黃宇祥，徐 博，姜洪甲，邢世東，鄧貴義，劉 娥，孫 羽

(丹東農(nóng)業(yè)科學(xué)院，遼寧丹東 118109)

烤煙抗連作有益菌的篩選及其對烤煙的促生長作用

黃宇祥，徐 博，姜洪甲，邢世東，鄧貴義，劉 娥，孫 羽

(丹東農(nóng)業(yè)科學(xué)院，遼寧丹東 118109)

摘要[目的]從煙草根際篩選出具有克服連作障礙功能的目標(biāo)微生物，研究目標(biāo)微生物與煙草根際、病原菌、植株的互作效應(yīng)。[方法]從不同煙田土壤中篩選出對克服煙草連作障礙具有顯著作用的菌株，將目標(biāo)微生物以拌母床土、拌假植土、蘸根假植的方式接種到煙株根系，采用小區(qū)試驗觀測煙株自然發(fā)病率和病情指數(shù)。[結(jié)果]A1+B1復(fù)合有益菌處理對靶斑病和角斑病的抑制效果均好于單一菌種處理。這可能是因為A1菌的主要功能是降解煙株分泌的自毒物質(zhì)，B1菌的主要功能是拮抗病原菌，不同功能的2種菌復(fù)合處理能夠在功能上互相扶持，彌補(bǔ)單一菌種功能的不足。[結(jié)論]該研究可為今后在丹東地區(qū)烤煙生產(chǎn)中利用有益微生物菌劑緩解烤煙連作障礙與減輕煙葉病害提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞烤煙；連作；自毒物質(zhì)；降解菌；拮抗菌

丹東煙區(qū)耕地面積有限，煙葉生產(chǎn)無法安排合理的輪作，不可避免地長期存在煙田連作現(xiàn)象，嚴(yán)重影響煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，連作障礙已成為影響丹東烤煙生產(chǎn)發(fā)展和煙葉品質(zhì)的重要因素。煙草是最容易發(fā)生連作障礙的作物之一，其原因與自毒作用有關(guān)。目前，已經(jīng)從煙草根系分泌物中分離出許多自毒物質(zhì)，其中大多為酚酸類化合物[1～3]，其中以對羥基苯甲酸的自毒作用最強(qiáng)。這些物質(zhì)通過影響細(xì)胞膜透性、酶活性、離子吸收和光合作用等各種途徑來影響煙草生長[4，5]。為了進(jìn)一步提高丹東煙葉的質(zhì)量和工業(yè)可利用率，筆者從丹東煙田土壤篩選對羥基苯甲酸降解菌，研究其田間應(yīng)用效果，旨在為緩解因連作給丹東烤煙生產(chǎn)帶來的危害提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試材料

1.1.1培養(yǎng)基。①無機(jī)鹽培養(yǎng)基：NH4NO31.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、(NH4)2SO40.5 g、KH2PO40.5 g、NaCl 0.5 g、K2HPO41.5 g、蒸餾水 1 000 mL、對羥基苯甲酸分別為1.0～4.0 g，調(diào)節(jié)pH至7.0。②高氏一號培養(yǎng)基：可溶性淀粉 20 g、KNO31 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、瓊脂20 g、蒸餾水 1 000 mL；pH 7.4～7.6；加入重鉻酸鉀母液，并使其在培養(yǎng)基內(nèi)的濃度為20 mg/L，抑制細(xì)菌與真菌的生長。③馬丁氏培養(yǎng)基：KH2PO410 g、MgSO4·7H2O 5 g、蛋白胨 5 g、葡萄糖 10 g、瓊脂 15～20 g、蒸餾水1 000 mL，pH 自然。加入0.1 mL/L的阿米卡星，抑制細(xì)菌和放線菌的生長。各種抑制劑均在紫外線下滅菌50 min，培養(yǎng)基冷卻至50～60 ℃時，在超凈工作臺中放入抑制劑溶液中，搖勻。

1.1.2篩選菌株土樣。取自丹東地區(qū)煙田土壤。

1.2試驗方法

1.2.1土壤樣品的采集。采用5點(diǎn)取樣法，取0～20 cm耕層土壤，每點(diǎn)取500 g土壤樣品。

1.2.2酚酸降解菌的篩選及初步鑒定。采用富集培養(yǎng)的馴化方法，取煙田土壤5 g，接種于含有1.0 g/L PA的100 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，無菌膜封口，30 ℃搖床170 r/min，培養(yǎng)7 d后，取10 mL培養(yǎng)液接種于含有2.0 g/L PA的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，按此依次提高培養(yǎng)基中PA濃度為3.0和4.0 g/L，然后進(jìn)行平板涂布，將培養(yǎng)皿放于30 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，挑取單菌落，純化培養(yǎng)。根據(jù)鏡檢和菌落生長情況，對菌種進(jìn)行初步鑒定，并根據(jù)菌株生長狀況，篩選降解PA能力較強(qiáng)的菌株保存。

1.2.3靶斑病拮抗菌的篩選及初步鑒定。采用對峙培養(yǎng)法，在PDA平板中央接種煙草靶斑病病原菌，四周等距離2 cm處點(diǎn)接種，利用高氏一號培養(yǎng)基和馬丁氏培養(yǎng)基篩選出的放線菌和真菌，空白對照不接篩選菌株。根據(jù)鏡檢和菌落生長情況，對靶斑病拮抗菌進(jìn)行初步鑒定。根據(jù)各篩選菌菌落邊緣與病原菌菌落邊緣之間的抑菌帶寬度確定拮抗程度。挑選拮抗靶斑病病原菌能力較強(qiáng)的菌株保存。

1.2.4有益菌菌劑的制備。菌株液體培養(yǎng)后利用稻殼粉吸附最終菌株的數(shù)量達(dá)到約108CFU/g，復(fù)合菌先單獨(dú)制成菌劑后再進(jìn)行復(fù)配，復(fù)配比例為1∶1，復(fù)配的最終菌株的數(shù)量達(dá)到約108CFU/g。

1.2.5有益菌施用方式研究。試驗采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，3次重復(fù)，3行區(qū)，株距0.5 m，行距1.2 m，行長5 m，小區(qū)面積18 m2。試驗以3個施用方式(拌母床土、拌母床土+蘸根假植、拌假植土)和3種有益菌處理(自毒物質(zhì)降解菌A1、靶斑病拮抗菌B1、A1+B1組合)，共設(shè)置9個處理，以不施用有益菌為對照。

2結(jié)果與分析

2.1有益菌的篩選2013年在寬甸和鳳城部分煙區(qū)采集的土壤樣品中分離篩選出有益菌。由表1可知，其中篩選出降解PA效果較好的有4株，其中A1的降解能力最強(qiáng)；對靶斑病拮抗效果較好的有3株，其中B1的拮抗能力最強(qiáng)。制成菌劑后，用于2014年田間試驗。

2.2有益菌施用方式研究

2.2.1有益菌拌母床土出苗情況調(diào)查。有益菌拌母床土在2個試驗點(diǎn)出苗情況比較一致。其中，A1菌拌母床土出苗情況最好，與CK處理的出苗時間基本一致；A1+B1復(fù)合菌處理出苗情況次之；B1處理出苗時間較晚，與CK處理相比要晚5～7 d。這可能是因為B1菌拌母床土施用時，母床適宜的溫濕度有利于其繁殖，而B1菌在快速繁殖時會產(chǎn)生一些促進(jìn)植物的生長的類似植物激素類的物質(zhì)，但是這類物質(zhì)濃度過大時反而會起到抑制作用。因此，這是造成有B1菌拌母床土?xí)r出苗時間晚于CK的原因。

2.2.2不同處理對靶斑病發(fā)病率的影響。從表1可以看出，在不同施用方式、不同有益菌2因素處理中，W9處理的平均發(fā)病率最低，為9.34%，比CK處理降低6.12個百分點(diǎn)。這與不同施用方式與不同有益菌處理單獨(dú)分析結(jié)果相一致，最佳施用方式與最佳菌種組合處理的W9處理發(fā)病率最低。

2.2.3不同處理對靶斑病情指數(shù)的影響。從表2可以看出，2個試驗點(diǎn)各個時期不同施用方式的靶斑病的病情指數(shù)存在顯著差異。其中最低的為拌假植土處理，尤其是在8月22日，與其余2種施用方式及CK處理相比有顯著差異。其余2種施用方式之間以及與CK處理間沒有顯著差異。3種不同有益菌處理間平均病情指數(shù)最低的為A1+B1復(fù)合菌處理，但是3種不同有益菌處理與CK處理相比病情指數(shù)沒有顯著差異。

表1　不同處理靶斑病發(fā)病率的比較

從表3可以看出，不同施用方式不同有益菌兩因素處理中，兩個試驗點(diǎn)各個時期不同處理間靶斑病病情指數(shù)存在顯著差異，其中大堡8月1日和8月22日不同處理的病情指數(shù)存在極顯著差異。青椅山試驗點(diǎn)W9和W7處理的病情指數(shù)較低，大堡試驗點(diǎn)W7和W8處理的病情指數(shù)較低。這說明拌假植土的3種處理對靶斑病有一定的抑制效果。

表2　不同施用方式及不同有益菌處理靶斑病病情指數(shù)的比較

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；同列不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note：Different lowercases in the same column stand for significant difference(P<0.05)；different capital letters stand for extremely significant difference(P<0.01).

2.2.4不同處理對角斑病病情指數(shù)的影響。從表4可以看出，不同施用方式中，大堡試驗點(diǎn)8月22日與9月5日單獨(dú)拌母床土與拌母床土+蘸根角斑病病情指數(shù)均極顯著低于CK處理，但這2種施用方式間病情指數(shù)沒有顯著差異。不同有益菌處理中，大堡試驗點(diǎn)8月22日與9月5日A1+B1復(fù)合菌處理病情指數(shù)均最低，與CK處理相比均有顯著差異。

表3　不同處理靶斑病病情指數(shù)的比較

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；同列不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note：Different lowercases in the same column stand for significant difference(P<0.05)；different capital letters stand for extremely significant difference(P<0.01).

表4　不同施用方式及不同有益菌處理角斑病病情指數(shù)的比較

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；同列不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note：Different lowercases in the same column stand for significant difference(P<0.05)；different capital letters stand for extremely significant difference(P<0.01).

從表5可以看出，不同施用方式、不同有益菌2因素處理中，大堡試驗點(diǎn)各個時期不同處理角斑病病情指數(shù)存在極顯著差異，平均病情指數(shù)最低的是W4處理，該處理在大堡8月22日與9月5日調(diào)查數(shù)據(jù)中與CK存在極顯著差異。

表5　不同處理角斑病病情指數(shù)的比較

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；同列不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note：Different lowercases in the same column stand for significant difference(P<0.05)；different capital letters stand for extremely significant difference(P<0.01).

3結(jié)論

該試驗結(jié)果表明有益菌在田間不同施用方式中對靶斑病的抑制效果以拌假植土最好；對角斑病的抑制效果以拌母床土+蘸根和單獨(dú)拌母床土施用時為最好。拌母床土+蘸根和單獨(dú)拌母床土2種施用方式靶斑病和角斑病病情指數(shù)相當(dāng)，說明蘸根施用作用不明顯，其可能原因為蘸根處理時由于接種量比較少，未能有效在煙苗根系周圍形成優(yōu)勢菌群。

A1+B1復(fù)合有益菌處理的對靶斑病與角斑病的抑制效果均好于單一菌種處理，這可能是由于A1菌主要功能為降解煙株分泌的自毒物質(zhì)，B1菌的主要功能為拮抗病原菌，2種不同功能的菌復(fù)合處理能夠在功能上互相扶持，彌補(bǔ)單一菌種功能的不足。

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Screening of the Beneifcial Bacteirum to Tobacco Anti-continuous Cropping and the Effect of Its Growth-promoting

HUANG Yu-xiang, XU Bo, JIANG Hong-jia et al

(Dandong Academy of Agricultural Sciences, Dandong, Liaoning 118109)

Abstract[Objective] The aim was to screen out target microorganisms with function of overcoming continuous cropping obstacles from the tobacco Rhizosphere, study interaction effect between microorganisms and tobacco Rhizosphere, pathogenic bacteria and plants. [Method] The strains with significant effects of overcoming continuous cropping obstacles were selected, the target microorganisms were innoculated on tobacco roots through ways of mixed with primary bed soil, mixed with temporary soil, root dipping and heeling in, the morbidity and disease index of tobacco was observed by plot experiment. [Result] A1+B1 composite beneficial bacterium’ inhibition effect on target spot and angular leaf spot was better than single bacteria. The main function of A1 bacteria was to degrade auto-toxic substances secreted by tobacco plants, and the main function of B1 bacteria was to prevent pathogenic bacteria. Different functions of two bacterium could make up for the deficiency of single bacteria function. [Conclusion] The study can provide theoretical basis for using beneficial bacterium in continous cropping tobacco field in Dandong and reduce tobacco leaf disease.

Key wordsFlue-cured tobacco; Continuous cropping; Auto-toxic chemicals; Degrading bacteria; Antaganistic bacteria

作者簡介黃宇祥(1981- )，男，遼寧鳳城人，研究實習(xí)員，碩士，從事植物營養(yǎng)研究。

收稿日期2016-03-15

中圖分類號S 572

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611(2016)11-026-03