楊坤祥，王芬芳，鐘澤艷

(惠州市第一婦幼保健院檢驗(yàn)科，廣東惠州 516003)

·臨床研究·

應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)探討B(tài)群鏈球菌與胎膜早破的關(guān)系*1

楊坤祥，王芬芳，鐘澤艷

(惠州市第一婦幼保健院檢驗(yàn)科，廣東惠州 516003)

摘要:目的探討應(yīng)用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)檢測B群鏈球菌與胎膜早破之間的關(guān)系。方法將300例發(fā)生胎膜早破的孕婦設(shè)為研究組，300例未發(fā)生胎膜早破的孕婦設(shè)為對照組，采集孕婦宮頸分泌物，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法和細(xì)菌培養(yǎng)法檢測B群鏈球菌。結(jié)果對照組宮頸分泌物檢測B群鏈球菌陽性率為7.00%(21/300)；研究組宮頸分泌物檢測B群鏈球菌陽性率為20.00%(60/300)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測B群鏈球菌陽性率為13.50%(81/600)；顯色細(xì)菌培養(yǎng)法檢測B群鏈球菌陽性率為10.00%(60/600)；傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)法檢測B群鏈球菌陽性率6.67%(40/600)。結(jié)論圍生期孕婦生殖道B群鏈球菌感染與胎膜早破的關(guān)系密切，應(yīng)加強(qiáng)孕晚期B群鏈球菌的篩查，降低發(fā)生胎膜早破的風(fēng)險(xiǎn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測B群鏈球菌的陽性率明顯高于細(xì)菌培養(yǎng)法，且用時(shí)短，準(zhǔn)確度高。盡早檢出B群鏈球菌感染有可能降低或預(yù)防胎膜早破的發(fā)生。

關(guān)鍵詞:聚合酶鏈反應(yīng)；B群鏈球菌；胎膜早破

B群鏈球菌(GBS)學(xué)名為無乳鏈球菌，能引起牛乳房炎，嚴(yán)重危害畜牧業(yè)。現(xiàn)發(fā)現(xiàn)該菌也能感染人類，尤其是新生兒，可引起敗血癥、腦膜炎、肺炎等，病死率極高，并可產(chǎn)生神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，被醫(yī)學(xué)界重視。GBS正常寄居于下呼吸道、泌尿生殖道和直腸，帶菌率達(dá)30%，健康人的鼻咽部也可分離到GBS。新生兒感染跟母體帶菌有密切關(guān)系，分娩時(shí)胎兒可經(jīng)帶菌產(chǎn)道而被感染，也可由醫(yī)護(hù)人員呼吸道所帶病菌傳播引起[1]。國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道，圍生期孕婦GBS感染率為3.4%～19.01%，新生兒感染率1.40%～9.95%[2-5]。感染率的不同可能與國家地區(qū)、種族基因、年齡、教育程度、培養(yǎng)技術(shù)及培養(yǎng)頻率不同有關(guān)。本研究對300例未發(fā)生胎膜早破的孕婦(對照組)和300例發(fā)生胎膜早破的孕婦(研究組)采取3種篩查方式，研究GBS與胎膜早破之間的關(guān)系，旨在盡早篩查出圍產(chǎn)期孕婦的GBS感染情況，以期降低胎膜早破的發(fā)生率?，F(xiàn)將具體過程及結(jié)果報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料將2015年1～8月到本院住院分娩的600例孕婦設(shè)定為研究對象，將發(fā)生胎膜早破的300例孕婦設(shè)為研究組，未發(fā)生胎膜早破的產(chǎn)婦300例設(shè)為對照組。全部孕婦在自愿并完全了解檢測目的與研究目的的前提下參與本次研究。

1.2儀器和試劑美國ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀；上海力申公司HF90/hf240 CO2培養(yǎng)箱；法國生物梅里埃VITEK2-compact分析儀；GBS核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)、陰陽性對照均由福建泰普生物科學(xué)有效公司提供；哥倫比亞血瓊脂平板由江門凱林有限公司提供；GBS顯色平板由鄭州安圖生物有限公司提供；馬尿酸鈉生化微量管由杭州天河微生物試劑公司提供；采用金黃色葡萄球菌(ATCC29523)作為質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌種，來自衛(wèi)生部臨檢中心。

1.3診斷標(biāo)準(zhǔn)胎膜早破的定義參照全國高等醫(yī)學(xué)院校教材《婦產(chǎn)科學(xué)》中有關(guān)診斷定義[6]。孕婦符合下列之一即可診斷為胎膜早破：(1)孕婦自覺有大量液體自陰道流出；(2)酸堿試紙測定陰道分泌物pH>7；(3)陰道液涂片烘干后鏡檢可見羊齒狀結(jié)晶；(4)陰道液沉渣涂片鏡檢可見毳毛。

1.4方法

1.4.1標(biāo)本采集按照GBS核酸檢測試劑盒標(biāo)本采集要求，孕婦取膀胱截石位，常規(guī)消毒外陰，滅菌窺陰器擴(kuò)開陰道暴露宮頸，用棉球擦去宮頸口黏液，分別將3支無菌長棉簽分別插入宮頸口內(nèi)1.5～2.0 cm，轉(zhuǎn)動(dòng)1圈停留30 s后，取宮頸分泌物置無菌試管中立即送檢。將其中一支按以上方法采集的宮頸分泌物標(biāo)本按臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)常規(guī)方法(以下稱為“傳統(tǒng)培養(yǎng)法”)接種于哥倫比亞血平板進(jìn)行培養(yǎng)；另一只宮頸分泌物標(biāo)本接種于B群鏈球菌顯色平板(以下簡稱為“顯色培養(yǎng)法”)進(jìn)行培養(yǎng)，兩個(gè)平板都置于35 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱，孵育24 h后觀察血平板上的菌落形態(tài)及β溶血現(xiàn)象和顯色平板的顯色情況，發(fā)現(xiàn)可疑菌落后進(jìn)行觸酶試驗(yàn)、CAMP試驗(yàn)和馬尿酸鈉水解試驗(yàn)，最后用VITEK2-compact分析儀確證鑒定。

1.4.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)檢測將其中一支宮頸分泌物標(biāo)本按試劑盒要求提取分泌物中細(xì)菌的DNA(以下簡稱為熒光PCR法)，上清液用于PCR擴(kuò)增，在ABI7500 PCR擴(kuò)增儀上按下列循環(huán)參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)：stage 1，37 ℃，2 min；stage 2，94 ℃，2 min；stage 3,94 ℃，15 s，55 ℃，45 s；共40個(gè)循環(huán)，在stage 3，55 ℃，45 s末端收集熒光，反應(yīng)體積50 μL。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，3種檢驗(yàn)方法檢測結(jié)果分別按配對設(shè)計(jì)下兩組頻數(shù)分布的χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比對，對照組和研究組GBS陽性發(fā)生率按完全隨即設(shè)計(jì)下兩組頻數(shù)分布的χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比對。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.13種檢驗(yàn)方法檢測GBS陽性率比較對照組和研究組共600例產(chǎn)婦中，熒光PCR法GBS陽性數(shù)81例，篩查陽性率為13.50%；顯色培養(yǎng)法GBS陽性數(shù)60例，篩查陽性率為10.00%；傳統(tǒng)培養(yǎng)法GBS陽性數(shù)40例，篩查陽性率為6.67%。3種檢驗(yàn)方法檢測結(jié)果兩兩之間GBS陽性率比較采用Fisher精確檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)校正為0.017(α=0.05/3=0.017)?？梢哉J(rèn)為3種方法檢驗(yàn)出GBS的陽性概率不相等，且熒光PCR法檢測GBS篩查陽性率高于顯色培養(yǎng)法和傳統(tǒng)培養(yǎng)法，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.017)。見表1。

2.2對照組和研究組的B群鏈球菌檢測結(jié)果由于熒光PCR法的檢測陽性率和準(zhǔn)確率都比顯色培養(yǎng)法和傳統(tǒng)培養(yǎng)法要高，所以選用熒光PCR法的檢測結(jié)果作為參考標(biāo)準(zhǔn)。對照組300例產(chǎn)婦中，GBS檢出21株，陽性率為7.00%；研究組300例產(chǎn)婦中，GBS檢出60株，陽性率為20.00%。故發(fā)生胎膜早破的產(chǎn)婦的GBS陽性率高于未發(fā)生胎膜早破的產(chǎn)婦，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=27.708，P=0.000)。

表1　　3種GBS檢驗(yàn)方法結(jié)果比較[n(%)]

3討論

本研究結(jié)果顯示，熒光PCR法檢測GBS的篩查陽性率(13.50%)高于細(xì)菌培養(yǎng)法(10.00%和6.67%)，檢測結(jié)果高于王麗等[7]報(bào)道的9.40%和5.80%。3種方法在GBS陽性檢出率上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.017)，且熒光PCR法的陽性檢出率高于細(xì)菌培養(yǎng)法。另一方面，熒光PCR法用時(shí)短，平均7 h可以完成檢測，而細(xì)菌培養(yǎng)法要平均48 h才能完成檢測，可為盡早診斷提供依據(jù)，爭取寶貴的治療時(shí)間。

研究結(jié)果顯示，胎膜早破組宮頸分泌物GBS陽性檢出率為20.00%，未發(fā)生胎膜早破組宮頸分泌物GBS陽性檢出率為7.00%，本研究結(jié)果低于李小梅等[8]報(bào)道的29.59%和11.93%，也低于李曉英等[9]報(bào)道的為29.3%和11.7%，可能跟地區(qū)差異、試驗(yàn)方法，采樣水平等有關(guān)。本研究中，發(fā)生胎膜早破的產(chǎn)婦的GBS陽性檢出率高于未發(fā)生胎膜早破的產(chǎn)婦，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明GBS在生殖道內(nèi)過量繁殖是圍產(chǎn)期孕婦發(fā)生胎膜早破的誘因之一，GBS與胎膜早破的關(guān)系十分密切，完整的胎膜對病原體的入侵具有屏障作用，若胎膜受到感染，往往會導(dǎo)致胎膜早破。在感染的眾多病原體中，由于GBS對絨毛膜的吸附和穿透能力最強(qiáng)，所以危害也最大。寄居在宮頸、陰道、直腸和尿道等處的GBS可上行至胎膜，從而使胎膜感染，并可以通過炎性細(xì)胞的吞噬作用和細(xì)菌產(chǎn)生的蛋白水解酶的直接入侵，使胎膜局部張力降低，從而導(dǎo)致胎膜早破[10-12]。

近年來，世界各地學(xué)者對GBS進(jìn)行大量研究，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為GBS與圍生期感染有關(guān)，在孕晚期對所有孕婦進(jìn)行篩查非常必要。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好、用時(shí)短等特點(diǎn)，適合在醫(yī)院進(jìn)行GBS的篩查，特別是對于已發(fā)生胎膜早破的孕婦，應(yīng)盡早完成檢測，及時(shí)進(jìn)行預(yù)防性治療。

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△通訊作者,E-mail：haoxkg@fmmu.edu.cn。

*基金項(xiàng)目：惠州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(20150806)。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.10.035

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)10-1387-02

(收稿日期：2016-01-09)