趙夢(mèng)杰，魏伯平，孫韜

·炮制制劑·

千金止帶丸中染色劑金胺O的檢測(cè)方法研究

趙夢(mèng)杰，魏伯平，孫韜

目的：建立千金止帶丸中染色劑金胺O的檢測(cè)方法。方法：采用HPLC-PDA法對(duì)千金止帶丸中金胺O進(jìn)行篩查，并采用HPLC- Q-TOF/MS對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行確證。結(jié)果：對(duì)來(lái)自7家企業(yè)的71批次樣品進(jìn)行篩查和確認(rèn)發(fā)現(xiàn)：有2家企業(yè)的11批次樣品中檢出金胺O；金胺O進(jìn)樣在0.082～82.08 μg．mL-1范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。結(jié)論：本方法準(zhǔn)確可靠，可作為千金止帶丸中金胺O的檢測(cè)方法。

千金止帶丸；金胺O；液相色譜法；液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法

千金止帶丸由黨參、白術(shù)、當(dāng)歸、白芍、延胡索等17味藥材配伍制成，具有健脾補(bǔ)腎、調(diào)經(jīng)止帶等功效，用于脾腎兩虛所致的月經(jīng)不調(diào)、帶下病的治療[1]。本方來(lái)源于孫思邈的《千金方》，現(xiàn)收載于《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版一部。其處方中有一味原料藥延胡索，市場(chǎng)上發(fā)現(xiàn)常被非法染料金胺O染色，使得千金止帶丸有金胺O殘留的風(fēng)險(xiǎn)[2,3]。金胺O屬于工業(yè)染色劑，可刺激皮膚黏膜，引起結(jié)膜炎、皮炎和上呼吸道刺激癥狀，人接觸或者吸入金胺O會(huì)引起中毒。且金胺O較難以自然降解，體內(nèi)殘留物具有致癌、致突變、致畸等毒性，我國(guó)在2008年發(fā)布的《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單（第一批）》中將其列為非食用物質(zhì)[4-8]。為保證用藥安全，有必要對(duì)千金止帶丸中金胺O建立檢測(cè)方法。本文采用HPLC-PDA對(duì)千金止帶丸中的染色劑金胺O進(jìn)行篩查，并采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-Q-TOF/MS）法對(duì)陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)。結(jié)果：來(lái)自7家企業(yè)的71批次樣品進(jìn)行篩查和確認(rèn)發(fā)現(xiàn)：有2家企業(yè)的11批次樣品中檢出金胺O；建立了千金止帶丸中的染色劑金胺O的檢測(cè)方法，為打擊千金止帶丸原料中的非法染色行為提供了技術(shù)手段。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 2695），二級(jí)管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Waters PDA 2996）；液相色譜聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent 1290 ，美國(guó)Agilent 6540 Q-TOF/ MS）；BP211D型電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；腈、乙酸銨為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。金胺O（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)111770-200701）；千金止帶丸樣品來(lái)源于全國(guó)7個(gè)生產(chǎn)企業(yè)的71批次樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC-PDA篩查

2.1.1 供試品溶液制備 本品，研細(xì)，取約2.0 g，精密稱定，置錐形瓶中，加60%甲醇20 mL，稱定重量，超聲處理20 min，取出，放冷，再稱定重量，用60%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 取金胺O對(duì)照品適量，加60%甲醇制成每1 mL含2 μg的溶液。

2.1.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 采用Waters Xbridge C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動(dòng)相：乙腈-0.01 mol/L乙酸銨溶液（40：60）；流速：1 mL．min-1;柱溫：35 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為438 nm。理論塔板數(shù)按金胺O色譜峰計(jì)算，應(yīng)不得低于3000。取對(duì)照品溶液和供試品溶液各5 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果見圖1。

圖1 金胺O對(duì)照品（A）、陽(yáng)性供試品(B)的HPLC圖

2.1.4 專屬性試驗(yàn)

2.1.4.1 HPLC-PDA法 采用二極管陣列檢測(cè)器比較相應(yīng)色譜峰在300～650 nm波長(zhǎng)范圍的紫外-可見吸收光譜，千金止帶丸陽(yáng)性樣品與金胺O對(duì)照的紫外-可見光譜基本一致。結(jié)果見圖2。

圖2 金胺O對(duì)照品（A）、陽(yáng)性供試品(B)的PDA吸收光譜圖

2.1.4.2 HPLC- Q-TOF/MS法 離子源：ESI正離子模式；毛細(xì)管電壓：4500V；干燥氣流速：9 L/min ；干燥氣溫度：350℃；掃描范圍：100～500m/z ；起始加速電壓：100V (一級(jí))；100V (二級(jí)) ；碰撞電壓：10～30V; 采樣錐電壓：60V；其他色譜條件同上。準(zhǔn)分子離子與碎片的質(zhì)譜圖見圖3。

圖3 金胺O對(duì)照品（A）、陽(yáng)性供試品(B)的準(zhǔn)分子離子（Ⅰ）與碎片（Ⅱ）的質(zhì)譜圖

2.1.5 篩查結(jié)果 共篩查7家企業(yè)的71批千金止帶丸樣品，其中2家企業(yè)的11批樣品色譜中檢出與金胺O對(duì)照品色譜保留時(shí)間相同的色譜峰，該峰在300～650 nm波長(zhǎng)范圍的紫外-可見吸收光譜與對(duì)照品基本一致，見表1。

表1 千金止帶丸樣品篩查結(jié)果

2.1.6 陽(yáng)性樣品確認(rèn) 2家企業(yè)的11批千金止帶丸樣品采用HPLC-Q-TOF/MS進(jìn)行確認(rèn)，在與金胺O對(duì)照品色譜保留時(shí)間相同的位置出現(xiàn)色譜峰，且與對(duì)照的準(zhǔn)分子離子和碎片離子質(zhì)譜圖基本一致。

2.2 HPLC含量測(cè)定

供試品溶液、對(duì)照品溶液的制備及色譜條件同上“2.1”項(xiàng)下各項(xiàng)。

2.2.1 線性關(guān)系考察 取金胺O對(duì)照品溶液適量, 加60%甲醇依次稀釋為每1mL含金胺O 0.08208、0.4104、1.642、8.208、41.04、82.08 μg．mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液, 分別取5μL，注入液相色譜儀分析, 以對(duì)照品峰面積Y對(duì)進(jìn)樣量X（ng）進(jìn)行線性回歸計(jì)算，結(jié)果：回歸方程為Y=9666X-9804, r=0.9995 ，表明金胺O在進(jìn)樣0.082～82.08μg．mL-1的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取上述濃度為1.642 μg．mL-1的對(duì)照品溶液5 μL，連續(xù)進(jìn)樣6針，分別記錄峰面積，結(jié)果金胺O的RSD為1.1%，表明進(jìn)樣精密度良好。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取千金止帶丸，制備供試品溶液各6份，分別注入液相色譜儀，測(cè)定并計(jì)算，結(jié)果金胺O含量平均值為2.4 μg．g-1，RSD為2.1%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.3”項(xiàng)下的同一千金止帶丸供試品溶液，室溫下放置，精密吸取5 μL，分別在0、2、4、8、16、24h注入液相色譜儀。金胺O色譜峰面積的RSD為1.5%，說(shuō)明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取未檢出金胺O的千金止帶丸樣品2 g，共稱定6份,置具塞錐形瓶中，加入41.04 μg．mL-1的金胺O標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL，揮干溶劑后，同“2.1.1”項(xiàng)下制備供試品溶液并測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果金胺O平均回收率為102.04%，RSD為2.88%，表明該方法的準(zhǔn)確度良好，見表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.2.6 檢出限和定量限 取“2.1”項(xiàng)下的金胺O對(duì)照品溶液，用60%甲醇進(jìn)行逐步稀釋，進(jìn)樣5μL，在選定的色譜條件下, 按信噪比的3倍值和10倍值計(jì)算, 測(cè)得金胺O的檢出限0.02 μg．mL-1，定量限為0.06 μg．mL-1。

2.2.7 樣品測(cè)定 取千金止帶丸陽(yáng)性樣品，照“2.1.1”項(xiàng)下制備供試品溶液并測(cè)定，用外標(biāo)法計(jì)算含量，測(cè)定結(jié)果見表1。

3 討論

3.1 金胺O裂解碎片分析 碎片離子是二級(jí)質(zhì)譜的重要鑒別點(diǎn)，金胺O的準(zhǔn)分子離子m/z268擊碎后，一般會(huì)產(chǎn)生m/z252、m/z 147，見圖4。

圖4 金胺O裂解碎片離子

3.2 流動(dòng)相系統(tǒng)的選擇 有文獻(xiàn)[8][9]采用乙腈-0.025moL．L-1磷酸鹽緩沖液（含0.2%的三乙胺，用磷酸調(diào)節(jié)pH到3.0）（30：70）分離測(cè)定金胺O, 本文采用了更為簡(jiǎn)單流動(dòng)相乙腈-0.01moL．L-1乙酸銨溶液（40：60），也取得了滿意的分離效果，且可以直接適用于液質(zhì)聯(lián)用儀，更為方便。

3.3 本文建立的千金止帶丸中金胺O的檢測(cè)方法，準(zhǔn)確迅速，可以有效打擊在千金止帶丸原料中添加金胺O的違法行為，從結(jié)果看，有2家企業(yè)的11批次的樣品檢出金胺O染色劑，表明千金止帶丸有被非食用化工染色劑污染的風(fēng)險(xiǎn)，提示企業(yè)應(yīng)定期對(duì)影響原料質(zhì)量的風(fēng)險(xiǎn)因素進(jìn)行監(jiān)測(cè)分析，監(jiān)管部門也應(yīng)定期開展監(jiān)督檢查，防范非食用化工染色劑污染中成藥制劑。

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(責(zé)任編輯：李蕓霞)

Detection of dye auramine O in Qianjinzhidai pill

/ZHAO Meng-jie1, WEI Bo-ping2, SUN Tao2/(1. School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan; 2. Sichuan Institute for Food and Drug Control, Chengdu, 610097, Sichuan)

Objective:To establish a method for detection of dye auramine O in Qianjinzhidai pills.Method:HPLC-PDA was used as a screening method for auramine O .The positive results were further confirmed by HPLC- Q-TOF/MS.Result:71 batches of qianjinzhidai pills from 7 manufacturer were detected and confirmed. Auramine O was detected from 11 batches of samples in 2 manufacturers. Auramine O had considerable linear relationship in range of 0.082～82.08 μg．mL-1.Conclusion:This method is accurate and reliable, and can be used as the detection method for auramine O in Qianjinzhidai pill．

Qianjinzhidai pill; auramine O; HPLC; HPLC-MS

R 283

A

1674-926X(2016)05-006-03

1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室——省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137; 2.四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，四川 成都 610097

趙夢(mèng)杰，女，在讀碩士，主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其安全性評(píng)價(jià)研究

Tel：18224472725 Email： 846684378@qq.com

魏伯平，男，主管藥師，主要從事中藥質(zhì)量控制與安全性研究 Email：weiboping@gmail.com

2016-03-09