畢淮龍，喬亞茹，化文平

(陜西學(xué)前師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系，陜西西安 710100)

盾葉薯蕷中薯蕷皂苷元生物合成途徑研究進(jìn)展

畢淮龍，喬亞茹，化文平*

(陜西學(xué)前師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系，陜西西安 710100)

摘要綜述了薯蕷皂苷元生物合成途徑的研究進(jìn)展及相關(guān)酶的研究進(jìn)展，對(duì)其生物合成途徑進(jìn)行了推斷，以期為盾葉薯蕷皂苷元合成相關(guān)的研究以及利用生物工程進(jìn)行生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞盾葉薯蕷；薯蕷皂苷元；合成途徑；關(guān)鍵酶

盾葉薯蕷(DioscoreazingiberensisC.H.Wright)是薯蕷屬多年生草本植物，俗稱黃姜，是目前世界上薯蕷皂苷元含量最高的種。該物種是我國特有種，主要分布在湖北、湖南、陜西秦嶺以南、河南南部、甘肅天水以及四川等省海拔100～1 500 m的區(qū)域[1]，在湖北、陜西南部等地也有大面積的種植。盾葉薯蕷以根狀莖入藥，能祛風(fēng)、利濕，主治風(fēng)濕頑痹、腰膝疼痛等癥[2]，在《山海經(jīng)》《神農(nóng)本草經(jīng)》《圖經(jīng)本草》《本草綱目》等醫(yī)藥典籍中均有記載[3]。自20世紀(jì)40年代發(fā)現(xiàn)盾葉薯蕷根狀莖中含有豐富的薯蕷皂苷元以來，薯蕷皂苷元已被應(yīng)用于300多種避孕藥及甾體激素類藥物的合成，已成為重要的甾體激素類藥源植物[4]。筆者綜述了薯蕷皂苷元生物合成途徑及相關(guān)酶的研究進(jìn)展，以期為盾葉薯蕷皂苷元生物合成相關(guān)的研究以及利用生物工程進(jìn)行生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1薯蕷皂苷元及應(yīng)用價(jià)值

薯蕷皂苷，俗稱黃姜皂素，為螺甾烷類甾體化合物。由薯蕷皂苷元(diosgenin)(圖1)通過糖苷鍵與植物纖維素結(jié)合，在C3位通過皂苷鍵與糖鏈相連形成。皂苷在植物細(xì)胞壁中，與細(xì)胞壁緊密連接包裹。在酸、熱等條件下水解可得到薯蕷皂苷元[5]。薯蕷皂苷元在盾葉薯蕷塊莖中的含量達(dá)1.1%～16.15%。

圖1　薯蕷皂苷元化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1　Chemical structure of diosgenin

薯蕷皂苷元和甾體激素類藥物在結(jié)構(gòu)上非常相近，是合成性激素、腎上腺皮質(zhì)激素和蛋白同化激素三大類甾體激素藥物最理想的前體原料。目前以薯蕷皂苷元為原料生產(chǎn)的甾體類激素產(chǎn)品已近300種[6]，全球?qū)κ硎氃碥赵男枨罅績H次于抗生素，薯蕷皂苷元加工已成為醫(yī)藥工業(yè)中的第二大藥品生產(chǎn)領(lǐng)域。薯蕷皂苷元亦被譽(yù)為“藥用黃金”。

2薯蕷皂苷元生物合成途徑

目前對(duì)薯蕷皂苷元生物合成途徑的研究尚處于初級(jí)階段，其合成途徑中的很多步驟(或路線)，尤其是后期的步驟，尚不清晰。一般認(rèn)為，薯蕷皂苷元屬于甾醇類化合物，由三萜類化合物衍生而來。三萜類化合物在植物體中主要通過類異戊二烯生物合成途徑合成。在高等植物中萜類物質(zhì)是以5C骨架的IPP(3-isopentenyl pyrophosphate，C5)和 DMAPP(dimethylallyl pyrophosphate，C5)為前體衍生而來。在植物細(xì)胞內(nèi)存在甲羥戊酸(MVA)途徑(主要在細(xì)胞質(zhì)中)和2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(MEP)途徑(主要在質(zhì)體中)2條IPP合成途徑[7]。研究表明，植物體內(nèi)三萜類物質(zhì)(如人參皂苷等)合成的前體IPP主要來源于細(xì)胞質(zhì)中的MVA途徑[8-10]。IPP與DMAPP(IPP的同分異構(gòu)體)首尾相連逐級(jí)縮合，逐漸合成鯊烯(squalene)，經(jīng)鯊烯環(huán)氧酶(squalene epoxydase)催化合成2，3-氧化角鯊烯(2，3-oxidosqualene)，再在環(huán)阿屯醇合酶(cycloartenol synthase，CAS)的環(huán)化下生成環(huán)阿屯醇合酶(cycloartenol)；或者在羊毛甾醇合酶(lanosterol synthase)作用下生成羊毛甾醇(lanosterol)[11]。 Mehrafarin 等[12]研究認(rèn)為在植物Trigonellafoenum-graecumL.中膽固醇的合成可以由環(huán)阿屯醇或羊毛甾醇分別合成。研究表明，在Dioscoreafloribunda和Dioscoreadeltoidea中以14C- 或3H 標(biāo)記的膽固醇可以轉(zhuǎn)化為放射性標(biāo)記的薯蕷皂苷元[13-15]。隨后在D.deltoidea細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，呋喃甾醇(furostanol)是膽固醇向薯蕷皂苷元轉(zhuǎn)化合成的中間物[16]；Stohs等[17]指出膽固醇經(jīng)呋喃甾醇(furostanol)和原薯蕷皂苷元等多步轉(zhuǎn)化過程，最后合成薯蕷皂苷元。但在懸浮培養(yǎng)的D.deltoidea細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)同位素標(biāo)記的谷甾醇sitosterol也可以轉(zhuǎn)化為可放射性檢測(cè)的薯蕷皂苷元。膽固醇和谷甾醇在結(jié)構(gòu)上的差異僅在于膽固醇在側(cè)鏈C24位無烷基，而谷甾醇的側(cè)鏈C24位有一個(gè)乙基基團(tuán)；兩者都由環(huán)阿屯醇衍化而來，其中在甾醇 C24 甲基轉(zhuǎn)移酶(sterol C24-methyltransferase；SMT)作用下在C24位加一個(gè)乙基生成谷甾醇[18-19]。在植物中，膽固醇由環(huán)阿屯醇在CAS催化下生成[20]。

依據(jù)上述研究，推測(cè)盾葉薯蕷中從2，3-氧化角鯊烯到薯蕷皂苷元的生物合成可能經(jīng)過2條不同的途徑：由環(huán)阿屯醇cycolartenol在CAS或LSS催化合成的膽固醇合成薯蕷皂苷元；由谷甾醇sitosterol合成薯蕷皂苷元[21]。具體合成步驟見圖2。

注：AACT.Acetoacetyl-CoA thiolase；HMGS.3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase；HMGR.3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase；MK.Mevalonate kinase；PMK.Phosphomevalonate kinase；MVD.Mevalonate diphospate decarboxylase；IDI.Isopentenyl diphosphate isomerase；FPS.Farnesyl pyrophosphate synthase；SQS.Squalene synthase；SQE.Squalene epoxydase；CAS.Cycloartenol synthase；LSS.Lanosterol synthase；SMT.sterol C24-methyltransferase.Note：AACT.Acetoacetyl-CoA thiolase；HMGS.3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase；HMGR.3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase；MK.Mevalonate kinase；PMK.Phosphomevalonate kinase；MVD.Mevalonate diphospate decarboxylase；IDI.Isopentenyl diphosphate isomerase；FPS.Farnesyl pyrophosphate synthase；SQS.Squalene synthase；SQE.Squalene epoxydase；CAS.Cycloartenol synthase；LSS.Lanosterol synthase；SMT.Sterol C24-methyltransferase.圖2　盾葉薯蕷中薯蕷皂苷元生物合成途徑Fig.2　Synthesis route of diosgenin in D.zingiberensis

目前，薯蕷皂苷元合成途徑的前期步驟已經(jīng)明確，但自膽固醇合成薯蕷皂苷元的具體步驟尚不清晰。推測(cè)主要是通過一系列的氧化、環(huán)化等步驟完成，可能需要細(xì)胞色素P450 單加氧酶、糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶等多種酶參與[22]。

3薯蕷皂苷元生物合成途徑關(guān)鍵酶及其編碼基因

目前，對(duì)盾葉薯蕷中薯蕷皂苷元生物合成途徑中酶及其編碼基因的研究尚處于起步階段，僅有CAS、HMGR、SQS、FPS、sterol24-C-methyltransferase1(STM)等少數(shù)關(guān)鍵酶編碼基因被克隆或被驗(yàn)證其編碼蛋白功能。陳迪等[23]和涂碧夢(mèng)等[24]先后克隆得到2條環(huán)阿屯醇合酶(cycloartenol synthase，CAS)基因，并在酵母缺陷菌株中驗(yàn)證了DzCAS2基因的編碼蛋白功能。Ye等[25]從盾葉薯蕷中克隆得到鯊烯合酶(squalene synthase)基因DzSQS，并在大腸桿菌中表達(dá)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)其編碼蛋白具有鯊烯合酶活性。但Diarra等[26]研究發(fā)現(xiàn)，乙烯在顯著提高盾葉薯蕷中薯蕷皂苷元含量的同時(shí)，DzSQS的表達(dá)變化不明顯；而且環(huán)阿屯醇合酶(cycloartenol synthase，CAS)基因和甲羥戊酸(MVA)途徑HMGR基因的表達(dá)量明顯上調(diào)。Diarra等[26]推測(cè)CAS和HMGR是盾葉薯蕷中薯蕷皂苷元合成的關(guān)鍵酶。

雖然很多植物體內(nèi)甾醇、三萜類等物質(zhì)合成的前體IPP主要來源于細(xì)胞質(zhì)中的MVA途徑[8-10]，但研究表明在一些物種中MVA合成的IPP(細(xì)胞質(zhì)中)和MEP合成的IPP(質(zhì)體中)之間存在“交流”[27]。有些研究者也將研究集中在MEP通路中關(guān)鍵酶上，以期通過該類關(guān)鍵酶基因的研究明確MEP通路在薯蕷皂苷元合成中的作用。如王潤發(fā)[28]、楊婷[29]分別克隆得到盾葉薯蕷中MEP通路中的HDR基因、 1-脫氧-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶(1-Deoxy-D-xylulose5-phosphate reductoisomerase，DXR)和2-C-甲基赤蘚醇-2，4-環(huán)焦磷酸合成酶(2-C-Methy-D-erythritol2，4-cyclodiphosphate synthase，MDS)等基因的全長，并驗(yàn)證其編碼蛋白在大腸桿菌中的催化功能[28-29]。

4展望

目前關(guān)于盾葉薯蕷的研究主要集中于其有效成分薯蕷皂苷元提取技術(shù)改良、藥理作用和栽培技術(shù)等方面，關(guān)于盾葉薯蕷中薯蕷皂苷元的合成途徑研究近年來進(jìn)展較慢。但近2年關(guān)于盾葉薯蕷中薯蕷皂苷元的合成途徑中涉及酶的編碼基因研究正在興起。筆者認(rèn)為，今后關(guān)于薯蕷皂苷元合成途徑的研究主要集中在以下2個(gè)方面：① 進(jìn)一步通過基因工程手段，研究已明確的合成途徑中酶及其編碼基因在薯蕷皂苷元合成中的作用；②借鑒人參等藥用植物研究經(jīng)驗(yàn)，通過表達(dá)譜篩選等手段篩選與薯蕷皂苷元合成密切相關(guān)的、參與后期合成步驟的細(xì)胞色素P450 單加氧酶、糖基轉(zhuǎn)移酶等的編碼基因，通過基因功能的研究闡明薯蕷皂苷元生物合成路線后期可能的合成步驟。

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Research Progress of Diosgenin Biosynthesis Route ofDioscoreazingiberensisC. H. Wright

BI Huai-long, QIAO Ya-ru, HUA Wen-ping*

(Department of Biological Science and Technology, Shaanxi Normal University, Xi’an, Shaanxi 710100)

AbstractWe reviewed the research progress of diosgenin biosynthesis route of Dioscorea zingiberensis C. H. Wright, as well as the research progress of related enzymes. The biosynthetic route was deduced, which laid foundation for the research on diosgenin biosynthesis of D. zingiberensis, and its production by bioengineering.

Key wordsDioscorea zingiberensis C. H. Wright; Diosgenin; Biosynthesis route; Key enzyme

基金項(xiàng)目大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目(2015DC031，201514390767)；陜西學(xué)前師范學(xué)院基金項(xiàng)目(2013KJ033)。

作者簡介畢淮龍(1994- )，男，陜西安康人，本科生，專業(yè)：生命科學(xué)。*通訊作者，副教授，博士，從事藥用植物次生代謝調(diào)控研究。

收稿日期2016-03-30

中圖分類號(hào)R 284.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)11-142-03