管靈霞，樊婷婷，倪嬌嬌，馬文佳，曹樹青

(合肥工業(yè)大學生物與食品工程學院，安徽合肥 230009)

擬南芥PTR3基因過表達載體構建及轉基因植株的獲得

管靈霞，樊婷婷，倪嬌嬌，馬文佳，曹樹青*

(合肥工業(yè)大學生物與食品工程學院，安徽合肥 230009)

摘要[目的]構建PTR3基因的過表達載體，并建立PTR3基因過表達植株，為進一步研究PTR3基因在調控重金屬脅迫應答中的功能提供理論依據。[方法]提取野生型擬南芥總mRNA，并以反轉錄的cDNA為模板擴增出PTR3基因CDS全長，通過限制性核酸內切酶酶切、T4 DNA連接酶連接，將該基因連接到帶有35S啟動子的pBI121載體上。[結果]將重組載體轉化至農桿菌GV3101菌株，通過浸花法將重組載體轉化到野生型植株中，通過抗性篩選和遺傳鑒定獲得純合的PTR3轉基因陽性植株。[結論]PTR3過表達載體構建成功并獲得轉基因陽性植株，為研究PTR3基因的分子功能奠定基礎。

關鍵詞擬南芥；PTR3基因；過表達載體；轉基因植株

當各種不良環(huán)境因素限制植物生長和發(fā)育時，植物自身會采取一系列防御措施來增強對外界環(huán)境的適應能力[1]。土壤污染中的重金屬鎘通過作物吸收進入食物鏈累積到人體器官與組織中，對人類健康構成嚴重威脅[2]。植物修復基因工程技術是土壤重金屬鎘污染修復行之有效的方法之一，而其關鍵在于對植物耐受鎘毒害分子機制的認識及其調控其積累的關鍵基因發(fā)掘[3]。筆者所在課題組在前期工作中篩選獲得一個鎘脅迫敏感表型的cdm1突變體，在該突變體中PTR3基因功能缺失。

擬南芥PTR3基因cDNA序列全長1 749 bp，編碼一個協(xié)助轉運蛋白，為協(xié)助轉運蛋白超家族MFS成員之一。筆者通過構建PTR3過表達材料，為進一步揭示擬南芥對重金屬脅迫應答的分子機理奠定理論基礎[4-5]。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗材料。哥倫比亞野生型(Col-0)擬南芥(Arabidopsisthaliana)購于美國擬南芥種質資源中心，由合肥工業(yè)大學分子生物學實驗室繁殖所得。

1.1.2主要試劑。TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉錄試劑盒、總RNA抽提試劑盒、TaqPCR酶、限制性核酸內切酶KpnⅠ和BamHⅠ、Pusion高保真酶、T4 DNA連接酶、TIANGel MiDi Purification Kit、TIANquick MiDi Purification Kit、TIANprep MiniPlasmid kit、維生素B5、Silwet L-77、蔗糖、MES、6-BA等。

1.1.3宿主菌和載體 。大腸桿菌DH5α，農桿菌GV3101，質粒PBI121。

1.2方法

1.2.1擬南芥植株的土培。①黑土經121 ℃高溫高壓滅菌后，蛭石∶黑土∶珍珠巖按9∶3∶1的比例混合攪拌均勻，分裝到干凈的塑料花盆中。②向托盤中倒入配制好的營養(yǎng)液，待營養(yǎng)土完全浸濕后，即可播種種子。③將種子均勻撒在營養(yǎng)土表面，一般5粒種子，貼上標簽作為標記。④將托盤放于培養(yǎng)室專用培養(yǎng)架上進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：光照強度 100 μmol/(m2·s)，溫度22～24 ℃，光照時間18 h/d。⑤收種與儲存：擬南芥生長10 d左右，果莢成熟后即可剪下果莢裝入EP管并標記好材料名稱與收種日期。干燥后放于4 ℃冰箱備用。

1.2.2PTR3基因過表達載體的構建。

1.2.2.1目的基因的獲得。①根據PTR3基因的CDS序列全長分別設計特異性引物。35SPTR3-FP：NNNggtaccTTATTCAGTCTCTTTCATTTCCAC(小寫部分為KpnⅠ酶切位點)；35SPTR3-RP：NNNggatccATGACAGTAGAAGAGGTAGGA(小寫部分為BamHⅠ酶切位點)。②利用野生型cDNA為模板，用Pusion高保真酶進行PCR擴增。

1.2.2.2載體的重組。①回收目的條帶，用限制性核酸內切酶KpnⅠ/BamHⅠ進行雙酶切，同樣用KpnⅠ/BamHⅠ酶切質粒 pBI121。酶切產物經電泳檢測正確后，回收目的條帶。②用 T4 DNA 連接酶16 ℃連接過夜。③將連接產物轉入到 DH5α 大腸桿菌感受態(tài)中，用含有50 μg/mL卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基篩選陽性克隆。④挑取長勢正常的單菌落進行菌落PCR驗證，陽性菌測序正確后保存。

1.2.3浸花法轉化擬南芥。測序鑒定后，將重組載體轉化至GV3101農桿菌感受態(tài)中。用含有50 μg/mL卡那霉素和50 μg/mL慶大霉素的固體LB培養(yǎng)基篩選陽性克隆。28 ℃培養(yǎng)36～48 h，挑取單菌落進行菌落PCR驗證，用含有重組載體的農桿菌進行侵染。

轉化方法：將培養(yǎng)好的菌液加入離心管中，6 000 r/min、4 ℃ 離心5 min，棄上清。加入15 mL侵染緩沖液重懸沉淀，吹打混勻后，5 000 r/min、4 ℃離心5 min，再一次用侵染緩沖液重懸菌體直至OD600為1.0左右。將重懸好的菌液分裝至4 mL EP管中，并加入1 μL Silwet-L77，顛倒混勻。侵染花序20 s，侵染完成后，為使植株保持一定的濕度，用保鮮膜將植株包裹好，放入紙箱中避光培養(yǎng)，24 h后取下保鮮膜，放入培養(yǎng)室中培養(yǎng)，待果莢成熟后即可收種，記為T0代。

1.2.4轉基因陽性植株的獲得。將待篩選種子撒在含有50 μg/mL卡那霉素的1/2MS固體培養(yǎng)基上。春化3 d后，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 d左右，其中顏色變綠并長出真葉和根的幼苗為陽性苗，將變綠的幼苗移栽至營養(yǎng)土中進行培養(yǎng)，果莢成熟后收取種子，記為T1代。對種子進一步篩選鑒定，即可獲得轉基因純合株系。T2代種子再用卡那霉素進行鑒定分離比，選取卡那霉素耐受的T2純合體進行后續(xù)試驗。

2結果與分析

2.1擬南芥PTR3基因的擴增選取在營養(yǎng)土中生長28 d的野生型擬南芥幼苗，提取野生型擬南芥總RNA，反轉錄成cDNA。以cDNA為模板擴增出PTR3基因片段，電泳檢測結果見圖1。由圖1可知，擴增后的條帶大小正確。

圖1　PCR擴增目的片段電泳圖譜Fig.1　PCR amplified target fragment electrophoresis

2.2PTR3基因過表達載體的連接與轉化提取pBI121過表達菌株的質粒，將pBI121質粒與PTR3基因進行雙酶切，電泳檢測結果見圖2。將雙酶切后的pBI121質粒與PTR3基因進行回收，用T4連接酶過夜連接，然后轉化至DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞中，篩選陽性單克隆。挑取正常單克隆進行菌落PCR鑒定并電泳檢測，結果見圖3。由圖3可知，挑選的大部分單菌落均為陽性菌，且擴增后的條帶大小正確。

圖2　pBI121質粒和PTR3基因酶切前后電泳圖譜Fig.2　pBI121 plasmid and PRT3 before and after enzyme digestion electrophoresis

圖3　PTR3基因過表達菌落PCR電泳圖譜Fig.3　PTR3 over expression colony PCR electrophoresis

任意選取一個陽性菌株進行測序，將測序結果與Tair網站上提供的PTR3基因CDS序列進行比對，比對結果正確，表明PTR3基因過表達載體構建成功。

2.3轉基因陽性植株的獲得

2.3.1浸花法侵染擬南芥。將構建好的PTR3過表達載體通過電轉化法轉化至農桿菌GV3101感受態(tài)中，用含有50 μg/mL卡那霉素和50 μg/mL慶大霉素的LB固體培養(yǎng)基篩選陽性克隆。選取轉化成功的陽性農桿菌進行侵染，待種子成熟后收種，收獲的種子標記為T0代。

2.3.2轉基因陽性植株的鑒定及篩選。將春化后的T0代種子撒至含有50 μg/mL卡那霉素的1/2 MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)12 d。只有轉化成功的擬南芥植株才能長出真葉與根，轉化失敗的擬南芥葉片會變黃且未能長出真葉與根。因此，挑選長出真葉與根的幼苗進行移栽。PTR3過表達植株抗性篩選結果見圖4，選取圖4中紅色箭頭標記的植株進行移栽培養(yǎng)。

圖4　PTR3過表達植株抗性篩選Fig.4　PTR3 over expression plant resistance screening

移栽后培養(yǎng)至21 d左右時，提取PTR3轉基因植株的DNA，在基因組水平上檢測PTR3基因的表達水平。選取PTR3過表達載體的上下游引物進行PCR鑒定，結果見圖5。由圖5可知，PTR3過表達載體已成功轉化至擬南芥野生型植株中。

圖5　轉基因植株鑒定電泳圖譜Fig.5　Transgenic plants identified electrophoresis

將陽性植株單株收種子后標記為T1代，將T1代種子再次繁殖并單株收種，標記為T2代。用含有50 μg/mL卡那霉素的1/2 MS培養(yǎng)基進行篩選，選擇耐受純合體的株系，選擇對應單插入的陽性擬南芥植株進行后續(xù)試驗。

3結論與討論

土壤重金屬會通過作物吸收進入食物鏈累積到人體器官和組織中，對人類健康構成嚴重威脅。由于重金屬不能被生物降解，在土壤中很難遷移，且不易被植物吸收利用[6]。因此，重金屬污染會對人類產生嚴重危害。隨著一些抗逆基因的抗逆機理被不斷深入研究，利用轉基因技術可以將外源抗逆基因轉入植物基因組中，利用該技術提高植物抗逆性，在改良作物遺傳性狀以及培育農作物優(yōu)良品系等方面具有廣闊的應用前景[7-8]。

前期研究結果顯示，功能缺失型突變體cdm1在鎘脅迫下與WT相比表現(xiàn)出更加敏感的特性，進一步研究發(fā)現(xiàn)PTR3基因還能被鎘誘導表達。這表明PTR3基因可能參與鎘脅迫應答。PTR3基因過表達植株的獲得將有利于研究植物對重金屬脅迫應答的響應機制，為改善土壤重金屬污染提供理論依據。

參考文獻

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[8] 吳福彪．基因工程與植物的遺傳改良[J]．生物學通報，2010，45(5)：7-10．

Construction ofPTR3 Over-expression Carrier and Identification of Transgenic Lines inArabidopsisthaliana

GUAN Ling-xia, FAN Ting-ting, NI Jiao-jiao, CAO Shu-qing*et al

(School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei, Anhui 230009)

Abstract[Objective] The aim was to construct PTR3 over-expression vector and generate PTR3 over-expression transgenic lines, provide basis for further research functions of PTR3 in response to heavy metal stress. [Method] Total mRNA was extracted from wild Arabidopsis thaliana and employed in a reverse transcription. The CDS fragment of PTR3 gene was amplified by PCR. Using restriction endonuclease and T4 DNA ligase, the CDS fragment was subsequently cloned into pBI121 vector. [Result] The recombinant plasmid was transformed into Agrobacterium GV3101 cells. Wild type plants were then infiltrated using floral-dip method and screened to isolate the desired transgenic lines. [Conclusion] PTR3 over-expression vector was constructed successfully, and transgenic plants were obtained. These works will lay a foundation for further studies.

Key wordsArabidopsis thaliana; PTR3; Over-expression vector; Transgenic lines

作者簡介管靈霞(1991- )，女，安徽合肥人，碩士研究生，研究方向：基因工程。*通訊作者，教授，博士，博士生導師，從事分子生物學研究。

收稿日期2016-03-16

中圖分類號S 188

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)11-129-03