李 澤，馮 紅

(天津體育學院健康與運動科學系 天津300381)

抗增殖蛋白在線粒體中生物學功能的研究進展

李 澤，馮 紅*

(天津體育學院健康與運動科學系 天津300381)

抗增殖蛋白(又稱Prohibitin，PHB)是一種在進化上高度保守的蛋白，廣泛分布于細菌、酵母、果蠅、原蟲及哺乳類動物的多種生物細胞中，主要定位于細胞膜、線粒體內膜、細胞核中。由于其在線粒體上的特殊定位、結構和功能，近年來在線粒體中與功能相關的研究中逐漸成為熱點，包括調控線粒體形態(tài)學變化、細胞能量代謝等?；诳乖鲋车鞍自诰€粒體中的生物學意義，通過對基因結構、定位和功能的分析，系統(tǒng)闡述了其在線粒體中的重要作用，并對應用前景做出了展望。

抗增殖蛋白 線粒體 生物學功能

PHB普遍存在于生物細胞中，主要定位于線粒體內膜上，是一種進化上高度保守的蛋白質。[1]PHB在線粒體中以復合體的形式存在，由PHB1和PHB2兩個二級單位組成。這兩種蛋白質聚集在線粒體內膜上形成一個大分子花環(huán)結構，并且在不同的細胞合成過程——從線粒體生物學功能到細胞死亡與反復衰老的過程中，兩者之間緊密聯(lián)系。PHB與人類的多種疾病關系密切，包括癌癥、衰老和糖尿病等，因此對其研究十分廣泛。迄今，PHB在人類的詳細生物學研究方面還尚未明確，而其復合物為從酵母到哺乳動物的線粒體中的生物學和新陳代謝研究都提供了重要的依據(jù)。本文將簡述近年來國內外學者對于PHB在線粒體中的生物學功能的研究和討論。

1 PHB的發(fā)現(xiàn)和定位

McClung等(1989)首次從大鼠細胞中發(fā)現(xiàn)PHB的基因。隨后Nuell等(1991)將PHB基因通過顯微注射進入正常人的成纖維細胞中，發(fā)現(xiàn)DNA的合成被PHB mRNA所抑制，得出PHB具有抗細胞增殖的作用，而有了抗增殖蛋白這個名字。Sato[2]等(1992)發(fā)現(xiàn)PHB基因位于染色體17q12-q21上，后來發(fā)現(xiàn)PHB的功能在于其基因的3-UTR，但PHB3-UTR抗增殖的機制一直存在許多爭議。直到Liu[3]等(2009)使用特異性針對PHB 3-UTR的微小RNA進行RNA干擾實驗，發(fā)現(xiàn)低分化胃腺癌中的PHB表達下調，這才證明微小RNA能夠通過抑制PHB的表達促進癌細胞增殖。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，PHB的功能不僅體現(xiàn)于細胞核內，其在大鼠、人等哺乳動物細胞線粒體內膜上的作用機制也越來越受到學者們的重視。

2 PHB家族簡介

迄今為止，已知的PHB屬于SPFH蛋白質家族的蛋白，該家族的蛋白質都含有一個PHB結構域，通常作為支架蛋白存在于脂筏中。PHB家族包含PHB1、PHB2、PHB3和PHB4 4個不同的亞型。其中人的PHB1由275個氨基酸組成，定位于染色體17q21區(qū)，包含7個外顯子，分子量為32,kD；[4]PHB2包含10個外顯子，由316個氨基酸構成，其分子量為34,kD，定位于染色體12p31區(qū)。[5]PHB比較保守，在各物種之間的同源性較高，從酵母到鼠以及人，其氨基酸序列一致性近60%,，小鼠和大鼠PHB的氨基酸序列是相同的，但這些不同于人類的氨基酸序列；PHB1和PHB2也具有高度的同源性，兩者氨基酸序列一致性超過50%,。[6]

PHB多以聚合體形式存在，由12～16對PHB1與PHB2形成一種高對分子質量的復合體。通過免疫共沉淀、質譜分析及化學交聯(lián)技術[7]成功模擬出了酵母線粒體中抗增殖蛋白復合體的分子結構[8](見圖1)。這種聚合體呈直徑為20～25,nm、分子量達1,MD的花環(huán)狀的大分子結構，這兩種蛋白質組合成環(huán)狀的大分子結構線粒體內膜并涉及到不同細胞進程：從線粒體生物合成和功能到細胞死亡和復制性衰老。在人類研究方面，PHB已經(jīng)與多種疾病密切相關。另外，也有以同源二聚體或四聚體形式存在的PHB，這樣可以有效抑制金屬蛋白酶對其降解。[9-10]PHB1與PHB2在這種復合物中是相互依存的，不管缺失PHB1或者是PHB2都將使這種復合物不復存在。

圖1 酵母線粒體中PHB復合體模式圖Fig.1 Mode pattern of PHB complex in yeast mitochondria

3 PHB在線粒體生物學功能中的作用

在早期研究中，因PHB具有抑制腫瘤和細胞增殖的作用，故大多數(shù)研究都只限于此方面。隨著時代的發(fā)展和研究的不斷深入，根據(jù)其定位發(fā)現(xiàn)PHB還有著新型的分子伴侶的作用，其作用是維持線粒體的形態(tài)、結構和功能。PHB還存在于細胞核內，起負性調控轉錄的作用，影響著細胞生命活動的整個過程。[11]PHB在線粒體中參與多個過程，如影響細胞分裂、癌癥的發(fā)生以及衰老的過程。

近年來，線粒體中PHB復合物的一些作用已經(jīng)被證實。首先，PHB復合物依賴調節(jié)膜蛋白降解線粒體的M-AAA蛋白酶。[12]其次，證明了PHB在作為膜結合伴侶，維持并穩(wěn)定新合成的編碼線粒體蛋白質中的作用。PHB蛋白也可能在穩(wěn)定的線粒體基因組中發(fā)揮作用。此外，PHB復合物可以通過穩(wěn)定OPA-1來調節(jié)線粒體形態(tài)和作為支架蛋白通過膜蛋白到特定的脂質環(huán)境。然而，線粒體PHB復合物的實際生物學功能仍然是未知的。越來越多的證據(jù)表明，PHB的功能是與線粒體聯(lián)系在一起來體現(xiàn)的。

3.1 PHB調控線粒體形態(tài)學變化

PHB復合體能夠與線粒體內膜、外膜的蛋白(視神經(jīng)萎縮蛋白1，optic atrophy 1，OPA1)相結合維持線粒體的形態(tài)、融合分裂與合成。當PHB減少或缺失時，線粒體形態(tài)與結構將發(fā)生改變。H2O2能引起老齡化的視網(wǎng)膜色素上皮細胞PHB 花環(huán)結構的瓦解，導致線粒體被破壞，并且使PHB從線粒體向細胞核轉移。PHB的存在能夠調節(jié)細胞內ROS生成的平衡，降低線粒體的氧化損傷，維持mtDNA拷貝數(shù)的穩(wěn)定。線粒體在形態(tài)方面的變化，證明了PHB與線粒體膜的溶解機制密切相關。對線粒體結構進行進一步研究，在小鼠的胚胎成纖維細胞中，敲除PHB基因后，發(fā)現(xiàn)線粒體的嵴不能正常形成，被認為是由于誘導細胞凋亡的前期影響因子OPA1缺失所致。[13]當OPA1被重新表達后，線粒體結構形態(tài)又恢復正常。PHB通過OPA1調節(jié)線粒體形態(tài)這一點在缺乏PHB的小鼠成纖維細胞的生長方面也得到了證實。[14]

3.2 PHB與線粒體衰老假說

自Harman在1956年提出衰老自由基學說，一直到1989年Linnane[15]等提出線粒體衰老假說，人們越來越關注線粒體與衰老二者之間的關系。衰老的過程被認為是細胞中自由基不斷積累的緣故，線粒體是自由基產生的主要場所，自由基能夠破壞生物膜，使大分子(蛋白質、核酸)失聯(lián)，從而影響細胞以及線粒體的正常功能。線粒體的完整性和功能在衰老過程中都會隨之減弱。衰老過程中產生ROS的主要來源是線粒體呼吸。線粒體蛋白是衰老表現(xiàn)的標志性分子之一，而PHB又是重要的線粒體蛋白。所以，許多學者認為PHB與衰老有著密切的關系。研究者通過研究發(fā)現(xiàn)，PHB蛋白功能減退時，線粒體新組裝的蛋白質穩(wěn)定性降低，導致氧化呼吸鏈不能正確裝配，細胞無法進行正常的氧化代謝，自由基增加，導致細胞衰老。因此認為，PHB復合體通過調節(jié)線粒體的能量代謝從而影響組織細胞壽命。

2009年Michael[16]等通過誘導血管內皮細胞PHB1的下調發(fā)現(xiàn)，活性氧(ROS)水平明顯升高，細胞周期受阻，衰老的生化標志p16、p2l和β-半乳糖苷酶都相應增加，從細胞形態(tài)學方面觀察發(fā)現(xiàn)細胞出現(xiàn)衰老樣的改變，從而證實了PHB可以通過影響線粒體的功能最終導致細胞衰老這一論斷。

Li[17]等通過二維電泳技術在衰老細胞中發(fā)現(xiàn)以磷酸化形式存在的PHB的比例顯著降低，通過敲除PHB基因發(fā)現(xiàn)細胞的壽命將會減少1/3，這種情況有可能與PHB的分子伴侶作用相關。當細胞衰老時，磷酸化的PHB含量降低，新合成的線粒體蛋白穩(wěn)定性降低，氧化呼吸鏈不能正確裝配，線粒體氧化呼吸功能受限，進一步驗證了PHB在衰老中的作用。[17]

線粒體突變可以引發(fā)多種結果和可能性，不同突變造成的結果也不同，以組織特異性的方式影響老化速率。老齡化是一個激素調節(jié)的過程，因此重要的是要了解什么時候以及在哪個特定組織PHB耗盡，才能發(fā)揮其對長壽的有益效果。正是鑒于PHB和參與壽命調控的生化途徑的進化保守性的高度，因此PHB在高等生物中將會有類似的作用。在氧化應激刺激下，PHB與細胞老齡化密切相關，有望成為抗衰老的藥物靶標，故它的機制還有待進一步研究。

3.3 PHB調節(jié)氧化呼吸鏈的活性

在正常細胞中，PHB主要定位在線粒體內膜上，通過與天然底物等多種蛋白質相互作用，調控它們的組裝和降解，介導調節(jié)氧化呼吸鏈的活性以及相關信號通路。Artal-Sanz M等通過研究酵母細胞發(fā)現(xiàn)，在酵母細胞中，PHB低表達時線粒體蛋白穩(wěn)定性降低，致使氧化呼吸鏈不能正確裝配，而PHB高表達時，細胞呼吸鏈復合體Ⅳ和復合體Ⅰ趨于穩(wěn)定。[11]Sessa等2008年在血管內皮細胞中發(fā)現(xiàn)，敲除PHB1基因后，復合體Ⅰ活力明顯降低，而復合體Ⅱ、Ⅲ的活力正常，細胞氧耗未發(fā)生明顯變化，于是推測可能是存在于細胞內的耗氧補償機制所致。然而在小鼠胚胎成纖維細胞中發(fā)現(xiàn)，當敲除PHB基因后，細胞的ATP含量、細胞耗氧量、電子傳遞鏈的活力均在正常值范圍內，這種情況可能是PHB在不同種類細胞中不同的氧化磷酸化需求中起著不同的作用。[18]

Schleicher M等通過將PHB1基因沉默后，證明PHB是通過PI3K-Akt途徑來調節(jié)RAC1的，而激活這一信號通路最終誘導了細胞的衰老。

3.4 PHB調控細胞能量代謝

PHB主要位于線粒體內膜上，參與維持線粒體形態(tài)、結構和功能。在大多數(shù)細胞中，線粒體是運動能量代謝的中心。Mishra S等通過研究發(fā)現(xiàn)PHB的存在抑制著丙酮酸羧化酶的活性，進一步抑制葡萄糖的有氧氧化供能，所以認為PHB調節(jié)線粒體能量代謝可能是通過調節(jié)丙酮酸羧化酶的活性來實現(xiàn)的。2012年Kathhiria A S等研究發(fā)現(xiàn)，自噬是代謝調節(jié)的一種表現(xiàn)形式，而在自噬的過程中存在著PHB的調節(jié)，PHB可能是通過與AMPK協(xié)同作用來實現(xiàn)的。

4 展 望

本文通過對PHB的發(fā)現(xiàn)、定位以及在線粒體生物學功能中的簡述，發(fā)現(xiàn)其主要生物學功能是參與調控線粒體在形態(tài)學方面的變化以及通過氧化磷酸化調控能量代謝，此外還參與信號通路，發(fā)現(xiàn)其與衰老有著密切關系。

PHB在臨床中的作用和價值越來越受重視并被多數(shù)學者所肯定，特別是在衰老、腫瘤學等方面。雖然PHB在確切的功能調節(jié)機制上的作用還不明確，但通過對其在線粒體上的生物學功能的深入研究，將促進我們對疾病發(fā)病和發(fā)展機制的認識，從而為探尋其在臨床方面所提供的新靶點的可能性提供科學依據(jù)。

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Research of Prohibitin on Mitochondrial Biological Functions

LI Ze，F(xiàn)ENG Hong*
(Department of Health and Exercise Science，Tianjin University of Sport，Tianjin 300381，China)

Prohibitin(PHB)is a widely distributed and highly-conserved protein，which is encoded by nuclear genes and locates in nucleus membranes，mitochondrial membrane substrates and matrixes.Because of its special position in mitochondrial and its special structure and function，PHB has become a new research hotpot，including modulating mitochondrial morphology and cellular energetic metabolism.In this paper，based on the biological significance of PHB in mitochondria and analysis of its gene structure，mapping and function，PHB was described regarding its role in mitochondria and its application was prospected.

prohibitin(PHB)；mitochondria；biological function

Q51

：A

：1006-8945(2016)04-0037-04

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國家自然科學基金面上項目：Prohibitin 1 在運動能量代謝中的作用及調控F0F1-ATP合酶機制(編號：31470061)。

2016-02-16