高慶華胡美榮吳芳彤陶勇王云鵬羅同陽(yáng)胡常英

（1. 河北省微生物研究所，保定 071051；2. 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，北京 100101）

點(diǎn)青霉葡萄糖氧化酶基因的克隆及其酶學(xué)性質(zhì)研究

高慶華1胡美榮2吳芳彤1陶勇2王云鵬1羅同陽(yáng)1胡常英1

（1. 河北省微生物研究所，保定 071051；2. 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，北京 100101）

旨在克隆點(diǎn)青霉菌（Penicillium notatum）中的葡萄糖氧化酶基因（GOD），在畢赤酵母（Phchia pastoris）中異源表達(dá)，純化并研究其酶學(xué)性質(zhì)。利用PCR技術(shù)從點(diǎn)青霉 No.8312菌株的基因組 DNA中克隆得到 GOD基因，將該基因克隆到穿梭載體pMD-AOX上并在畢赤酵母X33中表達(dá)，對(duì)純化后的葡萄糖氧化酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，X33-GOD可高表達(dá)具有活性的GOD，在30℃、pH6.5的條件下，其培養(yǎng)液上清GOD酶活可達(dá)496 U/mL，比活123.0 U/mg；重組表達(dá)的葡萄糖氧化酶最適溫度為40-45℃，最適pH為6.0，酶的穩(wěn)定性研究表明，該酶在pH3.5-7.0區(qū)間和溫度低于50℃下穩(wěn)定。1 mmol/L Zn2+對(duì)其有激活作用；Ag+對(duì)該酶活性有較大抑制作用。構(gòu)建出GOD的高產(chǎn)畢赤酵母工程菌株，與點(diǎn)青霉GOD相比，具有更高的發(fā)酵酶活和比活。

葡萄糖氧化酶；點(diǎn)青霉菌；重組表達(dá)

葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，EC 1.1.3.4，簡(jiǎn)稱(chēng)GOD）是氧化-還原酶類(lèi)的典型代表，能夠在氧氣存在時(shí)專(zhuān)一催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和過(guò)氧化氫。因其氧化反應(yīng)生成過(guò)氧化氫，在實(shí)際應(yīng)用中葡萄糖氧化酶被用作抗菌劑。另外，葡萄糖氧化酶作為生物催化劑常用于臨床診斷、食品和飲料保鮮［1］；葡萄糖氧化酶作為酶電極還可用于生物傳感器領(lǐng)域［2］。

葡萄糖氧化酶廣泛分布于動(dòng)植物及微生物體內(nèi)。研究及生產(chǎn)葡萄糖氧化酶的主要菌株為黑曲霉（Abperrillus niger）和點(diǎn)青霉（Penicillium notatum），這是因?yàn)槊咕a(chǎn)酶能力強(qiáng)，易于規(guī)?；?；但黑曲霉和青霉菌發(fā)酵生產(chǎn)GOD過(guò)程中，過(guò)氧化氫酶、纖維素酶及淀粉酶等大量雜酶的存在給純化帶來(lái)相當(dāng)大的困難［3］。

重組葡萄糖氧化酶基因進(jìn)行異源表達(dá)可有效地解決這些問(wèn)題［4，5］。尤其是畢赤酵母表達(dá)外源蛋白具有表達(dá)量高、穩(wěn)定性好、培養(yǎng)成本低和產(chǎn)物易分離純化等優(yōu)點(diǎn)，適于大體積高密度連續(xù)發(fā)酵，具有強(qiáng)且易控的醇氧化酶（Alcohol oxidase，AOX）啟動(dòng)子等優(yōu)點(diǎn)［6］，可嚴(yán)格控制外源基因的表達(dá)［7］。

近年來(lái)，河北省微生物研究所對(duì)保存的青霉屬的點(diǎn)青霉No.8312菌株，采用紫外線(xiàn)誘變方法處理，篩選到了產(chǎn)酶較高菌株，本研究從點(diǎn)青霉菌中克隆得到葡萄糖氧化酶基因，并將其構(gòu)建在 pMD-AOX載體上，轉(zhuǎn)化畢赤酵母X33，進(jìn)行點(diǎn)青霉菌的GOD基因?qū)崿F(xiàn)異源高效表達(dá)。同時(shí)，對(duì)重組表達(dá)的葡萄糖氧化酶進(jìn)行純化，并對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 點(diǎn)青霉Penicillium notatum菌株和Escherichia coli DH5α菌株由河北省微生物研究所保存。畢赤酵母Pichia pastoris X33由中科院微生物所饋贈(zèng)。畢赤酵母表達(dá)載體 pMD-AOX（含AOX強(qiáng)啟動(dòng)子和終止子，G418抗性基因）為中科院微生物所構(gòu)建。

1.1.2 主要試劑 限制內(nèi)切酶Not I、Pme I和EcoR I以及Q5 DNA聚合酶為NEB公司產(chǎn)品；鄰聯(lián)茴香胺、辣根過(guò)氧化物酶、牛血清白蛋白等購(gòu)自Sigma公司；蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒為上海生工公司產(chǎn)品；DNA Marker和蛋白Marker 購(gòu)于Fermentas 公司；其他均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。真菌基因組提取試劑盒購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、普通DNA 回收試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)于天根生化科技（北京）有限公司。PCR 擴(kuò)增引物由上海生工合成。

1.1.3 培養(yǎng)基 察氏培養(yǎng)基、含有Amp抗性的 LB培養(yǎng)基、含有G418 的YPD培養(yǎng)基分別用以培養(yǎng)點(diǎn)青霉、大腸桿菌和酵母菌，BMGY培養(yǎng)基（酵母提取物1%、蛋白胨2%、pH6.0磷酸鉀緩沖液100 mmol/L、YNB 1.34%、生物素4×10-5%、甘油1%）為畢赤酵母甲醇誘導(dǎo)表達(dá)前培養(yǎng)基。YPCS發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）（酵母提取物10，蛋白胨20，酪蛋白水解物5，山梨醇5）為畢赤酵母誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基。誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)，每24 h加入1%的甲醇。

1.2 方法

1.2.1 點(diǎn)青霉基因組的提取 按照真菌基因組提取試劑盒方法提取P. notatum的基因組DNA。

1.2.2 葡萄糖氧化酶基因的擴(kuò)增 擴(kuò)增來(lái)自于P. notatum的葡萄糖氧化酶引物的設(shè)計(jì)參照NCBI上報(bào)導(dǎo)的葡萄糖氧化酶序列（GenBank 登錄號(hào)：XM_002563405.1和JN809249.1），其5'端引物序列P1為：5'-ATGAAGTCCACTATTATCACCTCCA-3'，其3'端引物序列P2為：5'-CTAGGCACTTTTGGCATAGTCTTCA-3'，用這對(duì)引物以P. notatum基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為50 μL：基因組DNA 100 ng，引物各0.2 μmol/L，dNTPs 250 μmol/L，5×Q5 High-Fidelity DNA Polymerase Buffer 10 μL，Q5 High-Fidelity DNA Polymerase 0.5 μL。PCR反應(yīng)條件：98℃ 5 min；98℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 60 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA回收試劑盒回收。將經(jīng)鑒定無(wú)誤的連有點(diǎn)青霉葡萄糖氧化酶基因的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 葡萄糖氧化酶基因重組表達(dá)載體的構(gòu)建 為了將葡萄糖氧化酶基因在畢赤酵母中表達(dá)，首先去掉其自身的信號(hào)肽編碼序列，通過(guò)PCR方法設(shè)計(jì)引物將點(diǎn)青霉的葡萄糖氧化酶基因序列中的信號(hào)肽編碼序列去除。引物序列如下：GodF：5'-GGCTGAAG CTTACGTAGAATTCTATAGCCCGGCCGAGCAGATCG AC-3'；GodR：5'-GAGATGAGTTTTTGTTCTAGAGCG GCCGCCTAAGCTTTCTTGGCATAGTCTTC-3'（下劃線(xiàn)分別為上下游引物中限制性?xún)?nèi)切酶EcoR I和Not I識(shí)別位點(diǎn)）。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收采用GIBSON連接到表達(dá)載體 pMD-AOX的EcoR I和Not I位點(diǎn)上，轉(zhuǎn)化到 E. coli DH5α。酶切驗(yàn)證篩選陽(yáng)性克隆，并送測(cè)序。

1.2.4 畢赤酵母的轉(zhuǎn)化及誘導(dǎo)培養(yǎng) 采用電轉(zhuǎn)化法［8］，重組質(zhì)粒 pMD-AOX-GOD經(jīng)Pme I酶切后線(xiàn)性化。用 2 μg線(xiàn)性化 pMD-AOX-GOD質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化80 μL畢赤酵母X33感受態(tài)細(xì)胞，然后將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂于含 100 μg/mL G418的YPD平板上，30℃培養(yǎng)96 h。隨機(jī)挑選陽(yáng)性菌落轉(zhuǎn)接液體YPCS（含100 μg/mL G418，下同），置于 30℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)3 d，期間每隔24 h加1%的甲醇。

1.2.5 10 L發(fā)酵罐發(fā)酵 選取搖床水平上葡萄糖氧化酶活性最高的轉(zhuǎn)化子研究其發(fā)酵罐條件下葡萄糖氧化酶的表達(dá)。挑單克隆接種于YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)10 h，按3%接種量轉(zhuǎn)接于100 mL BMGY 培養(yǎng)基至OD600≈6接種于發(fā)酵罐，裝液量為2 L BSM培養(yǎng)基，滅菌后，以10%發(fā)酵體積接種。參照酵母表達(dá)手冊(cè)，以濃氨水控制pH5，培養(yǎng)溫度控制在30℃。培養(yǎng)階段甘油耗盡時(shí)（溶氧值DO開(kāi)始明顯上升），開(kāi)始流加50%甘油，至OD600≈180，停止流加甘油，4 h后往培養(yǎng)基中甘油耗盡，開(kāi)始流加甲醇誘導(dǎo)，期間每隔24 h加維生素C水溶液（終濃度80 μg/L），12 h測(cè)定發(fā)酵液酶活。發(fā)酵結(jié)束以6 000×g、4℃離心20 min收集發(fā)酵液上清，將所有收集到的上清液用超濾濃縮純化，提高分泌蛋白的濃度和純度，用BCA 法測(cè)蛋白濃度。用上清液進(jìn)行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，考馬斯亮藍(lán)R-250染色，脫色液（甲醇250 mL∶冰醋酸50 mL∶水200 mL）脫色，觀(guān)察GOD蛋白的表達(dá)。

1.2.6 葡萄糖氧化酶的酶活和比活測(cè)定

1.2.6.1 GOD活性測(cè)定 一般采用鄰聯(lián)茴香胺分光光度法。在3 mL的反應(yīng)體系中，包含0.5 mol/L醋酸緩沖液（pH5.1），0.17 mmol/L鄰聯(lián)茴香胺溶液和1.72%葡萄糖溶液及0.1 mg/mL辣根過(guò)氧化物酶，35℃震蕩混勻，加入0.1 mL葡萄糖氧化酶溶液，用分光光度計(jì)，于A=500 nm自動(dòng)記錄隨時(shí)間變化的吸光度值，根據(jù)公式，計(jì)算葡萄糖氧化酶活力單位。

式中，X：樣品酶活（U/ mL）；ΔA500：活度值；3.1：反應(yīng)體積；df為稀釋倍數(shù)；7.5：葡萄糖內(nèi)酯A500消光系數(shù)；0.1：加入酶液體積。

1.2.6.2 葡萄糖氧化酶比活性的測(cè)定 蛋白濃度測(cè)定采用上海生工Modified Bradford Protein Assay Kit測(cè)定。得到蛋白質(zhì)含量以后，同時(shí)測(cè)得其葡萄糖氧化酶的活性，由此得到葡萄糖氧化酶的比活性。

1.2.7 酶的分離純化 取發(fā)酵液在4℃、6 000 r/min離心20 min，去除發(fā)酵液中的菌體；將離心得到的上清液加入無(wú)水乙醇（終濃度20%），4℃靜置過(guò)夜，6 000 r/min離心20 min；取上清液，再加入無(wú)水乙醇（終濃度60%），4℃靜置過(guò)夜，6 000 r/min離心20 min，將得到的沉淀用0.1 mol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液稀釋到合適的酶活即得到初步純化的GOD酶液。將初步純化的GOD酶液采用DEAE-Sephadex A50進(jìn)一步純化后經(jīng)超濾濃縮后即可得精純度的葡萄糖氧化酶酶液。

1.2.8 葡萄糖氧化酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

1.2.8.1 溫度對(duì)酶活力的影響 （1）最適溫度：取10 μL一定濃度的純化后酶液，分別于35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃和70℃下測(cè)定其酶活力。（2）溫度耐受：取一定量的純化后的酶液，分 別 于35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃ 和65℃孵育30、60、90和120 min測(cè)定酶活力。

1.2.8.2 pH對(duì)酶活力的影響 （1）最適pH：取10 μL一定濃度的純化后酶液，分別于不同pH的緩沖液（終濃度均為 40 mmol/L）中，40℃測(cè)定其酶活力，并計(jì)算其比活。（2）pH耐受：取一定量的純化后酶液，分別于不同pH的緩沖液中孵育5 h；然后，于40℃下，取一定濃度的 10 μL 酶液測(cè)定酶活力。

1.2.8.3 金屬離子對(duì)酶活力的影響 將10 μL一定濃度的純化后酶液，在 pH6.0緩沖液混合后，分別加入終濃度為 0.1、1.0和10.0 mmol/L的金屬離子，補(bǔ)水到125 μL，40℃下測(cè)定其酶活力。

2 結(jié)果

2.1 點(diǎn)青霉GOD基因的克隆分析

以點(diǎn)青霉基因組DNA為模板，引物P1和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖1）。序列分析結(jié)果表明，其基因組DNA長(zhǎng)1 815 bp，GC含量為55.4%，無(wú)內(nèi)含子，編碼605個(gè)氨基酸（圖2）。用BLAST 進(jìn)行同源分析，結(jié)果顯示與產(chǎn)黃青霉（Penicillium chrysogenum）的GOD基因（GenBank登錄號(hào)：XM_002563405.1）有99% 的核酸序列相似性。推導(dǎo)的GOD氨基酸序列與已知的產(chǎn)黃青霉氨基酸序列相似性達(dá)99.8%，僅第15位氨基酸發(fā)生了Thr-Ala的轉(zhuǎn)變。

圖1 點(diǎn)青霉基因組PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

2.2 表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定

將經(jīng)引物GodF和GodR進(jìn)行PCR擴(kuò)增并純化回收的點(diǎn)青霉GOD基因和經(jīng)過(guò)EcoR I和Not I雙酶切的載體pMD-AOX進(jìn)行Gibson連接以構(gòu)建重組質(zhì)粒。用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，并在含Amp的LB平板上篩選陽(yáng)性菌落。陽(yáng)性菌落質(zhì)粒經(jīng)EcoR I和Not I雙酶切后，得到約6.5 kb和1.8 kb的兩個(gè)DNA片段，亦與預(yù)期大小相符（圖3）。重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果顯示目的基因的完整閱讀框序列已正確插入到pMD-AOX載體α-因子信號(hào)肽DNA序列的下游，表明含點(diǎn)青霉GOD基因的畢赤酵母表達(dá)載體 pMD-AOX-GOD已構(gòu)建成功。

圖2 GOD氨基酸同源性比較

2.3 重組酵母葡萄糖氧化酶的表達(dá)

將重組的表達(dá)質(zhì)粒 pMD-AOX-GOD經(jīng)Pme I酶切后線(xiàn)性化后，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母X33感受態(tài)，在YPD平板生長(zhǎng)3 d后，隨機(jī)挑選陽(yáng)性菌落轉(zhuǎn)接液體YPCS，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)72 h后，測(cè)定發(fā)酵液上清中的葡萄糖氧化酶活性，從32個(gè)轉(zhuǎn)化子中挑選出6株有葡萄糖氧化酶活性的轉(zhuǎn)化子，表達(dá)率為16.7%。說(shuō)明表達(dá)載體pMD-AOX-GOD 于畢赤酵母X33中得到有功能活性表達(dá)。

圖3 重組質(zhì)粒pMD-AOX-GOD瓊脂糖凝膠電泳鑒定

2.4 10 L發(fā)酵罐發(fā)酵結(jié)果

選取X33-GOD中酶活最高株為實(shí)驗(yàn)株在10 L發(fā)酵罐中發(fā)酵，在甲醇未誘導(dǎo)之前，處于菌株培養(yǎng)和碳源飼喂階段，在這兩個(gè)階段內(nèi)，菌體大量增長(zhǎng)，此時(shí)無(wú)葡萄糖氧化酶蛋白的表達(dá)。隨著甲醇的誘導(dǎo)，發(fā)酵液中的葡萄糖氧化酶活性逐漸增加（圖4），誘導(dǎo)144 h后發(fā)酵液中GOD活性達(dá)到最高496 U/mL，蛋白質(zhì)表達(dá)量達(dá)到9.4 g/L，SDS-PAGE（圖5）結(jié)果表明，發(fā)酵液中葡萄糖氧化酶蛋白表達(dá)量也在不斷積累，發(fā)酵液上清中GOD含量非常高，可以達(dá)到電泳純，可大大降低后期GOD純化的成本。

圖4 葡萄糖氧化酶發(fā)酵液酶活增長(zhǎng)曲線(xiàn)

圖5 10 L發(fā)酵罐中葡萄糖氧化酶經(jīng)甲醇誘導(dǎo)不同時(shí)間內(nèi)的表達(dá)量

2.5 重組酵母GOD的分離純化

取 300 mL發(fā)酵液經(jīng)高速冷凍離心，酒精沉淀、溶解后，上DEAE-Sephadex A50層析柱，超濾濃縮，收率可達(dá)94%。純化前后電泳圖譜（圖6）顯示，在甲醇的誘導(dǎo)下，GOD在X33中的表達(dá)量明顯高于其他雜蛋白。發(fā)酵液上清經(jīng)分離純化后，可見(jiàn)一條濃染的約90 kD的蛋白質(zhì)條帶，點(diǎn)青霉GOD理論分子量為60.2 kD，這與圖4中點(diǎn)青霉GOD電泳結(jié)果（65 kD）相似，但是重組酵母 GOD蛋白條帶明顯比點(diǎn)青霉GOD分子量大。根據(jù)該基因中有潛在的糖基化位點(diǎn)，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)又有轉(zhuǎn)錄翻譯后的加工功能，推測(cè)畢赤酵母表達(dá)的GOD蛋白質(zhì)為糖蛋白。

圖6 重組表達(dá)GOD蛋白SDS-PAGE

通過(guò)蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定出酶液中的蛋白含量，再通過(guò)常規(guī)的葡萄糖氧化酶酶活性測(cè)定方法，最后得到了該酶的比活。經(jīng)過(guò)測(cè)定，畢赤酵母X33-GOD比活為123.0 U/mg。同時(shí)，測(cè)定的青霉GOD比活僅為101.3 U/mg。

2.6 GOD的酶學(xué)性質(zhì)研究

2.6.1 溫度對(duì)酶活力的影響 在pH6.0的測(cè)活條件下，改變測(cè)活條件的反應(yīng)溫度，研究溫度對(duì)酶活力的影響，最適溫度（圖7-A）顯示，該酶催化反應(yīng)的最適溫度為40℃-45℃，70℃下酶活力基本接近0。重組 GOD對(duì)溫度的穩(wěn)定性（圖7-B）顯示，在35℃下孵育90 min酶活力基本保持不變，孵育到120 min時(shí)降低了12個(gè)酶活單位；在40℃下孵育90 min降低了15個(gè)酶活單位，孵育到120 min時(shí)降低了20個(gè)酶活單位；在45℃和50下℃孵育30 min降低了15個(gè)酶活單位，孵育到120 min時(shí)降低了40個(gè)酶活單位；在55℃下孵育30 min降低了20個(gè)酶活單位，孵育到120 min時(shí)降低了50個(gè)酶活單位；60℃孵育30 min，酶活力大約降低了30個(gè)酶活單位，孵育90 min后酶活力幾乎檢測(cè)不到。

圖7 溫度對(duì)GOD酶活力（A）及熱穩(wěn)定性（B）的影響

2.6.2 pH對(duì)酶活力的影響 在40℃的測(cè)活體系中，改變緩沖液的pH值，分析重組表達(dá)的葡萄糖氧化酶的酶活力發(fā)現(xiàn)，酶活力對(duì)反應(yīng)的pH作圖，得到一個(gè)相對(duì)平緩的曲線(xiàn)，最適 pH為6.0（圖8-A）。重組葡萄糖氧化酶對(duì)pH的穩(wěn)定性（圖8-B）表明，在不同pH的緩沖液中孵育5 h，重組表達(dá)的葡萄糖氧化酶在pH3.5-7.0的緩沖液中的酶活力能維持在90%以上，在pH3.0和pH8.0緩沖液中，酶的活性降低為原來(lái)的60%左右。

圖8 pH對(duì)GOD酶活力（A）及pH穩(wěn)定性（B）的影響

2.6.3 金屬離子對(duì)酶活力的影響 不同濃度的金屬離子對(duì)葡萄糖氧化酶的酶活力影響（圖9）顯示，在0.1 mmol/L的金屬離子濃度條件下，葡萄糖氧化酶的酶活力大多能維持在80%以上（除Ag+），Ag+對(duì)其有抑制作用；在金屬離子濃度為1.0 mmol/L時(shí)，葡萄糖氧化酶的酶活力大多能維持在80%以上，其中Zn2+對(duì)其有激活作用，Ag+對(duì)其有抑制作用；當(dāng)金屬離子濃度為10 mmol/L時(shí)，Ag+、Cu2+和Fe3+對(duì)GOD活力的抑制作用非常明顯，Ag+尤為顯著，GOD的剩余酶活力僅為1%。

圖9 金屬離子對(duì)重組GOD的影響

3 討論

GOD作為安全的生物抗氧化劑，在科研醫(yī)藥和食品工業(yè)生產(chǎn)上被廣泛應(yīng)用。目前，在產(chǎn)生菌的誘變育種篩選及產(chǎn)酶條件的優(yōu)化上做了大量工作［9-12］，也有一些學(xué)者進(jìn)行了黑曲霉的葡萄糖氧化酶基因在畢赤酵母中的克隆和表達(dá)［3，13，14］。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)是蛋白表達(dá)量高，可將外源蛋白分泌至胞外，且被表達(dá)的蛋白中雜蛋白少；畢赤酵母還具有對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行加工、折疊和翻譯后修飾［15］。本研究依據(jù)已知產(chǎn)黃青霉的GOD序列從點(diǎn)青霉中成功克隆了GOD基因，通過(guò)BLAST，相似性達(dá)99%，說(shuō)明在青霉屬中GOD相對(duì)保守；點(diǎn)青霉GOD發(fā)生了氨基酸置換（Thr15-Ala），由于點(diǎn)突變能改變酶分子的催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)及催化反應(yīng)活化能的現(xiàn)象，從而影響蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性［16］。

本研究構(gòu)建的畢赤酵母菌工程菌株X33-GOD在10 L發(fā)酵罐中30℃、pH6.5條件下發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)液GOD 酶活可達(dá)496 U/mL。X33-GOD比原始出發(fā)菌株點(diǎn)青霉的酶活（30 U/mL）提高近16倍。郭元芳等［13］報(bào)道的畢赤酵母SMD1168 表達(dá)黑曲霉accc30161GOD，其培養(yǎng)液上清GOD酶活力為107.18 U/mL；周亞鳳等［3］構(gòu)建出GOD的高產(chǎn)酵母工程菌株，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)3-4 d，發(fā)酵液中的GOD 活力為30-40 U/mL；李卓夫［17］將青霉GOD在畢赤酵母GS115中異源表達(dá)，在3 L發(fā)酵罐水平中，甲醇誘導(dǎo)132 h，發(fā)酵液中的最高酶活為111.3 U/mL。因此，本研究構(gòu)建的畢赤酵母X33-GOD工程菌株具有很高的推廣應(yīng)用價(jià)值。

本研究所分泌表達(dá)的GOD的單亞基分子量為90.0 kD，比原始菌株點(diǎn)青霉所產(chǎn)GOD單亞基分子量高約25 kD，分子量差異主要是由于糖基化造成的。糖基化對(duì)畢赤酵母分泌表達(dá)的GOD在蛋白折疊中起重要作用，能使酶蛋白結(jié)構(gòu)具有更好的穩(wěn)定性，這種過(guò)糖基化現(xiàn)象在黑曲霉GOD在畢赤酵母的表達(dá)中也存在［3］。

在青霉和黑曲霉中提取GOD需要經(jīng)過(guò)DEAE離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析兩步才能純化，花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)并且費(fèi)用也相對(duì)較高［18，19］。畢赤酵母發(fā)酵表達(dá)GOD，不需破碎菌體，發(fā)酵的上清液經(jīng)離心就能得到，且畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)極少分泌自身蛋白，雜蛋白含量低，只需經(jīng)過(guò)酒精沉淀和一步離子交換層析就可以達(dá)到電泳純，純化收率高，費(fèi)用低廉，該方法適合工業(yè)化生產(chǎn)，有利于大規(guī)模純化。

酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，相比以往報(bào)道的重組黑曲霉GOD和產(chǎn)黃青霉GOD的最適溫度僅有40℃［19，20］，本研究重組表達(dá)的來(lái)源于點(diǎn)青霉的GOD的最適溫度是40-45℃，范圍較寬；并且該酶熱穩(wěn)定性良好，在35-55℃之間都能保持良好的酶學(xué)活性，酶的熱穩(wěn)定性提高很可能也是由于過(guò)糖基化所造成的，畢赤酵母分泌表達(dá)的黑曲霉GOD也表現(xiàn)出了熱穩(wěn)定性的提高［21］；其次該酶在pH3.5-7.0之間能保持90%以上酶相對(duì)活力，有較高的應(yīng)用價(jià)值。

本研究中Zn2+對(duì)酶有一定的激活作用，而Ag+、Cu2+和Fe3+對(duì)酶的活性有抑制作用，這與張茜［19］報(bào)道的尼崎青霉菌GOD的性質(zhì)一樣。而Kelley等［22］報(bào)道當(dāng)Cu2+達(dá)到10 mmol/L時(shí)，GOD活性仍沒(méi)有被抑制；蘇茉等［18］研究認(rèn)為Zn2+對(duì)黑曲霉H1-9b所產(chǎn)GOD的活性有抑制作用。

4 結(jié)論

將點(diǎn)青霉菌的葡萄糖氧化酶基因（GOD）克隆到載體 pMD-AOX質(zhì)粒，線(xiàn)性化質(zhì)粒pMD-AOXGOD，轉(zhuǎn)化到畢赤酵母Pichia pastoris X33中異源表達(dá)，獲得了GOD的高產(chǎn)畢赤酵母工程菌株。結(jié)果顯示，與點(diǎn)青霉GOD 相比，畢赤酵母Pichia pastoris X33GOD具有更高的發(fā)酵酶活和比活。

［1］Wong CM, Wong KH, Chen XD. Glucose oxidase：natural occurrence, function, properties and industrial applications［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2008, 78（6）：927-938.

［2］Yin B, Yuan R, Chai Y, et al. Amperometric glucose biosensors based on layer-by-layer assembly of chitosan and glucose oxidase on the Prussian blue-modified gold electrode［J］. Biotechnol Lett, 2008, 30（2）：317-322.

［3］周亞鳳, 張先恩, 劉虹, 等. 黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的克隆及其在酵母中的高效表達(dá)［J］. 生物工程學(xué)報(bào), 2001, 17（4）：400-405.

［4］Damasceno L, Huang CJ, Batt C. Protein secretion in Pichia pastoris and advances in protein production［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2012, 93（1）：31-39.

［5］Kombrink A. Heterologous production of fungal effectors in Pichia pastoris［M］// Bolton MD, Thomma BPHJ. Plant Fungal Pathogens：Humana Press, 2012：209-217.

［6］Krainer F, Dietzsch C, Hajek T, et al. Recombinant protein expression in Pichia pastoris strains with an engineered methanol utilization pathway［J］. Microb Cell Fact, 2012, 11（1）：22-35.

［7］閔兆升, 郭會(huì)明, 顏旭, 等. 巴斯德畢赤酵母（P. pastoris）高密度發(fā)酵研究進(jìn)展［J］. 生物技術(shù)通報(bào), 2014（3）：42-49.

［8］Gietz RD, Woods RA. Genetic transformation of yeast［J］. Biotechniques, 2001, 30（4）：816-820, 822-816, 828.

［9］朱運(yùn)平, 褚文丹, 李秀婷, 等. 產(chǎn)胞外葡萄糖氧化酶菌株的分離鑒定及其誘變育種研究［J］. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2014, 14（4）：95-103.

［10］唐菁, 趙芯, 蘇茉, 等. 黑曲霉H1-9b發(fā)酵產(chǎn)葡萄糖氧化酶的工藝優(yōu)化［J］. 食品科學(xué), 2013, 34（9）：220-223.

［11］胡常英, 劉麗娜, 王云鵬, 等. 點(diǎn)青霉高產(chǎn)葡萄糖氧化酶菌株的誘變選育［J］. 河北省科學(xué)院學(xué)報(bào), 2006, 23（3）：11-15.

［12］梁靜娟, 李筱瑜, 官威, 等. 產(chǎn)葡萄糖氧化酶黑曲霉的誘變選育及葡萄糖酸鈣發(fā)酵條件的研究［J］. 食品工業(yè)科技, 2010, 31（12）：218-220.

［13］郭元芳, 孫高英, 郝建榮, 等. 黑曲霉葡萄糖氧化酶在畢赤酵母SMD1168中的表達(dá)［J］. 生物技術(shù), 2013, 23（4）：25-29.

［14］Gu L, Zhang J, Liu B, et al. High-level extracellular production of glucose oxidase by recombinant Pichia pastoris using a combined strategy［J］. Appl Biochem Biotech, 2015, 175（3）：1429-1447.

［15］陸永超, 蔣琳. 畢赤酵母高效表達(dá)策略概述［J］. 微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展, 2013, 41（1）：70-76.

［16］袁有忠, 趙思匯, 周宗祥, 等. 一個(gè)耐熱堿性磷酸酯酶突變型的研究［J］. 遺傳學(xué)報(bào), 2000, 27（4）：361-368.

［17］李卓夫. 葡萄糖氧化酶基因的克隆及高效表達(dá)［D］. 長(zhǎng)春：長(zhǎng)春理工大學(xué), 2008.

［18］蘇茉, 高亞朋, 梁建榮, 等. 黑曲霉H1-9b葡萄糖氧化酶的分離純化及部分性質(zhì)研究［J］. 食品科學(xué), 2011, 32（3）：181-185.

［19］張茜, 傅婉輝, 康勁翮, 等. 青霉葡萄糖氧化酶的分離純化及性質(zhì)研究［J］. 廈門(mén)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版, 2009, 48（1）：99-102.

［20］郝杰清, 王帥坤, 師慧, 等. 重組畢赤酵母葡萄糖氧化酶的純化和性質(zhì)［J］. 食品科學(xué), 2013, 34（9）：159-163.

［21］黃亮. 黑曲霉A9葡萄糖氧化酶基因克隆及其在畢赤酵母中的表達(dá)［D］. 保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2007.

［22］Kelley RL, Reddy CA. Purification and characterization of glucose oxidase from ligninolytic cultures of Phanerochaete chrysosporium［J］. J Bacteriol, 1986, 166（1）：269-274.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Cloning of Gene for a Glucose Oxidase from Penicillium notatum and Its Enzymatic Properties

GAO Qing-hua1HU Mei-rong2WU Fang-tong1TAO Yong2WANG Yun-peng1LUO Tong-yang1HU Chang-ying1
（1. Institute of Microbiology，Hebei Academy of Sciences，Baoding 071051；2. Institute of Microbiology，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101）

The purpose of this work is to clone the gene of glucose oxidase（GOD）from Penicillium notatum，which was then in heterologous expression in Pichia pastoris，and the enzymatic properties of purified proteins were studied. GOD gene was cloned from genome DNA of P. notatum No. 8312 strain using PCR technique，the gene was ligated to the vector pMD-AOX and then expressed in strain X33 of P. pastoris，and finally the enzymatic properties of the purified proteins were analyzed. As results，the strain X33-GOD highly expressed the GOD with activity. Its activity of GOD in cultured supernatant reached 496 U/mL and the specific activity was 123.0 U/mg at 30℃ and pH6.5. The optimal temperature and pH of recombinant GOD was 40-45℃ and 6.0 respectively. The result of stability of the enzyme showed that the enzyme was stable when the temperature under 50℃ and the pH3.5-7.0，and it can be activated by 1 mmol/L Zn2+and obvious inhibited by Ag+. The recombinant engineering P. pastoris strain with high-yield GOD has a higher fermentation activity and specific activity compared with GOD from P. notatum.

glucose oxidase；Penicillium notatum；recombinant expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.023

2015-11-09

河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目（14292804D），河北省科學(xué)院科技計(jì)劃項(xiàng)目（20150503 LR62-3）

高慶華，男，博士，研究方向：微生物發(fā)酵技術(shù)；E-mail：gaoqinghua_mbb@126.com