王路路權(quán)春善許永斌王冠天劉爽陳瑩

（1. 大連工業(yè)大學(xué)，大連 116000；2. 大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 大連民族大學(xué)生物技術(shù)與資源利用國家民委-教育部重點實驗室，大連 116605）

跨膜蛋白AgrCTM6-7C分離純化方法的優(yōu)化

王路路1，2權(quán)春善2許永斌2王冠天2劉爽2陳瑩2

（1. 大連工業(yè)大學(xué)，大連 116000；2. 大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 大連民族大學(xué)生物技術(shù)與資源利用國家民委-教育部重點實驗室，大連 116605）

旨在通過優(yōu)化AgrCTM6-7C蛋白的純化過程，獲得高純度的目的蛋白，為后續(xù)研究提供材料。詳細探討了金屬離子螯合層析緩沖液中咪唑濃度、離子交換層析緩沖液的pH值對AgrCTM6-7C蛋白純化效果的影響，并研究了β-巰基乙醇對AgrCTM6-7C蛋白聚集及其激酶活性的影響。經(jīng)過優(yōu)化后，在不影響AgrCTM6-7C蛋白激酶活性的前提下，AgrCTM6-7C蛋白在濃度和純度上均有明顯提高，純度可達98%以上，產(chǎn)量可達15 mg/L。

金黃色葡萄球菌；AgrCTM6-7C；純化

金黃色葡萄球菌是人類的一種重要病原菌，能引發(fā)許多嚴(yán)重感染。約有30%的正常人群長期攜帶金黃色葡萄球菌，通常存在于鼻腔內(nèi)或者皮膚上，當(dāng)非致病性的金黃色葡萄球菌侵染受傷的皮膚或黏膜時，也可能引起傷口的化膿感染，甚至誘發(fā)更嚴(yán)重的內(nèi)臟器官感染，導(dǎo)致肺炎，心內(nèi)膜炎及膿毒血癥等疾病［1-3］。

目前，醫(yī)院主要通過使用抗生素來治療由金黃色葡萄球菌引起的感染，如青霉素、甲氧西林、萬古霉素、慶大霉素、左氧氟沙星及克林霉素等，但金黃色葡萄球菌對環(huán)境的適應(yīng)力極強，在短短的幾十年內(nèi)先后出現(xiàn)了耐青霉素菌株，耐甲氧西林菌株及耐萬古霉素菌株等［4-9］。近期有文獻［10］報道甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（MSSA）對青霉素的耐藥率已達80%以上，對紅霉素和克林霉素的耐藥率約為50%。耐藥性金黃色葡萄球菌引起的疾病感染是一個全球性的問題，其致病率在許多國家均出現(xiàn)上漲趨勢［11］，在我國，耐藥性金黃色葡萄球菌引起的疾病治病率及死亡率均呈上升趨勢［12-14］，因此開發(fā)新的抗菌藥物和抗菌靶點迫在眉睫。

金黃色葡萄球菌的致病機制與其能分泌多種細胞外毒素及胞外酶密切相關(guān)，而這些毒力因子的協(xié)同表達受多個基因組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，過程十分復(fù)雜。研究表明，agr、srr、arl、sae、lyt和wal等多個雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)（two component signal transduction system，TCSTS）均參與了這些毒力因子的調(diào)控過程，其中附屬基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)是最主要的調(diào)控系統(tǒng)，agr系統(tǒng)調(diào)控金黃色葡萄球菌多種毒力因子的表達，它是一個全局調(diào)控因子，受群體感應(yīng)機制調(diào)節(jié)［15-18］。agr系統(tǒng)由組氨酸蛋白激酶AgrC和反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白AgrA組成［19，20］，AgrC是有7個跨膜片段的膜蛋白，含有胞外感受域，負責(zé)識別胞外信號從而開啟信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，AgrA通過改變相關(guān)基因的表達引發(fā)相應(yīng)的生物學(xué)反應(yīng)［20-23］。

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的基礎(chǔ)是磷?；霓D(zhuǎn)移［24］，由于金黃色葡萄球菌組氨酸蛋白激酶AgrC可以捕捉胞外信號，并且能夠發(fā)生磷酸化啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，因此AgrC的胞內(nèi)域和跨膜域均被認為是極具潛力的藥物靶點。其中通過設(shè)計和篩選阻斷AgrC和AgrA之間的信號通路的抑制劑成為研究熱點。

為了建立藥物篩選模型必需大量獲得AgrC蛋白。但是全長的AgrC表達量低且缺乏穩(wěn)定性，而AgrCTM6-7C（殘基數(shù)134-430）表達量相對較高，同時AgrCTM6-7C包含兩個跨膜域，一個胞外環(huán)和一個細胞質(zhì)域，含有磷酸化的位點并且保持著本身的激酶活性，即AgrCTM6-7C蛋白可以磷酸化AgrA開啟信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，對蛋白胞內(nèi)域的功能研究沒有影響，因此選用AgrCTM6-7C蛋白代替全長的AgrC蛋白進行相關(guān)實驗。本實驗詳細研究AgrCTM6-7C蛋白分離純化方法，優(yōu)化金屬離子螯合層析中緩沖液的咪唑濃度，離子交換層析中緩沖液的pH值，研究β-巰基乙醇對AgrCTM6-7C蛋白聚集度及激酶活性的影響，旨在不影響AgrCTM6-7C蛋白激酶活性的前提下，提高AgrCTM6-7C蛋白的純度和得率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 含pET-28a-AgrCTM6-7C重組質(zhì)粒的大腸桿菌（Escherichia coli）C43（DE3）由本實驗室前期構(gòu)建并保存。

1.1.2 培養(yǎng)基及緩沖液 32Y培養(yǎng)基：3.2%（W/V）酵母浸粉，0.8%（W/V）蛋白胨，0.58%（W/V）NaCl，10 mmol/L Tris-HCl，pH7.4。實驗中主要緩沖液配方如下：PBS緩沖液：137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，2 mmol/L KH2PO4，pH7.4，0.22 μm濾膜過濾；Washing buffer：10%甘油，20 mmol/L咪唑，5×CMC表面活性劑，加入PBS定容至1 L，調(diào)節(jié)pH 至7.0，0.22 μm濾膜過濾；Elution buffer：10%甘油，500 mmol/L咪唑，5×CMC表面活性劑，加入PBS定容至1 L，調(diào)節(jié)pH 至7.0，0.22 μm濾膜過濾；Buffer A：20 mmol/L Tris-HCl，1×CMC表面活性劑，定容至1 L，調(diào)節(jié)pH 至8.0，0.22 μm濾膜過濾；Buffer B：20 mmol/L Tris-HCl，1 mol/L NaCl，1×CMC表面活性劑，調(diào)節(jié)pH 至8.0，0.22 μm濾膜過濾；Brij-35 buffer：10%甘油，10 mmol/L HEPES，80 mmol/L NaCl，3×CMC Brij-35（W/V），用1×PBS 溶解定容，0.22 μm濾膜過濾，超聲除氣泡備用；5×Protein loading buffer：250 mmol/L Tris-HCl，pH6.8，10%（W/V）SDS，0.5%（W/V）BPB，甘油（體積分數(shù)50%），5%（V/V）β-巰基乙醇。

1.1.3 試劑及材料 十二烷基二甲基氧化胺（LDAO）購自Affymetrix公司；十二烷基聚乙二醇醚（Brij-35）購自Amresco公司；4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）購自Sigma公司；咪唑（超純）購自Sigma公司；異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside，IPTG）購自上海生工。

1.2 方法

1.2.1 AgrCTM6-7C粗提液的制備 AgrCTM6-7C粗提液的制備過程如下：將含有pET-28a-AgrCTM6-7C重組質(zhì)粒的大腸桿菌C43（DE3）以2%的接種量接種于32Y培養(yǎng)基中，220 r/min，30℃培養(yǎng)30 min，當(dāng)OD600在0.25-0.35時，添加終濃度為0.1 mmol/L的IPTG（Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside），220 r/min，20℃誘導(dǎo)24 h，6 300×g離心10 min收集培養(yǎng)后的菌體。用PBS緩沖液對菌體進行重懸，使?jié)窬w密度達到100 mg/mL，添加終濃度為1 mmol/L MgCl2、20 mmol/L咪唑，冰上孵育2 h，在800 bar壓力下，用高壓細胞破碎儀（JN-3000，廣州聚能生物科技有限公司）破碎菌體，4℃，24 000×g下離心30 min，收集上清，去掉沉淀中未破碎的細胞和細胞碎片。將得到的上清液在4℃，300 000×g下超高速離心45 min，沉淀中加入PBS緩沖液使細胞膜完全懸浮并向細胞膜懸浮液中加入10× CMC LDAO（lauryldimethylamine oxide）進行過夜溶解，300 000×g下超高速離心35 min得到粗提液，以備后續(xù)實驗使用。

1.2.2 金屬離子螯合層析方法的優(yōu)化 將5 mL已處理好的填料（Ni SepharoseTMHigh Performance，GE HealthcareTM）灌入低壓層析柱（Bio-Rad，型號2.5×10 cm）中，先用Washing buffer平衡10 min，然后加入10 mL粗提液，在搖床上輕柔搖5 min，使目的蛋白與填料充分結(jié)合，然后用4倍柱體積（200 mL）的Washing buffer對雜蛋白共進行4次洗脫，最終用Elution buffer將目的蛋白洗脫下來，收集用Washing buffer第4次洗脫的液體以及用Elution buffer洗脫下來的目的蛋白，進行SDS-PAGE檢測。對Elution buffer和Washing buffer中咪唑濃度進行了優(yōu)化，Washing buffer中咪唑濃度分別為10、20、30、50和100 mmol/L，Elution buffer中咪唑濃度分別為200、300、400、500和600 mmol/L，通過電泳檢測結(jié)果確定Elution buffer和Washing buffer中最適的咪唑濃度。

1.2.3 離子交換層析緩沖液pH值的優(yōu)化 用離子交換層析對由金屬離子螯合層析得到的AgrCTM6-7C蛋白溶液進行進一步分離純化。先用50 mL Buffer B清洗陰離子交換柱（Hi Trap Q，5 mL），繼而用200 mL Buffer A平衡柱子后將AgrCTM6-7C蛋白溶液灌入離子交換柱，用Buffer B、Buffer A的混合液對目的蛋白進行梯度洗脫，緩沖液中Buffer B的含量由0至100%遞增；在280 nm波長下監(jiān)測蛋白含量并收集目標(biāo)樣品。由于pH值是決定實驗效果的重要因素，因此對緩沖液的pH值進行了優(yōu)化，分別考察了緩沖液pH值為6.0、7.0、8.0和9.0時的純化效果。

1.2.4 β-巰基乙醇對蛋白聚集度的影響 為考慮巰基化合物對AgrCTM6-7C蛋白聚集的影響，用激光粒度分析儀（horiba scientific nano particle analyzer SZ-100，HORIBA）對蛋白樣品的粒徑進行測量。在5 mL離心管中加入200 ng目的蛋白，以及終濃度分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mmol/L的β-巰基乙醇，用Brij-35 buffer將反應(yīng)體系補足至3 mL，混勻后于37℃孵育30 min后測量蛋白粒徑大小。

1.2.5 β-巰基乙醇對AgrCTM6-7C蛋白激酶活性的影響

AgrCTM6-7C蛋白的激酶活性是通過檢測反應(yīng)體系中剩余的ATP含量來間接測定的。底物在磷酸激酶的作用下與ATP發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，在反應(yīng)體系中加入甲殼熒光素，使其反應(yīng)體系中剩余的ATP作用，形成氧化熒光素，進而發(fā)出熒光。實驗中AgrCTM6-7C蛋白激酶活性的測定采用Kinase-Glo Luminescent Kinase Assay方法，具體實驗步驟參見試劑盒說明。實驗在96孔板中進行，反應(yīng)體系為50 μL，含有終濃度為10 mmol/L的MgCl2和5μmol/L的ATP，0-0.20 μg的目的蛋白，反應(yīng)緩沖液為Brij-35 buffer，將整個體系在37℃孵育10 min后加入50 μL發(fā)光試劑，37℃反應(yīng)10 min后用多功能酶標(biāo)儀檢測體系的發(fā)光強度。為驗證β-巰基乙醇對AgrCTM6-7C蛋白激酶活性的影響，在50 μL反應(yīng)體系中添加終濃度為10 mmol/L的MgCl2和5 μmol/L的ATP，200 ng的目的蛋白以及不同濃度梯度的β-巰基乙醇，測定方法同上。

2 結(jié)果

2.1 金屬離子螯合層析緩沖液中咪唑濃度的優(yōu)化

實驗考察了不同咪唑濃度對雜蛋白洗脫效果的影響。收集各咪唑濃度Washing buffer洗脫過程中，最后一次洗脫液檢測洗脫效果，根據(jù)電泳檢測結(jié)果確定Washing buffer中的最適咪唑濃度。純化后檢測結(jié)果（圖1-A）顯示，當(dāng)Washing buffer中咪唑濃度為10 mmol/L和20 mmol/L時，用4倍柱體積的Washing buffer對雜蛋白進行洗脫后，經(jīng)檢測洗脫液中雜蛋白的含量仍舊相對較高，而Washing buffer中咪唑濃度分別為50 mmol/L和100 mmol/L時，經(jīng)檢測洗脫液中都不同程度的含有目的蛋白。由于膜蛋白本身表達量就不高，而提純過程中的損失將使目的蛋白的得率進一步下降，這不利于后續(xù)的精制，綜合考慮確定Washing buffer中的最適咪唑濃度為30 mmol/L。對Elution buffer中咪唑濃度進行優(yōu)化，如圖1-B所示，圖中泳道2、3、4分別代表Elution buffer中的咪唑濃度為400、500和600 mmol/L，此時Elution buffer將目的蛋白洗脫下來的同時也將洗脫下來大量的雜蛋白，嚴(yán)重影響目的蛋白的純度。Elution buffer中的咪唑濃度為200 mmol/L時（泳道1），因咪唑濃度較低，不能將目的蛋白完全洗脫下來。Elution buffer中的咪唑濃度為300 mmol/L（泳道5）時，可以將大多數(shù)目的蛋白洗脫下來，但并未發(fā)現(xiàn)有明顯的雜蛋白被洗脫下來。因此綜合以上因素選定Elution buffer中最適咪唑濃度為300 mmol/L。

圖1 Washing buffer（A）和Elution buffer（B）緩沖液咪唑濃度對蛋白分離效果的影響

對金屬離子螯合層析緩沖液優(yōu)化前后的分離效果（圖2）顯示，優(yōu)化后的溶液中雜蛋白的含量明顯降低，蛋白的純度得到了一定程度的提高，但該純度還不能滿足后續(xù)實驗要求，因此還需對目的蛋白進行進一步的分離純化。

圖2 咪唑濃度優(yōu)化前后的AgrCTM6-7C蛋白分離效果圖

2.2 離子交換層析緩沖液pH值的優(yōu)化

分別利用pH值為6.0、7.0、8.0和9.0的緩沖液對蛋白進行分離純化，不同pH值的緩沖液純化結(jié)果如圖3-A所示。對出峰部分的樣品進行SDSPAGE檢測，并濃縮收集，通過蛋白的純度和得率等因素的綜合考慮，發(fā)現(xiàn)當(dāng)緩沖液中pH值為8.0時，蛋白的得率最高，純度也相對較好，因此選定緩沖液的最適pH值為8.0。離子交換層析緩沖液pH值為8.0時根據(jù)峰譜圖，取吸收值較高的樣品1、2進行電泳檢測，結(jié)果如圖3-B所示，純化后的蛋白條帶單一雜蛋白較少，但分子量為70 kD的位置始終出現(xiàn)明顯的條帶，分析可能是目的蛋白AgrCTM6-7C的二聚體，而蛋白二聚體的存在對其結(jié)晶等后續(xù)實驗的影響較大。β-巰基乙醇是一種常見的還原劑，用于保護蛋白質(zhì)中自由的半胱氨酸巰基之間不會形成錯誤的二硫鍵，推測β-巰基乙醇可能會抑制蛋白二聚體的形成，因此在純化過程中添加β-巰基乙醇以試圖解決該問題。

2.3 β-巰基乙醇對蛋白聚集的影響

在蛋白溶液中添加不同濃度的β-巰基乙醇，孵育后對目的蛋白的粒徑大小進行測量，結(jié)果（圖4）顯示，隨著β-巰基乙醇濃度的增加，目的蛋白的粒徑逐漸降低，當(dāng)β-巰基乙醇的濃度大于1.5 mmol/L后蛋白粒徑大小趨于平穩(wěn)無明顯變化。在純化 AgrCTM6-7C蛋白的過程中一組添加終濃度為1.5 mmol/L的β-巰基乙醇，另一組對照實驗不添加β-巰基乙醇，經(jīng)金屬離子螯合層析和離子交換層析分離純化，用SDS-PAGE對純化后的蛋白進行檢測，結(jié)果如圖5所示。圖中可見，泳道2中目的條帶單一，雜蛋白含量極低，純化效果很好，而泳道1中在二倍分子量的位置仍有明顯的條帶，由此可證明β-巰基乙醇可抑制二聚體的形成，在純化過程中添加適量的β-巰基乙醇可以防止二聚體的形成，純度得到了很大提高，可達98%以上，產(chǎn)量可達到15 mg/L。

圖3 AgrCTM6-7C蛋白的離子交換層析圖（A）及純化SDSPAGE電泳圖（B）

圖4 β-巰基乙醇對AgrCTM6-7C蛋白粒徑大小的影響

圖5 β-巰基乙醇對AgrCTM6-7C蛋白純化效果的影響

2.4 β-巰基乙醇對AgrCTM6-7C蛋白酶活性的影響

為了檢測目的蛋白是否具有激酶活性，在反應(yīng)體系中分別添加了0、0.05、0.10、0.15和0.20 μg的目的蛋白，并進行激酶活性的檢測。檢測結(jié)果（圖6）顯示，隨著蛋白含量的增多，熒光值呈下降的趨勢，這表明反應(yīng)體系中剩余的ATP含量逐漸降低，即隨著蛋白含量的增加蛋白的激酶活性逐漸增大，因此可以證明目的蛋白具有激酶活性。為考察β-巰基乙醇對AgrCTM6-7C激酶活性的影響，向反應(yīng)體系中分別添加200 ng AgrCTM6-7C蛋白，以及終濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mmol/L的β-巰基乙醇，反應(yīng)完全后檢測激酶活性。結(jié)果顯示，隨著β-巰基乙醇濃度的增加，蛋白的激酶活性呈微弱的先增加后降低的趨勢，當(dāng)濃度為1.5 mmol/L時，蛋白的激酶活性最高，但數(shù)據(jù)整體浮動較小，故β-巰基乙醇對蛋白激酶活性的影響并不顯著。綜上可知，在分離純化的過程中添加終濃度為1.5 mmol/L的β-巰基乙醇對蛋白的激酶活性無明顯影響，但是卻可以明顯抑制二聚體的形成。

3 討論

金黃色葡萄球菌其耐藥性菌株的出現(xiàn)也為抗生素用藥帶來了較大困難，進而導(dǎo)致病死率的升高。為了降低耐藥性菌株的增長率以及延長抗生素的使用壽命，在合理使用抗生素的同時，急需研發(fā)新的抗菌藥物及藥物靶點［12-14］。金黃色葡萄球菌agr系統(tǒng)與其致病性、耐藥性和細胞的基本生理功能等密切相關(guān)，若能探明agr系統(tǒng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機理，將對金黃色葡萄球菌的耐藥性研究產(chǎn)生重大影響。而金黃色葡萄球菌組氨酸蛋白激酶AgrC作為agr系統(tǒng)的重要組成部分，在該雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。目前組氨酸激酶AgrC正成為藥物靶點研究的熱點，但是進展相對緩慢，原因是AgrC穩(wěn)定性太低，使AgrC蛋白的分離純化相對困難，從而導(dǎo)致其三維結(jié)構(gòu)至今仍未能確定，對組氨酸激酶AgrC結(jié)構(gòu)功能研究帶來了較大難度。本實驗以AgrCTM6-7C作為模式蛋白，對AgrCTM6-7C蛋白的分離純化過程進行了多方面的優(yōu)化，為后續(xù)實驗研究奠定了基礎(chǔ)。

圖6 AgrCTM6-7C蛋白激酶活性的測定結(jié)果

目的蛋白AgrCTM6-7C在C末端帶有組氨酸標(biāo)簽，可與過渡金屬離子Ni2+形成配位相互作用，進而實現(xiàn)蛋白的分離純化。本實驗選用Ni-NTA作為介質(zhì)純化蛋白。金屬離子螯合層析是蛋白純化過程中較為常用的方法，有研究表明咪唑的濃度對蛋白純化效果影響很大，洗脫雜蛋白時咪唑濃度過低會導(dǎo)致純化后雜蛋白含量過高，蛋白純度降低，收集目的蛋白時，咪唑濃度過低會導(dǎo)致目的蛋白不能完全被收集，而咪唑濃度過高又容易帶入過多的雜蛋白［25，26］，因此有必要對Washing buffer和Elution buffer中咪唑的濃度進行優(yōu)化，以提高目的蛋白的純度及得率。通過對實驗結(jié)果的綜合分析，最終選定Washing buffer中咪唑的最適濃度為30 mmol/L，Elution buffer中最適咪唑濃度為300 mmol/L。金屬離子螯合層析的緩沖液經(jīng)優(yōu)化后，目的蛋白AgrCTM6-7C的純化效果有了明顯提高，雜蛋白大大減少，但仍有部分雜蛋白未被分離出去，因此利用離子交換層析技術(shù)對目的蛋白進行進一步的分離純化。

離子交換層析是一種用不同離子濃度梯度的鹽溶液對目的蛋白進行洗脫的分離技術(shù)。根據(jù)AgrCTM6-7C氨基酸序列，通過ExPASy Pa ram tool軟件在線分析表明，AgrCTM6-7C的等電點pI約為5.0，理論上當(dāng)緩沖液的pH值大于蛋白等電點時，蛋白帶負電，可與陰離子交換柱中的填料結(jié)合，從而與雜蛋白分離開來，實現(xiàn)目的蛋白的分離純化。緩沖液中鹽離子濃度和pH值是影響純化效果的主要因素，由于過高的鹽離子濃度不利于后續(xù)實驗，因此鹽離子濃度最終選定可以將目的蛋白置換出來的最低濃度。通過對純化效果的分析，優(yōu)化后選定緩沖液的最適pH值為8.0。

AgrCTM6-7C蛋白經(jīng)過金屬離子螯合層析和離子交換層析后得到的目的蛋白中雜蛋白含量很低，但在二倍分子量的位置始終有一條明顯的雜帶，且含量相對較多，根據(jù)分子量大小分析可能為AgrCTM6-7C蛋白的二聚體。疏水作用的存在及二硫鍵的形成是導(dǎo)致蛋白形成二聚體的主要原因，破壞疏水作用常用的方法是使用尿素等強變性劑，但尿素引起的蛋白質(zhì)變性有時很難完全復(fù)性。有文獻［27-29］報道，在現(xiàn)代生物技術(shù)里，在下游產(chǎn)品的分離、純化過程中β-巰基乙醇的應(yīng)用均十分廣泛。斷裂二硫鍵常用的方法主要是過甲酸氧化法和巰基化合物還原法，目前普遍使用的方法是用β-巰基乙醇處理蛋白樣品，以抑制二硫鍵的形成，防止蛋白形成多聚體。為避免目的蛋白形成二聚體，在實驗過程中的緩沖液中添加了一定量的β-巰基乙醇。結(jié)果表明當(dāng)β-巰基乙醇濃度達到1.5 mmol/L時，目的蛋白的粒徑最小，因此在純化蛋白的過程中添加終濃度為1.5 mmol/L的β-巰基乙醇，經(jīng)電泳結(jié)果分析可有效抑制目的蛋白二聚體的形成。激酶活性測定結(jié)果證明，1.5 mmol/L的β-巰基乙醇并不影響AgrCTM6-7C蛋白的激酶活性。

4 結(jié)論

本研究優(yōu)化了AgrCTM6-7C蛋白的分離純化方法，最終在不影響AgrCTM6-7C蛋白激酶活性的前提下，顯著提高AgrCTM6-7C蛋白的純度和得率，純度可達98%以上，產(chǎn)量可達15 mg/L。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Optimization of the Purification Method for Transmembrane Protein AgrCTM6-7C

WANG Lu-lu1，2QUAN Chun-shan2XU Yong-bin2WANG Guan-tian2LIU Shuang2CHEN Ying2
（1. School of Biological Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian 116000；2. Key Laboratory of Biotechnology and Resource Utilization，State Ethnic Affairs Commission and Ministry of Education，Department of Life Science，Dalian Nationalities University，Dalian 116605）

The core objective of this paper is to obtain the protein of AgrCTM6-7Cwith high purity by optimizing the purification processes，and provide the materials for further research. We investigated the influence of imidazole concentration in buffer used in the metal ion affinity chromatography and buffer with different pH used in the ion exchange chromatography on the purification of AgrCTM6-7C. Moreover，we discussed the effects of β-Mercaptoethanol on protein aggregation and kinase activity of AgrCTM6-7C. The optimized purification method resulted in the obvious increase on the yield and purity of AgrCTM6-7C，producing 15 mg with about 98% purity from one-liter culture medium.

Staphylococcus aureus；AgrCTM6-7C；purification

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.009

2015-10-30

國家自然科學(xué)基金項目（21272031），中央高?；究蒲谢穑―C201502020201）

王路路，女，碩士研究生，研究方向：細菌雙組份信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)；E-mail：wanglulu0813@126.com

權(quán)春善，女，博士，教授，研究方向：酶工程，生物化工及分子生物學(xué)；E-mail：mikyeken@dlnu.edu.cn