England Biolabs（NEB）公司，質(zhì)粒抽提試劑盒和DNA純化回收試劑盒購自天根生物公司，寡核苷酸序列由北京金唯智公司合成。纖維二糖（cellobiose）購自Sigma公司，Brad-ford試劑購自Bio-Rad公司，對硝基苯葡萄糖苷pNPG和對硝基苯纖維二糖苷pNPC均購自Megazyme公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 產(chǎn)孢培養(yǎng)基（1 L）：1% Vogel’s鹽、20 g蔗糖和15 g瓊脂粉。

雜交培養(yǎng)基（1 L）：1% Westergaards鹽，蔗糖15 g和瓊脂15 g，調(diào)pH值至6.5。

BDES篩 選 培 養(yǎng) 基（1 L）：1% Vogel’s，1% BDES鹽溶液和瓊脂15 g，定容到950 mL，高壓滅菌，（潮霉素hph終濃度200 μg/mL，需要時(shí)添加）。

纖維二糖產(chǎn)酶培養(yǎng)基（1 L）：1×Vogel’s鹽、20 g纖維二糖和7.5 g酵母粉。

乙酸鈉產(chǎn)酶培養(yǎng)基（1 L）：1×Vogel’s鹽、20 g乙酸鈉和7.5 g酵母粉。

Vogel’s鹽（1 L）：125 g C6H5Na3O7，250 g KH2PO4，100 g NH4NO3，10 g MgSO4·7H2O，5 g CaCl2·2H2O，5 mL微量元素溶液和2.5 mL 0.1 mg/mL生物素溶液。

微量元素鹽溶液（100 mL）：一水合檸檬酸5 g，ZnSO4·7H2O 5 g，F(xiàn)e（NH4）（SO）2·6H2O 1 g，CuSO4·5H2O 0.25 g，MnSO4·H2O 0.05 g，H3BO30.05 g和Na2Mo4·2H2O 0.05 g，定容體積到100 mL。

Westergaards鹽溶液（1 L）：KNO34 g，KH2PO44 g，MgSO4·7H2O 2 g，微量元素鹽溶液4 mL和生物素（0.1 mg/mL）200 μL。

BDES鹽溶液（1 L）：山梨糖200 g，蔗糖10 g和果糖10 g，高壓滅菌。

1.2 方法

1.2.1 分生孢子的制備 將粗糙脈孢菌（N. crassa）FGSC2489（野生型WT，Mat-a），β-葡萄糖苷酶基因缺失的三突變體菌株（3ΔβG），組氨酸缺陷型纖維二糖水解酶雙突變?nèi)笔Ь辏é?cbhΔhis3）在產(chǎn)孢培養(yǎng)基上28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d后，室溫培養(yǎng)8 d。

1.2.2 真菌雜交構(gòu)建表達(dá)宿主菌株 挑取分生孢子制成孢子懸液，依據(jù)Wu等［15］的方法，菌株3ΔβG和Δ2cbhΔhis3進(jìn)行雜交，于28℃黑暗條件下培養(yǎng)2周后，將培養(yǎng)皿取出放到光照下放置1周，待子囊孢子噴射到皿蓋上，用200 μL無菌水從皿蓋上洗下孢子收集到離心管中，60℃水浴熱激45 min后涂BDES篩選培養(yǎng)基，然后挑取的單菌落到產(chǎn)孢培養(yǎng)基上，提取基因組DNA對其進(jìn)行PCR鑒定（引物如表1所示），獲得的六突變宿主菌株（Δ3βG∷Δ2cbh∷Δhis3）。

表1 擴(kuò)增靶序列引物

1.2.3 表達(dá)載體的構(gòu)建 含有ccg-1強(qiáng)啟動(dòng)子的pMF272作為骨架質(zhì)粒，帶有tev基因、綠色熒光蛋白gfp和his6標(biāo)簽的融合蛋白tev-6×his-gfp由北京金唯智公司合成，并連接至Pac I和EcoR I酶切線性化的pMF272質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到Top10感受態(tài)細(xì)胞中，挑選陽性克隆送到北京金唯智公司測序，測序正確的質(zhì)粒命名為Pccg1-THG。以野生型粗糙脈孢菌WT（FGSC 2489）的基因組DNA為模板，PCR分別擴(kuò)增NCU02003（翻譯延長因子eEF-1，translation elongation factor eEF-1）、NCU07340（纖維二糖水解酶CBH1基因）、和NCU09680（纖維二糖水解酶CBH2基因）上游1.0 kb的啟動(dòng)子（引物見表1），將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化并連接至Not I和Xba I酶切線性化的質(zhì)粒Pccg1-THG，轉(zhuǎn)化到Top10感受態(tài)細(xì)胞中，挑選陽性克隆測序，測序正確的重組質(zhì)粒分別命名為Ptef1-THG、Pcbh1-THG和Pcbh2-THG。

以野生型粗糙脈孢菌WT的基因組DNA為模板，PCR分別擴(kuò)增NCU04952（β-葡萄糖苷酶GH3-4）和NCU07340（纖維二糖水解酶CBH1）基因的ORF，（引物如表1所示）擴(kuò)增產(chǎn)物純化并分別連接至Pac I和Xba I酶切線性化的質(zhì)粒Pccg1-THG、Ptef1-THG、Pcbh1-THG和Pcbh2-THG，轉(zhuǎn)化到Top10感受態(tài)細(xì)胞中，挑選陽性克隆測序，測序正確的質(zhì)粒命名為Pccg1-GH3-4-THG、Pccg1-CBH1-THG、Ptef1-GH3-4-THG、Ptef1-CBH1-THG、Pcbh1-GH3-4-THG、Pcbh1-CBH1-THG、Pcbh1-GH3-4-THG和Pcbh1-CBH1-THG。

1.2.4 電轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主并篩選出陽性轉(zhuǎn)化子 以粗糙脈孢菌六突變菌株（Δ3βG∷Δ2cbh∷Δhis3）菌株為受體菌，依據(jù)Margolin等［16］的方法，將1.2.3構(gòu)建的質(zhì)粒通過電穿孔的方法轉(zhuǎn)化進(jìn)入受體菌中，通過組氨酸表型進(jìn)行轉(zhuǎn)化子篩選，對篩選出的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行熒光顯微鏡下觀察菌絲GFP，從而篩選出GFP表達(dá)最強(qiáng)的陽性轉(zhuǎn)化子。

1.2.5 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 含有ccg-1強(qiáng)啟動(dòng)子的重組菌株孢子接種終濃度為106個(gè)/mL，乙酸鈉產(chǎn)酶培養(yǎng)基裝液量為100 mL培養(yǎng)基/250 mL三角瓶，25℃搖床200 r/min光照培養(yǎng)3 d。依據(jù)Znameroski等［17］的方法，含有tef1、cbh1和cbh2強(qiáng)啟動(dòng)子的重組菌株孢子接種終濃度為106個(gè)/mL，纖維二糖產(chǎn)酶培養(yǎng)基裝液量為100 mL培養(yǎng)基/250 mL三角瓶，25℃搖床200 r/min光照培養(yǎng)3 d。發(fā)酵上清液蛋白濃度采用Bradford法測定，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，同時(shí)進(jìn)行SDSPAGE電泳檢測蛋白表達(dá)情況。上清液用Western blot檢測重組融合蛋白GH3-4-GFP 和 CBH1-GFP，所用一抗為GFP-Tag鼠單克隆抗體，二抗為羊抗鼠IgG-HRP抗體。

1.2.6 酶活測定 β-葡萄糖苷酶酶活測定：發(fā)酵液用檸檬酸鈉緩沖液（0.05 mol/L，pH4.8）稀釋至合適濃度，取250 μL稀釋發(fā)酵液置于50℃水浴鍋中預(yù)熱5 min，取250 μL對硝基苯葡萄糖苷（p-nitrophenylβ-D-glucoside，pNPG，1 mg/mL）底物同樣預(yù)熱5 min后將兩者混勻，置于50℃水浴鍋中反應(yīng)10 min后迅速加入500 μL濃度為1 mol/L的碳酸鈉溶液終止反應(yīng)，置于冰上，OD420測定吸光度值?？瞻讓φ詹捎脺缁畹陌l(fā)酵液。3個(gè)平行樣品取平均值。

外切纖維素酶酶活測定：發(fā)酵液用檸檬酸鈉緩沖液（0.05 mol/L，pH4.8）稀釋至合適濃度，取250 μL稀釋發(fā)酵液置于50℃水浴鍋中預(yù)熱5 min，取250 μL對硝基苯纖維二糖苷（p-nitrophenyl-β-D-cellubioside，pNPC，1 mg/mL）底物同樣預(yù)熱5 min后將兩者混勻，置于50℃水浴鍋中反應(yīng)10 min后迅速加入500 μL濃度為1 mol/L的碳酸鈉溶液終止反應(yīng)，置于冰上，OD420測定吸光度值?？瞻讓φ詹捎脺缁畹陌l(fā)酵液。3個(gè)平行樣品取平均值。

1.2.7 重組蛋白的分離純化 對發(fā)酵液中的GH3-4-GFP和CBH1-GFP 融合蛋白表達(dá)產(chǎn)物的進(jìn)行純化，取誘導(dǎo)3 d的發(fā)酵液于4℃，12 000×g 離心30 min，收集上清進(jìn)行50 kD超濾濃縮，取蛋白濃縮液參照Qiagen公司的Ni-NTA Matric操作手冊進(jìn)行純化。用buffer A（20 mmol/L NaH2PO4，500 mmol/L NaCl和20 mmol/L imidazole，pH7.4）平衡柱子，樣品以1 mL/min的流速流穿Ni-NTA純化柱，然后用buffer B（20 mmol/L sodium phosphate，500 mmol/L NaCl 和500 mmol/L imidazole pH7.4）進(jìn)行梯度洗脫，紫外檢測儀監(jiān)控，收集各洗脫峰，SDS-PAGE進(jìn)行檢測，將上述經(jīng)Ni-NTA層析純化后的樣品用Sephadex G-10 層析介質(zhì)進(jìn)行脫鹽處理，用0.05 mol/L的醋酸銨緩沖液洗脫Sephadex G-10層析柱，洗脫速度為2 mL/min，收集洗脫峰。將經(jīng)脫鹽處理的蛋白樣品參照上海索萊寶生物科技有限公司TEV蛋白酶操作手冊進(jìn)行tev-6×his-gfp的切割，蛋白上清液30℃反應(yīng)6 h后，于4℃，12 000×g 離心30 min，收集上清進(jìn)行50 kD超濾濃縮從而去除6×his-gfp標(biāo)簽。

1.2.8 酶特性分析

1.2.8.1 溫度和酸堿度對酶活力的影響 分別在40、50、60、70、80和90℃下測定酶活，計(jì)算各反應(yīng)溫度與最適溫度下酶活的百分比值，作為相對酶活。測定最適pH時(shí)，所用底物分別以pH3-12的緩沖液配置，同理計(jì)算相對酶活。

1.2.8.2 酸堿度和熱穩(wěn)定性測定 將酶液分別在pH 3.0-12.0，40、50、60、70、80和90℃下處理10 min后，立即冰浴，然后在最適反應(yīng)溫度和最適pH下測定酶活。

1.2.8.3 金屬離子和螯合劑的影響 在最適pH與最適溫度下，分別測定在10 mmol/L不同金屬離子 溶 液（NaCl、KCl、LiCl、CaCl2、CoCl2、NiSO4、CuSO4、MgSO4、ZnSO4和FeCl3）或金屬螯合劑SDS，β-mercaptoethanol和EDTA濃度下的酶活，計(jì)算相對酶活。

1.2.8.4 底物專一性 分別以1 mg/mL pNPG，pNPC，p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside（pNPX；Sigma-Aldrich）or p-nitrophenyl-α-L-arabinofuranoside（pNPA；Sigma-Aldrich）作底物，在最適pH與最適溫度下測定酶活，計(jì)算相對酶活。

2 結(jié)果

2.1 蛋白表達(dá)宿主菌的構(gòu)建

前期研究表明，敲除主要的3個(gè)β-葡萄糖苷酶后，粗糙脈孢菌可以在纖維二糖誘導(dǎo)條件下，誘導(dǎo)纖維素酶基因的表達(dá)。本研究利用這一特點(diǎn)，開展蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建，使目標(biāo)蛋白可以被纖維二糖顯著誘導(dǎo)表達(dá)。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，首先構(gòu)建出敲除3個(gè)主要β-葡萄糖苷酶的缺失菌株3ΔβG，為了減少主要纖維素酶對目標(biāo)蛋白表達(dá)和后期純化干擾，敲除主要分泌的纖維素酶CBH1和CBH2。為了方便篩選，將組氨酸營養(yǎng)缺陷his3也整合進(jìn)來，最終構(gòu)建了六突變菌株（Δ3βG∷Δ2cbh∷Δhis3），命名為LQ-1。

根據(jù)文獻(xiàn)［15］中的方法對六突變菌株進(jìn)行PCR鑒定，并對其蛋白分泌情況進(jìn)行了分析。將野生型粗糙脈孢菌WT（FGSC 2489）、β-葡萄糖苷酶缺失的三突變體菌株（3ΔβG）和六突變菌株LQ-1（Δ3βG∷Δ2cbh∷Δhis3）在2%纖維二糖產(chǎn)酶培養(yǎng)基中200 r/min，25℃振蕩培養(yǎng)3 d，對其上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達(dá)情況。結(jié)果（圖1）顯示，在纖維二糖誘導(dǎo)條件三突變體菌株（3ΔβG）分泌的纖維二糖水解酶CBH1和CBH2蛋白條帶顯著增粗，表明3ΔβG菌株在纖維二糖（CB）培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，纖維二糖水解酶CBH1和CBH2表達(dá)量明顯提高，該檢測結(jié)果與文獻(xiàn)［17］報(bào)道的一致，確認(rèn)纖維二糖為粗糙脈孢菌產(chǎn)纖維素酶的誘導(dǎo)物，而在六突變菌株（Δ3βG∷Δ2cbh∷Δhis3）中由于缺少CBH1和CBH2基因，因此未檢測到CBH1和CBH2蛋白，其分泌蛋白的總量也顯著減少。觀察野生型、三突變體菌株（3ΔβG）和六突變菌株（Δ3βG∷Δ2cbh∷Δhis3）培養(yǎng)基上的生長情況發(fā)現(xiàn)，六突變體菌株生長較慢菌絲較稀疏（圖 1），構(gòu)建的六突變體具有低分泌蛋白的背景，用來作為重組蛋白表達(dá)的宿主菌株。

圖1 蛋白表達(dá)宿主菌株的構(gòu)建

2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建

強(qiáng)啟動(dòng)子是絲狀真菌體內(nèi)高效表達(dá)基因的關(guān)鍵所在。從粗糙脈孢菌的數(shù)字基因表達(dá)譜測序中，發(fā)現(xiàn)了3個(gè)在不同纖維素誘導(dǎo)條件下都高效表達(dá)的基因，分別是NCU02003（翻譯延長因子eEF-1，translation elongation factor eEF-1）、NCU07340（纖維二糖水解酶CBH1基因）和NCU09680（纖維二糖水解酶CBH2基因），選擇其上游1.0 kb作為啟動(dòng)子。粗糙脈孢菌常用強(qiáng)啟動(dòng)子ccg-1（可以被乙酸鈉顯著誘導(dǎo)）被選為對照進(jìn)行后續(xù)表達(dá)研究。以pMF272為骨架，按照材料與方法中所述的過程，在待表達(dá)的目的基因C端添加融合標(biāo)簽tev-6×his-gfp，構(gòu)建了4個(gè)用于粗糙脈孢菌重組蛋白表達(dá)的載體（圖 2-A）。

2.3 N. crassa陽性轉(zhuǎn)化子的篩選

利用六突變宿主株LQ-1基因缺失特性，選取粗糙脈孢菌兩個(gè)分泌型蛋白（GH3-4和CBH-1）作為測試對象，研究重組蛋白表達(dá)分泌情況。將目標(biāo)蛋白基因通過同源重組定點(diǎn)導(dǎo)入到his3位點(diǎn)上，對成功回補(bǔ)組氨酸缺陷的轉(zhuǎn)化子再進(jìn)行熒光顯微鏡觀察，篩選出表達(dá)綠色熒光蛋白的陽性轉(zhuǎn)化子。將含有強(qiáng)啟動(dòng)子ccg-1的轉(zhuǎn)化子于乙酸鈉產(chǎn)酶培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，將含有強(qiáng)啟動(dòng)子Ptef1、Pcbh1和Pcbh2的轉(zhuǎn)化子于纖維二糖產(chǎn)酶培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，48 h后進(jìn)行觀察轉(zhuǎn)化子的菌絲中表達(dá)綠色熒光蛋白情況。通過進(jìn)行熒光顯微鏡（圖2）的觀察，發(fā)現(xiàn)獲得的轉(zhuǎn)化子具有強(qiáng)烈的綠色熒光，融合蛋白GH3-4-GFP和CBH-1-GFP均已經(jīng)成功在轉(zhuǎn)化子中表達(dá)（圖2），以上結(jié)果說明這3個(gè)啟動(dòng)子在纖維二糖誘導(dǎo)條件下具有很強(qiáng)的啟動(dòng)能力，可用于蛋白的過量表達(dá)，可以利用纖維二糖誘導(dǎo)體系發(fā)展粗糙脈孢菌蛋白表達(dá)系統(tǒng)。

圖2 不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的融合蛋白GH3-4-GFP和CBH-1-GFP在粗糙脈孢菌菌絲中的表達(dá)

2.4 重組蛋白GH3-4和CBH-1的表達(dá)和純化

含有融合蛋白GH3-4-GFP和CBH-1-GFP的陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)，3 d后對其發(fā)酵的上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析和Western blot檢測分析。結(jié)果（圖3-A）顯示，融合蛋白GH3-4-GFP和CBH-1-GFP的大小約110和100 kD。以空載體pMF272轉(zhuǎn)入宿主菌株作為陰性對照，未發(fā)現(xiàn)該融合蛋白。對上清液中分泌的融合蛋白進(jìn)行Western檢測分析，抗體為GFP-Tag標(biāo)簽，結(jié)果（圖3-B）顯示融合蛋白GH3-4-GFP和CBH-1-GFP成功表達(dá)，且分子大小與SDS-PAGE電泳分析結(jié)果一致。含有表達(dá)盒Pccg1-GH3-4-GFP、Ptef1-GH3-4-GFP、Pcbh1-GH3-4-GFP和Pcbh2-GH3-4-GFP的轉(zhuǎn)化子，分泌的GH3-4-GFP蛋 白 分 別 為2.22（±0.08）、2.87（±0.05）、3.01（±0.06）和2.98（±0.08）mg/L。含有 表 達(dá) 盒Pccg1-CBH-1-GFP、Ptef1-CBH-1-GFP、Pcbh1-CBH-1-GFP和Pcbh2-CBH-1-GFP的陽性轉(zhuǎn)化子，融合GH3-4-GFP蛋白的分泌水平分別為2.38（±0.02）、2.92（±0.05）、3.04（±0.08）和2.99（± 0.06）mg/L。融合蛋白的誘導(dǎo)上清液通過Ni-NTA親和層析進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定（圖 3-C）后，最終獲得110 kD和100 kD的GH3-4-GFP和CBH-1-GFP純化樣品，該純化樣品通過TEV蛋白酶進(jìn)行tev-6×his-gfp的切割，最終獲得最75 kD和70 kD的GH3-4和CBH-1純化樣品（圖 3-C）。蛋白表達(dá)水平表明，本研究構(gòu)建的纖維二糖誘導(dǎo)體系的蛋白表達(dá)全部超過目前粗糙脈孢菌最常用的強(qiáng)啟動(dòng)子ccg1。

圖3 SDS-PAGE電泳和Western blotting檢測分析

2.5 重組蛋白GH3-4和CBH-1的酶特性分析

對純化樣品進(jìn)行酶學(xué)特性分析，GH3-4蛋白樣品對pNPG表現(xiàn)很強(qiáng)的底物專一性，對pNPC、pNPX和pNPA幾乎沒有任何反應(yīng)。CBH-1蛋白樣品對pNPC表現(xiàn)很強(qiáng)的底物專一性，對pNPG、pNPX和pNPA幾乎沒有任何反應(yīng)。GH3-4 和CBH-1最適反應(yīng)溫度均為60℃，最適反應(yīng)均為pH4.8（圖 4）。熱穩(wěn)定性分析結(jié)果（圖4-A，圖4-C）顯示，經(jīng)40-60℃的熱處理后，GH3-4和CBH-1都可以保留50%以上的酶活力，70℃時(shí)的酶活在20%，當(dāng)在溫度大于70℃時(shí)的酶活急劇下降。pH穩(wěn)定性分析結(jié)果（圖4-B和4-D）顯示，在pH4.5-6.0范圍內(nèi)，GH3-4有50%及以上的酶活力，高于或低于此pH值酶活均呈下降趨勢，CBH-1的酸堿度穩(wěn)定性高于GH3-4，CBH-1在pH3.0-9.0都可以保留50%以上的酶活力，在pH10.0時(shí)酶活性還有20%。

各種化學(xué)試劑及離子的對GH3-4和CBH-1的影響（表2）顯示，鈉離子、鉀離子、鋰離子和鋅離子對該酶的活性無顯著影響，而鈣離子、鈷離子和銅離子對其酶活性則有顯著抑制作用，鎳離子和金屬螯合劑EDTA對酶活有輕微的抑制作用，鐵離子和SDS對酶活抑制影響最大，10 mmol/L鐵離子濃度就能抑制GH3-4酶活的90%以上和CBH-1酶活的70%以上，SDS能抑制GH3-4 和CBH-1酶活50%以上。β-mercaptoethanol對酶活有促進(jìn)作用，可以提高酶活20%左右。

圖4 溫度和pH值對GH3-4（A和B）和CBH-1（C和D）的影響

表2 不同金屬離子對酶的活性分析

3 討論

絲狀真菌由于其擁有強(qiáng)大的蛋白質(zhì)表達(dá)分泌能力，已經(jīng)有多個(gè)菌種發(fā)展成為蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)［3-5］。但是，由于目標(biāo)蛋白千差萬別，任何單一菌種都不能滿足所有蛋白質(zhì)生產(chǎn)的需求，如曲霉和木霉各有優(yōu)點(diǎn)和局限，因此近年來，有更多的絲狀真菌加入到蛋白質(zhì)表達(dá)宿主菌的候選名單，需要深入研究開發(fā)新蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)。粗糙脈孢菌具有良好的外源蛋白表達(dá)分泌能力，并且擁有很好的遺傳學(xué)研究基礎(chǔ)和基因組數(shù)據(jù)，目前已經(jīng)有開發(fā)粗糙脈孢菌作為蛋白質(zhì)表達(dá)體系的研究，包括表達(dá)生產(chǎn)植物蛋白、疫苗抗體和內(nèi)切葡聚糖酶等［8-10］，這些研究表明粗糙脈孢菌是發(fā)展新型異源蛋白表達(dá)的良好體系，具有較大的潛力。本研究從模式絲狀真菌粗糙脈孢菌出發(fā)，通過真菌雜交的方法構(gòu)建了蛋白質(zhì)表達(dá)分泌的六突變宿主菌，利用基因工程技術(shù)構(gòu)建3個(gè)新的誘導(dǎo)型高表達(dá)載體，利用纖維二糖可作為表達(dá)誘導(dǎo)物，初步建立了粗糙脈孢菌蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)。

近年來，隨著真菌分子遺傳技術(shù)和菌株改良策略的提高，研究者進(jìn)行了多方面的努力，使得絲狀真菌表達(dá)分泌異源蛋白的產(chǎn)量得到提高。蛋白質(zhì)生產(chǎn)首先是在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)，為了提高蛋白的表達(dá)量和分泌量，選擇以絲狀真菌自身的強(qiáng)啟動(dòng)子構(gòu)建表達(dá)盒來表達(dá)重組蛋白。因此，本研究的目的之一是挖掘和識(shí)別強(qiáng)啟動(dòng)子來實(shí)現(xiàn)對重組蛋白表達(dá)的調(diào)控。在粗糙脈孢菌中，報(bào)道使用最多的是生物鐘控制基因（clock controlled protein，ccg-1）［18］和丙酮酸脫羧酶（pyruvate decarboxylase，cfp）的啟動(dòng)子［19］。纖維二糖水解酶I強(qiáng)啟動(dòng)子（Pcbh-1）和纖維二糖水解酶II強(qiáng)啟動(dòng)子（Pcbh-2）雖然常常在T. reesei的表達(dá)系統(tǒng)中被報(bào)道使用［20-23］，但是在目前已知的粗糙脈孢菌的表達(dá)系統(tǒng)中尚未被報(bào)道使用。此外，通過對本實(shí)驗(yàn)室數(shù)字基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄譜的分析比較（數(shù)據(jù)尚未發(fā)表），發(fā)現(xiàn)基因NCU02003（translation elongation factor eEF-1）在不同碳源培養(yǎng)條件下都具有很高的表達(dá)水平。因此，本研究以基因cbh-1、cbh-2和tef-1的強(qiáng)啟動(dòng)子構(gòu)建了表達(dá)載體，我們發(fā)現(xiàn)這3個(gè)啟動(dòng)子在粗糙脈孢菌纖維二糖條件下均能高效的表達(dá)目的基因，而且全部超過了最常用的啟動(dòng)子ccg1在乙酸鈉誘導(dǎo)條件下的表達(dá)水平。

其次，高效表達(dá)宿主是建立成功的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的關(guān)鍵因素之一。最近研究發(fā)現(xiàn)，3個(gè)主要的β-葡萄糖苷酶缺失的三突變體菌株（3ΔβG），該突變體能夠以纖維二糖為誘導(dǎo)物顯著表達(dá)和分泌纖維二糖水解酶CBH1和CBH2［17］。纖維二糖作為誘導(dǎo)物成本上比現(xiàn)有槐糖誘導(dǎo)物低，纖維二糖是可溶物，誘導(dǎo)纖維素酶表達(dá)生產(chǎn)優(yōu)于晶體纖維素等固體誘導(dǎo)物，如在纖維素酶和目標(biāo)蛋白的分離純化工藝。我們以3ΔβG為出發(fā)菌株，通過真菌雜交進(jìn)一步缺失了兩個(gè)纖維二糖水解酶CBH1和CBH2，構(gòu)建了組氨酸缺陷型的六突變菌株LQ-1（Δ3βG∷Δ2cbh∷Δhis3），該菌株作為表達(dá)宿主，可以用纖維二糖為誘導(dǎo)底物誘導(dǎo)產(chǎn)生纖維素酶，同時(shí)又能消除纖維二糖水解酶蛋白的背景條帶，為粗糙脈孢菌蛋白表達(dá)系統(tǒng)的成功構(gòu)建提供了良好的受體菌株，有利于目標(biāo)蛋白純化。我們以兩個(gè)纖維素酶GH3-4和CBH-1為目標(biāo)蛋白，與帶有tev基因、綠色熒光蛋白gfp和his6的標(biāo)簽蛋白（tev-6×his-gfp）進(jìn)行融合，利用纖維二糖作為誘導(dǎo)物，融合蛋白在本研究構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)。通過組氨酸缺陷表型和報(bào)告基因gfp的熒光顯微鏡的觀察，本研究建立了高效方便的陽性轉(zhuǎn)化子鑒定體系。通過發(fā)酵上清液進(jìn)行酶活力的測定、SDS-PAGE電泳分析和Western blot檢測，表明融合蛋白成功進(jìn)行了表達(dá)和分泌，本研究初步建立了粗糙脈孢菌纖維二糖誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的表達(dá)系統(tǒng)。GH3-4和CBH-1的酶特性分析，顯示它們具有相同的最適反應(yīng)溫度、pH值和熱穩(wěn)定性，其中CBH-1酶活力有廣泛穩(wěn)定的pH耐受值，這可能會(huì)對未來堿性纖維素酶的應(yīng)用發(fā)展提供參考。

同三突變體菌株（3ΔβG）分泌的總蛋白量相比較，陽性轉(zhuǎn)化菌株重組蛋白的分泌水平相對較低，而通過熒光顯微鏡觀察顯示其轉(zhuǎn)錄水平卻很高，收集完上清液后，胞內(nèi)菌絲依然能觀察到大量的綠色熒光，這種現(xiàn)象表明了其重組蛋白產(chǎn)量低的瓶頸發(fā)生在分泌途徑。分泌途徑是胞外蛋白生產(chǎn)的關(guān)鍵，絲狀真菌中囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)和蛋白分泌途徑可能是蛋白生產(chǎn)的瓶頸所在，同時(shí)也是具有潛在的可提高分泌生產(chǎn)能力的機(jī)制［24，25］。我們下一步將針對這一瓶頸，在本研究已經(jīng)初步建成的粗糙脈孢菌表達(dá)體系中進(jìn)一步提高靶蛋白的分泌水平。

4 結(jié)論

本研究從粗糙脈孢菌出發(fā)，構(gòu)建了纖維二糖誘導(dǎo)的重組蛋白表達(dá)體系，包括表達(dá)宿主六突變菌株LQ-1（Δ3βG∷Δ2cbh∷Δhis3）和3個(gè)含不同強(qiáng)啟動(dòng)子的高效表達(dá)載體。以兩個(gè)纖維素酶GH3-4和CBH-1為例，該系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)重組蛋白的有效表達(dá)分泌，為重組蛋白質(zhì)的表達(dá)提供了一個(gè)新的技術(shù)體系。

［1］林章凜, 李爽. 工業(yè)酶-制備與應(yīng)用. 工業(yè)生物技術(shù)譯著系列［M］. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社, 2006.

［2］馬延和. 生物煉制-工業(yè)過程與產(chǎn)品. 工業(yè)生物技術(shù)譯著系列［M］. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社, 2007.

［3］Nevalainen KM, Te’o VS, Bergquist PL. Heterologous protein expression in filamentous fungi［J］. Trends in Biotechnology, 2005, 23（9）：468-474.

［4］Conesa A, Punt PJ, van Luijk N, et al. The secretion pathway in filamentous fungi：a biotechnological view［J］. Fungal Genet Biol, 2001, 33（3）：155-171.

［5］Ward OP. Production of recombinant proteins by filamentous fungi［J］. Biotechnol Adv, 2012, 30（5）：1119-1139.

［6］Yaver DS, Lamsa M, Munds R, et al. Using DNA-tagged mutagenesis to improve heterologous protein production in Aspergillus oryzae［J］. Fungal Genet Biol, 2000, 29（1）：28-37.

［7］鐘耀華, 王曉利, 汪天虹. 絲狀真菌高效表達(dá)異源蛋白研究進(jìn)展［J］. 生物工程學(xué)報(bào), 2008, 24（4）：531-540.

［8］Rasmussen-Wilson SJ, Palas JS, Wolf VJ, et al. Expression of a plant protein by Neurospora crassa［J］. Appl Environ Microbiol, 1997, 63（9）：3488-3493.

［9］Allgaier S, Weilan N, Hamad I, et al. Expression of ribonuclease A and ribonuclease N-1 in the filamentous fungus Neurospora crassa［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 85（4）：1041-1049.

［10］Allgaier S, Taylor RD, Brudnaya Y, et al. Vaccine production in Neurospora crassa［J］. Biologicals, 2009, 37（3）：128-132.

［11］Royer JC, Moyer DL, Reiwitch, SG, et al. Fusarium-Graminearuma-3/5 as a novel host for heterologous protein production［J］. Nat Biotechnol, 1995, 13：1479-1483.

［12］Borkovich, KA, Alex LA, Yarden O, et al. Lessons from the genome sequence of Neurospora crassa：tracing the path from genomic blueprint to multicellular organism［J］. Microbiol Mol Biol Rev, 2004, 68（1）：1-108.

［13］Znameroski EA, Glass NL. Using a model filamentous fungus to unravel mechanisms of lignocellulose deconstruction［J］. Biotechnol Biofuels, 2013, 6：6.

［14］Tian C, Beeson WT, Iavarone AT, et al. Systems analysis of plant cell wall degradation by the model filamentous fungus Neurospora crassa［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106（52）：22157-22162.

［15］Wu WH, Hildebrand A, Kasuga T, et al. Direct cellobiose production from cellulose using sextuple beta-glucosidase gene deletion Neurospora crassa mutants［J］. Enzyme Microb Technol, 2013, 52（3）：184-189.

［16］Margolin BS, Freitag M, Selker EU. Improved plasmids for gene targeting at the his-3 locus of Neurospora crassa by electroporation［J］. Fungal Genet Newsl, 1997, 44：34-36.

［17］Znameroski EA, Coradetti ST, Roche CM, et al. Induction of lignocellulose-degrading enzymes in Neurospora crassa by cellodextrins［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109（16）：6012-6017.

［18］Freitag M, Hickey PC, Raju NB, et al. GFP as a tool to analyze the organization, dynamics and function of nuclei and microtubules in Neurospora crassa［J］. Fungal Genet Biol, 2004, 41（10）：897-910.

［19］Temporini ED, Alvarez ME, Mautino MR, et al. The Neurospora crassa cfp promoter drives a carbon source-dependent expression of transgenes in filamentous fungi［J］. J Appl Microbiol, 2004, 96（6）：1256-1264.

［20］Margolles-Clark E, Harman GE, Penttila M. Enhanced expression of endochitinase in Trichoderma harzianum with the cbh1 promoter of Trichoderma reesei［J］. Appl Environ Microbiol, 1996, 62（6）：2152-2155.

［21］Zou G, Shi S, Jiang Y, et al. Construction of a cellulase hyperexpression system in Trichoderma reesei by promoter and enzyme engineering［J］. Microb Cell Fact, 2013, 11：21.

［22］Zhong YH, Liu X, Xiao P, et al. Expression and secretion of the human erythropoietin using an optimized cbh1 promoter and the native CBH I signal sequence in the industrial fungus Trichoderma reesei［J］. Appl Biochem Biotechnol, 2011, 165（5）：1169-1177.

［23］Zhang JW, Zhong YH, Zhao XN, et al. Development of the cellulolytic fungus Trichoderma reesei strain with enhanced beta-glucosidase and filter paper activity using strong artifical cellobiohydrolase 1 promoter［J］. Bioresour Technol, 2010, 101（24）：9815-9818.

［24］Saloheimo M, Pakula TM. The cargo and the transport system：secreted proteins and protein secretion in Trichoderma reesei（Hypocrea jecorina）［J］. Microbiology, 2012, 158：46-57.

［25］Fleibner A, Dersch P. Expression and export：recombinant protein production systems for Aspergillus［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 87（4）：1255-1270.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Construction of a Recombinant Protein Expression System in Neurospora crassa

GAO Ran-ran1，2LIU Qian2SUN Wen-liang2SUN Zhi-yong2LIU Hao1TIAN Chao-guang2
（1. Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457；2. Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology，Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308）

To demonstrate the potential of the model filamentous fungus Neurospora crassa as a recombinant protein expression system，we used fungal hybrid technology to develop a sextuple gene disruptant LQ-1（Δ3βG∷Δ2cbh∷Δhis3）of it as the host strain of expressing the protein. The cellobiose was used to induce the expression of cellulase promoter in host strain，which removed the background band of glucosaccharase and was conducive to the expression and purification of target protein. We constructed 3 new efficiently-expressed vectors respectively consisting of its own strong inducible promoters（Pcbh-1，Pcbh-2 and Ptef-1）from N. crassa. Those vectors had fusion tag protein tev-6×his-gfp and efficiently and conveniently screened positive transformants，which was favourable for the purification of later target protein. Two endogenous cellulase（GH3-4 and CBH-1）were chosen as test proteins for recombinant expression. Then enzymatic activity measured by cellobiose-induced fermentation broth of recombinant strain，SDS-PAGE analysis，and Western blotting indicated that the recombinant proteins GH3-4-GFP and CBH-1-GFP were successfully expressed with secreted levels reaching as high as approximate 2.77 and 2.83 mg/L. The expression of recombinant protein with Pcbh-1 promoter was the highest，suggesting that promoting efficiency of Pcbh-1 in the cellobioseinduced system was the highest，and a protein expression system in cellobiose-induced N. crassa was preliminarily constructed.

filamentous fungi；Neurospora crassa；recombinant protein expression system；cellobiose；strong inducible promoters

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.024

2015-11-05

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（“863”計(jì)劃）（SS2012AA023303）

高染染，女，研究方向：微生物功能基因組學(xué)；E-mail：ranrangao13@163.com

田朝光，男，博士，研究員，研究方向：微生物功能基因組學(xué)；E-mail：tian_cg@tib.cas.cn