唐　菁，曲麗梅，曹維斌，李篤軍△

(山東省煙臺(tái)業(yè)達(dá)醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.血液腫瘤科，山東煙臺(tái) 264006)

·論著·

非甾體類抗炎藥阿司匹林、吲哚美辛對(duì)胃癌MGC803細(xì)胞的抑制作用研究

唐菁1，曲麗梅1，曹維斌2，李篤軍1△

(山東省煙臺(tái)業(yè)達(dá)醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.血液腫瘤科，山東煙臺(tái) 264006)

摘要:目的探討非甾體類抗炎藥阿司匹林(ASP)、吲哚美辛(Indo)促進(jìn)胃癌MGC803細(xì)胞凋亡、抑制增殖的作用和機(jī)制。方法細(xì)胞增殖檢測(cè)(MTT)法檢測(cè)ASP、Indo對(duì)MGC803細(xì)胞增殖的影響；流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)ASP、Indo對(duì)MGC803細(xì)胞凋亡的影響；細(xì)胞免疫化學(xué)方法檢測(cè)ASP、Indo對(duì)MGC803細(xì)胞表達(dá)C反應(yīng)蛋白(CRP)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)的影響。結(jié)果與對(duì)照組相比，ASP、Indo對(duì)MGC803細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用及促進(jìn)MGC803細(xì)胞凋亡的作用；MGC803細(xì)胞高表達(dá)CRP、IL-6，ASP、Indo能下調(diào)MGC803細(xì)胞CRP、IL-6的表達(dá)水平。結(jié)論非甾體類抗炎藥ASP、Indo對(duì)胃癌MGC803細(xì)胞具有抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用，并能下調(diào)MGC803細(xì)胞中CRP、IL-6的表達(dá)。

關(guān)鍵詞:阿司匹林；吲哚美辛；腫瘤細(xì)胞增殖；CRP；IL-6

多年來，在應(yīng)用手術(shù)、放化療及生物治療等方法治療腫瘤的同時(shí)，科學(xué)研究也在不斷地開發(fā)新的抗腫瘤藥物。阿司匹林(ASP)、吲哚美辛(Indo)是常用的非甾體類抗炎藥(NSAIDs)，流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期規(guī)律的服用NSAIDs可以明顯降低腫瘤的發(fā)生及延緩腫瘤的發(fā)展[1-2]。并且，研究發(fā)現(xiàn)，NSAIDs的抑癌機(jī)制可以分為環(huán)氧化酶-2(COX-2)依賴型和非環(huán)氧化酶-2依賴型[3]。C反應(yīng)蛋白(CRP)、白介素-6(IL-6)作為炎性細(xì)胞因子，可通過自分泌、旁分泌或相關(guān)聯(lián)動(dòng)效應(yīng)來促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移[4-5]。本研究通過觀察ASP、Indo對(duì)胃癌細(xì)胞株MGC803增殖、凋亡的影響，同時(shí)檢測(cè)CRP、IL-6的表達(dá)變化，為臨床應(yīng)用NSAIDs在胃癌方面的治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1資料與方法

1.1細(xì)胞株與主要試劑人胃癌細(xì)胞株MGC803由濱州醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。ASP、Indo購自上海如吉生物科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品。細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM)、胰蛋白酶為Gibco公司產(chǎn)品，青霉素、鏈霉素購自山東魯抗制藥公司。MTT系Promega公司產(chǎn)品。PI試劑盒購自美國Sigma公司產(chǎn)品，Rabbit Anti-CRP單克隆抗體及Rabbit Anti-IL-6單克隆抗體，均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。DAB顯色試劑盒系北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2MTT法檢測(cè)ASP、Indo對(duì)MGC803細(xì)胞增殖的影響[6]取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MGC803細(xì)胞(5×104/mL)，接種于96孔板，37 ℃、5%CO2孵箱孵育過夜后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分別加入不同濃度的ASP、Indo，作用終質(zhì)量濃度分別為ASP 2、4、8、10 mmol/L；Indo 200、400、800、1 000 μmol/L；對(duì)照組加10%小牛血清DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，終止培養(yǎng)前4 h加入MTT(5 mg/mL)，4 h后置酶標(biāo)儀下測(cè)定光密度(OD)值，以570 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，630 nm為參考波長(zhǎng)，以570～630 nm計(jì)算OD值。

1.3PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MGC803細(xì)胞凋亡[7]取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MGC803細(xì)胞(5×104/mL)，實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組、8 mmol/L ASP組、800 μmol/L Indo組共3個(gè)組別，每組各6瓶細(xì)胞，孵箱內(nèi)細(xì)胞培育48 h后終止培養(yǎng)，以0.25%的胰酶消化后，每組分別制成單細(xì)胞懸液，各收集細(xì)胞數(shù)目約(1～5)×106個(gè)，500～1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液；3 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1次，離心去PBS；加入冰預(yù)冷的70%乙醇固定，4 ℃，過夜；離心棄去固定液，3 mL PBS重懸5 min；400目的篩網(wǎng)過濾1次，500～1 000 r/min離心5 min，棄去PBS；用1 mL PI染液染色，4 ℃避光30 min；流式細(xì)胞儀檢測(cè)：PI用氬離子激發(fā)熒光，激光光波波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射光波波長(zhǎng)大于630 nm，產(chǎn)生紅色熒光分析PI熒光強(qiáng)度的直方圖，也可分析前散射光對(duì)側(cè)散射光的散點(diǎn)圖。

1.4免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)MGC803細(xì)胞中CRP、IL-6表達(dá)變化[8]取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MGC803細(xì)胞(1×105/mL)，接種于放有蓋玻片的24孔培養(yǎng)板，2 mL/孔，實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組、8 mmol/L ASP組、800 μmol/L Indo組共3個(gè)組別，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，孵箱內(nèi)細(xì)胞培育48 h后終止培養(yǎng)。取出細(xì)胞玻片，PBS洗5 min，洗3次，4%多聚甲醛固定，4 ℃，過夜，蒸餾水洗5 min，洗3次，按文獻(xiàn)[9]滅活內(nèi)源性過氧化物酶和免疫細(xì)胞化學(xué)染色，用Leica DM 4000B顯微鏡拍照，并通過Leica QwinV3分析軟件進(jìn)行染色結(jié)果的灰度值掃描分析，蛋白表達(dá)強(qiáng)弱與灰度值成反比。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，分析方法包括t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)和Pearson線性相關(guān)分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1ASP、Indo對(duì)MGC803細(xì)胞增殖的影響結(jié)果顯示，不同濃度的ASP、Indo作用于MGC803細(xì)胞48 h后，對(duì)MGC803細(xì)胞具有增殖抑制作用，其中ASP 4、8、10 mmol/L,Indo 400、800、1 000 μmol/L組與未用藥對(duì)照組相比增殖抑制作用明顯，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

2.2ASP、Indo對(duì)MGC803細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，MGC803細(xì)胞經(jīng)8 mmol/L ASP、800 μmol/L Indo用藥48 h后均出現(xiàn)了明顯的凋亡，各實(shí)驗(yàn)組的凋亡率分別為(31.9±3.21)%和(29.0±3.01)%，與對(duì)照組的(9.3±0.45)%比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

A:ASP 對(duì)MGC803細(xì)胞增殖的影響;B:Indo對(duì)MGC803細(xì)胞增殖的影響。

圖1ASP、Indo對(duì)MGC803細(xì)胞增殖的影響

2.3ASP、Indo處理后MGC803細(xì)胞中CRP、IL-6的表達(dá)變化免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，在兩組圖的對(duì)照組細(xì)胞胞質(zhì)中可見大量的棕黃色顆粒，提示CRP、IL-6蛋白在MGC803細(xì)胞中表達(dá)為強(qiáng)陽性。MGC803細(xì)胞經(jīng)8 mmol/L ASP、800 μmol/L Indo用藥48 h后，與未用藥對(duì)照組相比，細(xì)胞質(zhì)褐色的CRP、IL-6蛋白的表達(dá)明顯下降，并且病理圖像分析結(jié)果顯示，8 mmol/L ASP、800 μmol/L Indo藥物處理后CRP表達(dá)灰度值分別為179±8.5、190±7.6；IL-6表達(dá)灰度值分別為165±2.4、184±3.4，均高于各自對(duì)照組的86±4.3和95±5.0，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

A:流式細(xì)胞術(shù)分析對(duì)照組MGC803細(xì)胞凋亡;B:流式細(xì)胞術(shù)分析8 mmol/L ASP誘導(dǎo)的MGC803細(xì)胞凋亡C:流式細(xì)胞術(shù)分析800 μmol/L Indo誘導(dǎo)的MGC803細(xì)胞凋亡。

圖2ASP、Indo對(duì)MGC803細(xì)胞凋亡的影響

A:免疫細(xì)胞化學(xué)分析8 mmol/L ASP、800 μmol/L Indo作用后的CRP的表達(dá)B:免疫細(xì)胞化學(xué)分析8 mmol/L ASP、800 μmol/L Indo作用后的IL-6的表達(dá)。

圖3ASP、Indo處理后MGC803細(xì)胞中CRP、IL-6的表達(dá)變化

3討論

癌癥盡管在早期診斷和防治方面取得很大成績(jī)，但目前仍是人類亟待解決的難題之一。近年的流行病學(xué)、臨床和實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，長(zhǎng)期服用臨床常用于解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎的NSAIDs如ASP、Indo等，與多種腫瘤的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)，可以顯著降低乳腺、肺、前列腺、膀胱、卵巢、食道和胃及部位腫瘤發(fā)病率[3]。Waddell等[9]于1983年最早報(bào)道了NSAIDs與腫瘤的發(fā)生具有量效關(guān)系，長(zhǎng)期服用NSAIDs可以明顯減少家族性腺瘤樣息肉(FAP)患者的息肉數(shù)量。并且后來的隨機(jī)臨床試驗(yàn)也證實(shí)了每天服用劑量300～400 mg的蘇靈大(蘇靈大屬于NSAIDs，結(jié)構(gòu)同吲哚美辛)4～6個(gè)月，可以降低FAP患者腺瘤數(shù)量的70%[10]。

除臨床研究以外，還有大量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型和體外的試驗(yàn)研究證明NSAIDs具有明顯抑癌作用。Pollard等[11]報(bào)道，Indo在致癌物質(zhì)誘導(dǎo)的結(jié)腸癌動(dòng)物模型中具有一定的抑癌活性。隨后的試驗(yàn)研究也證實(shí)了不同種類的NSAIDs對(duì)結(jié)腸癌的不同程度的抑癌作用[12]。孫振華[13]在體外試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，ASP能夠抑制原癌基因ErbB2的表達(dá)，進(jìn)而抑制其下游細(xì)胞生存相關(guān)的信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)了宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞凋亡。Li等[14]研究發(fā)現(xiàn)，ASP能夠通過抑制Mcl-1的表達(dá)來增強(qiáng)細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bcl-2高親和力靶向抑制劑ABT-263介導(dǎo)的抗腫瘤作用，從而對(duì)肝癌細(xì)胞起到誘導(dǎo)凋亡的作用。孫振海[7]研究結(jié)果顯示，NSAIDs塞來布昔可以通過抑制結(jié)腸癌細(xì)胞SW480中BiP蛋白的表達(dá)，從而起到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。董兆如[15]的研究顯示，低濃度ASP(1 mmol/L)聯(lián)合干擾素α(IFN-α)較單獨(dú)作用于肝癌細(xì)胞時(shí)，凋亡數(shù)量明顯增加，提示低濃度ASP協(xié)同IFN-α誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡有較好的效果。本課題以胃癌細(xì)胞株MGC803細(xì)胞為靶細(xì)胞，將4、8、10 mmol/L ASP與400、800、1 000 μmol/L Indo作用于MGC803細(xì)胞48 h后，發(fā)現(xiàn)其對(duì)MGC803細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用。并且研究還發(fā)現(xiàn)，8 mmol/L ASP、800 μmol/L Indo用藥48 h后，細(xì)胞凋亡明顯增加。

IL-6原稱B細(xì)胞刺激因子2、B細(xì)胞分化因子、IFN-β2、雜交瘤/漿細(xì)胞瘤生長(zhǎng)因子、26×103蛋白、肝細(xì)胞刺激因子等。產(chǎn)生IL-6的細(xì)胞主要有單核/巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞及T細(xì)胞(主要是Th2)等，此外還包括骨髓瘤細(xì)胞株、宮頸癌細(xì)胞株等。IL-6的生物學(xué)活性，除了在細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中可發(fā)揮多種效應(yīng)，如免疫調(diào)節(jié)、刺激造血、防御作用、急性期反應(yīng)等外，還具有促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的作用。如IL-6合成增加與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生有關(guān)，IL-6在體外可促進(jìn)漿細(xì)胞瘤和骨髓瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。某些腫瘤可高表達(dá)IL-6，使細(xì)胞增殖失控，對(duì)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展起重要作用[16]。研究證明，部分肺癌細(xì)胞系可以產(chǎn)生IL-6，作為自分泌、旁分泌的生長(zhǎng)因子，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)及向周圍組織侵襲。并且白血病、腎癌、骨髓瘤等多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)也均依賴于IL-6的自分泌能力[5,17]。CRP是一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，作為炎癥和急性組織損傷的非特異標(biāo)志物廣泛應(yīng)用于臨床。近幾年臨床研究顯示，許多胃腸、肝膽、胰腺癌患者的血清CRP水平會(huì)升高[18]。并有研究顯示，CRP聯(lián)合CEA、CA724對(duì)胃癌的早期診斷和病情判斷也有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值，但CRP在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)水平及作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究[19]。因此，本實(shí)驗(yàn)將CRP、IL-6作為研究的靶因子，免疫細(xì)胞化學(xué)發(fā)現(xiàn)CRP、IL-6在胃癌MGC803細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)，并且與空白對(duì)照組相比，8 mmol/L ASP、800 μmol/L Indo用藥48 h后， MGC803細(xì)胞中CRP、IL-6的表達(dá)明顯下降，說明 ASP、Indo對(duì)胃癌MGC803細(xì)胞的增殖抑制、誘導(dǎo)凋亡的作用機(jī)制可能與其抑制細(xì)胞中CRP、IL-6的產(chǎn)生有關(guān)。

先前針對(duì)NSAIDs的抑癌機(jī)制大都集中于其能抑制具有誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和致癌變作用的COX-2的表達(dá)有關(guān)，本課題將具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的CRP、IL-6作為研究靶分子，發(fā)現(xiàn)NSAIDs ASP、Indo抑制胃癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡的可能作用機(jī)制與其抑制細(xì)胞中CRP、IL-6的產(chǎn)生有關(guān)，從而為臨床應(yīng)用NSAIDS的抗癌治療提供了一定試驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Experimental study of the inhibition mechanism of ASP and Indo on human gastric carcinoma cell line MGC803

TangJing1,QuLimei1,CaoWeibin2,LiDujun1△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory;2.DepartmentofHematology,YantaiYedaHospital，Yantai,Shandong264006，China)

Abstract:ObjectiveTo explore the effect of ASP and Indo inducing the apoptosis and inhibiting the proliferation of human gastric carcinoma MGC803 cell in vitro and its mechanism.MethodsInhibition rate was tested by MTT method;apoptosis induced by ASP and Indo in MGC803 cells was investigated by applying flow cytometry analysis techniques;the expression of CRP and IL-6 was analyzed by immunocytochemistry(ICC) analysis.ResultsCompared with the control,ASP and Indo significantly inhibited the proliferation and induced apoptosis of MGC803 cells;CRP and IL-6 were strongly expressed on MGC803 cells,and ASP and Indo down-regulated the expression levels of CRP and IL-6.ConclusionNSAIDs ASP and Indo can inhibit the proliferation and induce the apoptosis of MGC803 cells,and can down-regulating the expression of CRP and IL-6.

Key words:ASP;Indo;tumor cell proliferation;CRP;IL-6

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.10.016

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)10-1341-03

(收稿日期：2015-12-01)

作者簡(jiǎn)介：柴曉文，男，副主任技師，主要從事臨床免疫方向的研究。