李進(jìn)嵩,黃 晶,張春曉,鄧輝勝,江永紅,朱 愨,袁僑英(.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院心內(nèi)科,四川 成都 6007;.重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所,重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科,重慶 40000;.重慶交通大學(xué),重慶 400074)
離體心肌粘彈性的印壓蠕變試驗(yàn)檢測及其病理機(jī)制研究
李進(jìn)嵩1,黃 晶2,張春曉3,鄧輝勝2,江永紅2,朱 愨2,袁僑英2
(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院心內(nèi)科,四川 成都 610072;2.重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所,重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科,重慶 400010;3.重慶交通大學(xué),重慶 400074)
目的 通過生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)和印壓方法檢測正常和心肌梗死心肌粘彈性的改變及其病理機(jī)制分析。方法 應(yīng)用自行研制的印壓實(shí)驗(yàn)裝置通過印壓蠕變試驗(yàn)分別檢測保持活性的離體犬陳舊性梗死心肌(OMI組)和正常心肌(正常組)試件粘彈性特征參數(shù)(E、E1、E2、η、τ);并檢測試件膠原含量、膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)及I/III型膠原纖維比例。對心肌粘彈性參數(shù)與膠原含量、CVF、I/III型膠原比例分別進(jìn)行相關(guān)分析。結(jié)果 OMI組粘彈性特征參數(shù)(E、E1、E2、η)、膠原含量、膠原容積分?jǐn)?shù)、I/III型膠原比例均高于正常組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05);兩組膠原含量、CVF與E、E1、η呈高度正相關(guān)(P<0.05),正常組I/III膠原比例與E1、E呈高度正相關(guān),OMI組則與E1呈正相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論 印壓法可檢測心室肌粘彈性特性;心肌梗死后彈性模量和粘性阻力均增高;心肌膠原增生及重構(gòu)對心肌粘彈性有顯著影響。
犬離體心室??;負(fù)荷-形變印壓實(shí)驗(yàn)裝置;印壓蠕變試驗(yàn);心肌粘彈性;心肌梗死;心肌膠原纖維
心臟是一個(gè)具有豐富力學(xué)特性的器官,全面認(rèn)識心臟功能需要對其生物力學(xué)特性有深刻的認(rèn)識[1]。松弛心肌具有滯后、蠕變、應(yīng)力松弛等粘彈性特性[2]。以往在體外通過單軸拉伸小梁肌等研究心肌粘彈性特性[3]。然而單軸拉伸法研究的只是心肌纖維軸向的力學(xué)特性,而忽略了心腔內(nèi)血液施加在心肌上的力學(xué)效應(yīng),且難以在活體研究其與生理功能的關(guān)系。近來借助心臟核磁共振作圖的方法來研究心臟生物力學(xué)特性亦無法做到精確性評估[4]。自1912年Schade應(yīng)用印壓裝置研究皮膚蠕變特性以來,應(yīng)用探頭印壓組織,同時(shí)測定組織受力和相應(yīng)形變的印壓方法已被應(yīng)用于肌肉、肺等組織硬度、粘彈性等生物力學(xué)特性的研究。結(jié)合本課題組前期以印壓法檢測兔離體心肌僵硬度的研究基礎(chǔ)[5],本課題利用自行研制的負(fù)荷-形變印壓實(shí)驗(yàn)裝置,對保持活性的犬離體心室肌試件進(jìn)行蠕變試驗(yàn)檢測心肌梗死后心肌粘彈性特征參數(shù)的改變并進(jìn)一步探討導(dǎo)致心肌粘彈性改變的病理機(jī)制。
1.1 試驗(yàn)試件制備 健康成年雜種犬6 只(重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),雌雄不限,體重(10.4±2.3)kg。腹腔注射麻醉后,以結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支法建立急性心肌梗死模型,術(shù)后抗感染1 周,飼養(yǎng)3 個(gè)月構(gòu)建陳舊性心肌梗死模型。隨后模型犬麻醉后開胸,10% KCl注射使心臟停跳于舒張期,迅速剪下心臟。在盛有4 ℃生理鹽水冰浴中浸泡清洗,然后將左心室梗死后瘢痕形成的陳舊性梗死心肌和正常心肌分別剪下制作成約20 mm×20 mm試件,分為陳舊性梗死心肌組(OMI組)和正常心肌組(正常組)。
1.2 主要試驗(yàn)設(shè)備 負(fù)荷-形變印壓實(shí)驗(yàn)裝置由重慶醫(yī)科大學(xué)與重慶交通大學(xué)共同研制,結(jié)構(gòu)見圖1。主要構(gòu)件包括數(shù)顯千分表(精確度0.001 mm,成都遠(yuǎn)恒精密測控技術(shù)有限公司)和各種不同直徑的圓柱形探頭(4 F、6 F、8 F、4 mm等直徑,重慶鐘表廠定制),探頭底端平整。工作原理:通過在漏斗中加減載砝碼可調(diào)節(jié)所需施加載荷大小。心肌所承受的力為砝碼重力加上系統(tǒng)自重力,心肌發(fā)生的形變可由數(shù)顯千分表直接實(shí)時(shí)顯示。系統(tǒng)中軸垂直于試件。
圖1 負(fù)荷-形變印壓實(shí)驗(yàn)裝置結(jié)構(gòu)示意圖
1.3 印壓蠕變試驗(yàn) Gupta等研究表明[6],通過心臟停跳液浸泡心室肌試件約2 h后其心肌拉伸的應(yīng)力-應(yīng)變曲線無顯著變化。本研究離體心肌蠕變試驗(yàn)可以在30 min內(nèi)獲得足夠數(shù)據(jù)來描繪心肌整個(gè)蠕變過程,故本研究中用K-H液(Sigma 公司)保持離體心肌力學(xué)活性是恰當(dāng)?shù)?。用?fù)荷-形變印壓實(shí)驗(yàn)裝置選用合適探頭在試件中心印壓,預(yù)先加載、減載3 次,進(jìn)行預(yù)調(diào)處理。然后使試件承受恒定載荷后,記錄形變隨時(shí)間變化的過程,每次記錄均在形變連續(xù)三個(gè)值之間差值小于規(guī)定計(jì)數(shù)后結(jié)束。時(shí)間設(shè)定:試驗(yàn)數(shù)據(jù)采集從輕輕釋放載荷時(shí)刻開始,從數(shù)顯千分表讀取心肌形變數(shù)值,每5 s采集一個(gè)數(shù)據(jù)。試驗(yàn)時(shí)間進(jìn)行到一定時(shí)刻,蠕變試驗(yàn)數(shù)據(jù)變化趨于平穩(wěn),記錄結(jié)束。將獲得的印壓蠕變試驗(yàn)數(shù)據(jù)按照印壓蠕變理論方程進(jìn)行曲線擬合,可分別獲得正常組和OMI組E、E1、E2、η、τ等粘彈性參數(shù)。
研究表明有諸多模型可以用于心臟和心肌生物力學(xué)特性描述[7],而三參量模型能較好的用于粘彈性材料的印壓蠕變試驗(yàn)分析[8],對于圓柱形平底印壓探頭,其印壓蠕變理論方程:
F為作用在試件上的力,υ為被測對象的泊松比,D為印壓探頭直徑,δ為蠕變穩(wěn)定后的印壓深度?;谛募∈遣豢蓧嚎s粘彈性材料泊松系數(shù)約為0.5,故本實(shí)驗(yàn)研究中υ取值0.5。
1.4 心肌膠原含量測定 參照Bergerman[10]方法測定經(jīng)印壓檢測的正常組和OMI組試件心室肌羥脯氨酸濃度,計(jì)算兩組心肌膠原含量。主要儀器:紫外可見分光光度計(jì)Ultrospec 2100 pro(AmerSham Biosciences公司)。主要試劑:羥脯氨酸測試盒(樣本鹼水解法,南京建成生物工程研究所第一分所生產(chǎn))。測定方法參照羥脯氨酸測試盒說明書 VI(樣本鹼水解法)中的步驟進(jìn)行。膠原濃度(%)=羥脯氨酸濃度×7.46,7.46為羥脯氨酸換算成膠原時(shí)的計(jì)算常數(shù);膠原含量=膠原濃度×試件濕重。
1.5 心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)和膠原比例檢測 采用苦味酸天狼猩紅染色法測定CVF和偏振光法測定I/III型膠原纖維比例。經(jīng)天狼猩紅染色和偏光鏡觀察后用Image-Pro Plus 5.1病理影像圖文分析系統(tǒng)軟件進(jìn)行CVF和I、III膠原比例半定量分析,于左心室梗死區(qū)和非梗死區(qū)非血管區(qū)隨機(jī)選擇5個(gè)視野,用上述分析系統(tǒng)檢測膠原面密度(area)占整個(gè)圖片面密度(area)比值代表其CVF。I型和Ⅲ型面密度(area)之比代表I/Ⅲ型膠原比例。
1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn),所有指標(biāo)屬于正態(tài)分布,兩組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn),兩變量間采用直線相關(guān)分析。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 蠕變試驗(yàn)結(jié)果 獲得的印壓蠕變試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Microcal Origin6.0 軟件按照上述印壓蠕變理論方程進(jìn)行曲線擬合,曲線擬合中決定系數(shù)R2、相關(guān)指數(shù)R都在0.95以上(P<0.001),擬合效果好,見圖2。OMI組心肌粘彈性特征參數(shù)E、E1、E2、η高于正常組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組參數(shù)τ比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。OMI組E、E1、E2、η分別較正常組增加了約80%、83%、63%、80%和53%,τ下降約10%。楊氏模量等彈性模量增加最明顯,E2> E1,單位應(yīng)變下的阻尼應(yīng)力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于單位應(yīng)變下的彈性應(yīng)力,見表1。
圖2 離體心肌蠕變試驗(yàn)數(shù)據(jù)曲線和擬合曲線
表1 兩組離體心肌粘彈性特征參數(shù)比較
2.2 心肌膠原含量、CVF、I/III膠原比例檢測結(jié)果
OMI組膠原含量、CVF、I/III膠原比例明顯高于正常組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。
表2 兩組心肌膠原含量、CVF、I/III膠原比例比較
2.3 膠原含量、CVF、I/III膠原比例與心肌粘彈性參數(shù)的相關(guān)性分析 兩組膠原含量、CVF與粘彈性參數(shù)E、E1、η呈高度正相關(guān)(P<0.05),與E2、τ無相關(guān)(P> 0.05)。正常組I/III膠原比例和粘彈性參數(shù)E1、E呈高度正相關(guān),與參數(shù)E2、η呈負(fù)相關(guān)(P< 0.05),與τ無相關(guān)(P> 0.05)。OMI組I/III膠原比例和粘彈性參數(shù)E1呈正相關(guān)(P<0.05);與E、η、E2、τ無相關(guān)(P> 0.05),見表3。
表3 心肌膠原含量、CVF、I/III膠原比例與心肌粘彈性參數(shù)相關(guān)性分析
研究表明,確定心臟舒張功能的主要因素是心肌在應(yīng)力作用下發(fā)生應(yīng)變的能力,在舒張中晚期起主導(dǎo)作用,粘彈性模型能準(zhǔn)確地反映舒張期心肌力學(xué)特性[11],準(zhǔn)確定量評估舒張期心肌粘彈性特性能加深對心肌和心臟功能的深入認(rèn)識[12],進(jìn)而對舒張性心力衰竭防治有較大臨床意義。
從本試驗(yàn)蠕變曲線可以得知,在發(fā)生蠕變時(shí)心肌形變過程經(jīng)歷了一個(gè)初始的快速變化相和其后的緩慢蠕變相,說明心肌在外加階躍載荷作用下先表現(xiàn)出一個(gè)彈性響應(yīng)階段(階躍變形),其后再顯示粘性響應(yīng)的過程(蠕變)[13]。因此心肌彈性成分和粘性成分共同決定了舒張期心肌形變,這兩個(gè)因素可能通過不同的途徑對心肌順應(yīng)性產(chǎn)生不同的影響,彈性成分影響心肌形變程度,而粘性成分影響心肌形變速度[14]。本研究在定量評估心肌彈性和粘性成分方面做了有益探索。同時(shí),試驗(yàn)測得離體正常和梗死心肌楊氏彈性模量約為11.93 kPa和20.50 kPa,表明活體正常心肌硬度很低,這與Pislaru等[15]通過開胸以超聲剪切波檢測活體心肌粘彈性僵硬度結(jié)果接近。
Stroud等[16]研究表明,膠原纖維是細(xì)胞外基質(zhì)影響心肌粘彈性的主要決定因素,心肌間質(zhì)纖維化增加引起的結(jié)構(gòu)改變將導(dǎo)致心肌被動(dòng)彈性特征改變。I型、Ⅲ型膠原是組成纖維性膠原網(wǎng)的主要成分,對維持心臟正常結(jié)構(gòu)和功能十分重要。在某些疾病狀態(tài)下,如心肌梗死后,膠原的數(shù)量及分布發(fā)生改變(即膠原重構(gòu)),引起心肌間質(zhì)纖維化,當(dāng)間質(zhì)含量由正常3%~5%增至8%~12%時(shí),心肌收縮和舒張的應(yīng)力—應(yīng)變關(guān)系均升高,室壁順應(yīng)性下降,影響心肌收縮及舒張功能,但以舒張功能障礙出現(xiàn)較早[17]。
本研究表明,心肌梗死90天后犬梗死區(qū)心肌膠原含量比對照組高近3倍,而梗死心肌的彈性模量和粘性阻力系數(shù)比對照組分別增加約4倍和3倍。從膠原容積分?jǐn)?shù)和心肌粘彈性參數(shù)的相關(guān)性分析表明,膠原容積分?jǐn)?shù)增加,膠原增生使得舒張心肌的彈性模量、粘性阻力增加,表明心肌膠原含量對心肌彈性和粘性阻力的影響是正相關(guān)的,心肌膠原含量越多,心肌越僵硬,形變時(shí)要克服的粘性阻力越大。這也從定量方面證實(shí)心肌梗死后膠原增生可增加心臟的僵硬度,與Stroud等[16]關(guān)于降低心肌組織膠原的含量將降低心肌的彈性硬度和粘性阻力的研究一致。同時(shí)犬梗死區(qū)在經(jīng)過90天后心肌I/Ⅲ 比值仍然比正常值高,說明I型膠原的增生一直持續(xù),然后可能維持在某個(gè)水平。I/III型膠原比例與彈性模量的相關(guān)關(guān)系也可以解釋膠原的過度增生尤其是I型膠原的增多,增加了心肌的僵硬度。正常組心肌與E2、η參數(shù)的負(fù)相關(guān)表明,I型膠原的增多和III型膠原纖維的下降使得心肌的粘性阻力增加,I/III型膠原纖維比例的下降,即III型膠原纖維增生為主將會(huì)一定程度上改善心肌的舒張,這與Weber推測膠原纖維的分布、比例改變影響心肌力學(xué)特性相一致[18]。心肌梗死后期可能由于長期應(yīng)力增加的作用使得心肌膠原的增生又以I型為主。梗死心肌粘彈性參數(shù)E2、η與I/III型膠原纖維比例失去了相關(guān)性,顯示陳舊性梗死心肌失去調(diào)節(jié)I/Ⅲ 比值的代償能力。因此,從心肌舒張能力層面可以解釋這樣一種結(jié)果,膠原纖維尤其是I型膠原的進(jìn)行性沉積是缺血性心肌病舒張功能低下的一個(gè)重要決定因素。膠原改建早期I/Ⅲ膠原比例下降增加心肌順應(yīng)性作為代償,隨后由于長期高應(yīng)力狀態(tài)下膠原組成發(fā)生變化,表現(xiàn)為I/Ⅲ型膠原比例增加,這有利于減少梗死區(qū)、減少室壁瘤形成,但卻增加了心室僵硬度,室壁舒張順應(yīng)性降低,心肌舒張能力下降。
本實(shí)驗(yàn)表明,印壓蠕變方法研究是可靠的、可行的。因此,印壓蠕變試驗(yàn)可以用于離體心肌粘彈性的檢測,印壓方法是一種直接可行的評估心室肌粘彈性的方法,具有可用于活體研究的優(yōu)勢。心肌梗死后心肌粘彈性參數(shù)改變的檢測可以從力學(xué)層面深入認(rèn)識心臟舒張功能的病理生理機(jī)制。深入認(rèn)識心肌粘彈性特性對心臟舒張功能的影響,掌握不同病變心肌粘彈性變化特點(diǎn),有助于治療策略的優(yōu)化,有針對性地調(diào)整臨床治療策略,如以降低粘性阻力為目標(biāo)的方法和藥物,可為舒張性心力衰竭的治療提供新的靶點(diǎn)。同時(shí)評估不同生理和病理狀態(tài)下舒張期心肌粘彈性特性改變,更早地檢測出心肌舒張功能異常,可以為舒張功能障礙早期診斷提供依據(jù)和新的技術(shù)、手段。
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Viscoelasticity of myocardium through indentation creep test in vitro and the analysis of its pathological mechanism
LIJin-song1,HUANGJing2,ZHANGChun-xiao3,DENGHui-sheng2,JIANGYong-hong2,ZHUQue2,YUANQiao-ying2
(1.DepartmentofCardiology,SichuanAcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople’sHospital,Chengdu610072,China; 2.InstituteofUltrasoundImaging,DepartmentofCardiology,TheSecondAffiliatedHospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China; 3.ChongQingJiaoTongUniversity,Chongqing400074,China)
HUANGJing
Objective To investigate the changes of myocardial viscoelasticity in normal and in myocardial infarction through biomechanical trial and indentation creep test,and analyze its pathological mechanism.Methods The viscoelastic characteristic parameters(E、E1、E2、η、τ)of canine test pieces from old myocardial infarction (OMI group) and normal myocardium (normal group) were detected by indentation creep test with self-made load-deformation indentation experimental facility.At the same time,the collagen content,the collagen volume fraction (CVF) and the proportion of type I and III collagen were detected.Correlation analysis between the parameters of myocardial viscoelasticity and collagen content,CVF and type I/III collagen were carried out respectively.Results The viscoelastic parameters,collagen content,CVF and the ratio of collagen type I/III in the OMI group were significantly higher than that in the normal group (P< 0.05).The highly positively correlations between the parameters of E/E1 and collagen content/CVF/collagen type I / III ratio were found (P< 0.05).The highly negatively correlations between the parameters of E2/η and collagen type I / III ratio were found (P< 0.05).Conclusion It is feasible that the indentation creep test can be used to detect the myocardium viscoelasticity.The elastic modulus and viscous resistance are increased after myocardial infarction.The proliferation and remodeling of myocardial collagen have a significant influence on myocardial viscoelasticity.
Isolated canine myocardium; Load-deformation indentation experimental facility; Indentation creep test; Myocardial viscoelasticity; Myocardial infarction; Myocardial collagen
國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號:30371361、30527001),四川省衛(wèi)生廳科研基金資助項(xiàng)目 (編號:08038)
黃 晶
R541.4;Q95-33
A
1672-6170(2016)05-0046-05
2016-04-08;
2016-06-22)