袁志俊　李小剛　何曉英

JAK2/STAT3通路介導(dǎo)熱休克蛋白70對腦出血的神經(jīng)保護作用

袁志俊李小剛何曉英

646000四川醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

摘要:目的觀察蛋白酪氨酸激酶2/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3 (janus kinase 2-signal transducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3)信號通路特異性拮抗劑α-氰基-(3,4-羥基)N-芐苯乙烯胺〔alpha cyano-(3-hydroxy) N-styrene benzyl amine，AG-490〕對腦出血大鼠腦組織熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)、磷酸化蛋白酪氨酸激酶 2(phosphorylated janus kinase 2, P-JAK2)、磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子 3(phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3,P-STAT3)表達的影響，并分析HSP70與P-JAK2、P-STAT3的相關(guān)性，探討JAK2/STAT3信號通路是否介導(dǎo)HSP70對大鼠腦出血后的神經(jīng)保護作用。 方法將健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠100只隨機分為正常組、假手術(shù)組、腦出血和AG-490組；采用大鼠自體血注入法建立腦出血模型；各組按造模成功后時間分為6 h、24 h、48 h、72 h、7 d共5個亞組，對各組大鼠進行神經(jīng)功能缺損評分(neurological severity scores，NSS)；免疫組化染色檢測血腫周圍HSP70表達，采用Western blot檢測大鼠血腫周圍腦組織P-JAK2、P-STAT3的表達。結(jié)果腦出血組和AG-490組HSP70、P-JAK2、P-STAT表達均高于假手術(shù)組和正常組(P<0.05)，并于造模后48 h達高峰(P<0.05)；AG-490組HSP70、P-JAK2、P-STAT表達較腦出血組低(P<0.05)；腦出血組HSP70表達與NSS評分呈負相關(guān)(r=-0.511，P<0.05)，HSP70表達與P-JAK2、P-STAT3的表達呈正相關(guān)(r=0.790，P<0.05；r=0.447， P<0.05)。結(jié)論JAK2/STAT3信號通路可能通過上調(diào)HSP70的表達進而對大鼠腦出血后起神經(jīng)保護作用。

關(guān)鍵詞:腦出血；HSP70蛋白質(zhì)類；janus激酶2； STAT3轉(zhuǎn)錄因子

腦出血是常見病，其年發(fā)病率為60～80/10萬人，在我國約占急性腦血管病的30%，其死亡率在急性腦血管病中最高。蛋白酪氨酸激酶2/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3 (janus kinase 2-signal transducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是一條細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，它是多種細胞因子和生長因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的共同通路，在細胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等過程中發(fā)揮重要作用。研究表明JAK2/STAT3通路激活與腦損傷密切相關(guān)，它參與腦缺血再灌注損傷、蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦損傷等的調(diào)控[1-2]。α-氰基-(3,4-羥基)N-芐苯乙烯胺〔alpha cyano-(3-hydroxy) N-styrene benzyl amine，AG-490〕是JAK2/STAT3信號通路的一種特異性拮抗劑，結(jié)構(gòu)類似酪氨酸，可以和受體酪氨酸激酶競爭結(jié)合位置，抑制應(yīng)激反應(yīng)時STAT3的磷酸化，從而降低STAT3的活性[3]。熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)是一種應(yīng)激蛋白，也是一種內(nèi)源性的細胞保護蛋白，在正常組織中表達較少，當機體受到損傷、感染、中毒等刺激時表達增多。Madamanchi 等[4]的研究結(jié)果顯示，JAK2/STAT3信號通路活化可激活HSP70基因，促進HSP70蛋白表達。本實驗采用大鼠自體血注入法建立腦出血模型，并于造模前給予腹腔注射AG-490干預(yù)，檢測大鼠血腫周圍HSP70及磷酸化JAK2(P-JAK2)、磷酸化STAT3(P-STAT3)的表達變化，旨在探討JAK2/STAT3信號通路在HSP70表達變化中的介導(dǎo)作用，為進一步明確腦出血后腦損傷的發(fā)病機制及治療提供線索。

1材料和方法

1.1實驗動物 健康雄性SD大鼠100只，體質(zhì)量250～300 g，鼠齡2～3個月(由四川醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供)。將實驗動物隨機分為對照組、假手術(shù)組、腦出血組和AG-490干預(yù)組，各組25只。按造模成功后時間將各組大鼠再分為6 h、24 h、48 h、72 h、7 d共5個亞組，每亞組5只。

1.2實驗試劑與儀器 SDS-PAGE凝膠、5%(質(zhì)量濃度)牛血清白蛋白、HSP70抗體、P-JAK2單克隆抗體、P-STAT3單克隆抗體、AG-490、SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒購自巴傲得生物科技有限公司。鼠腦立體定向儀、50 μL微量注射儀購自世界精密儀器商貿(mào)(上海)有限公司。其他儀器包括Olympus光學(xué)顯微鏡、光學(xué)顯微鏡照相系統(tǒng)、Image-J圖像分析系統(tǒng)等。

1.3方法

1.3.1腦出血模型制備：采用二次注入法建立腦出血模型[5]。該方法采用尾動脈為供血動脈，雖然有一定創(chuàng)傷，但不影響大鼠肢體的功能，行為學(xué)評分更準確，成功率較高。術(shù)畢根據(jù)Longa等[6]5級評定方法進行神經(jīng)功能缺損評分，1～3分者為大鼠腦出血造模成功。AG-490干預(yù)組大鼠于造模成功后立即予腹腔注射AG-490〔0.15 mg/(kg·d)〕，共3 d，假手術(shù)組大鼠按相同方案注入等量生理鹽水，對照組大鼠未予任何處理。

1.3.2神經(jīng)功能缺損評分(neurological severity scores，NSS)：采用Garcia等[7]NSS評分標準:包括運動、感覺、平衡測試、反射消失或不正常運動、行走。18 分為正常，13～17分為輕度損害，7～12 分為中度損害，1～6分為重度損害。

1.3.3免疫組化：采用免疫組織化學(xué)方法檢測HSP70蛋白的表達，實驗步驟嚴格按說明書進行。選擇5個不重疊的血腫區(qū)域采集圖像，然后用Image-Pro-Plus5.0軟件分析蛋白陽性表達的累積光密度值，并計算平均值。

1.3.4Western blot檢測：采用Western blot檢測P-JAK2和P-STAT3的表達，實驗步驟嚴格按說明書進行。分析蛋白條帶的相對密度。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 結(jié)果以均數(shù)±標準差表示，采用SPSS19統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，組內(nèi)不同時間均數(shù)比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，相關(guān)分析采用直線相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1NSS評分 正常組與假手術(shù)組NSS評分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，腦出血組和AG-490組NSS評分均低于假手術(shù)組(P<0.05)，AG-490組NSS評分高于腦出血組(P<0.05)。腦出血組和AG-490組大鼠造模成功后48 h神經(jīng)功能缺損最嚴重(P<0.05)。結(jié)果見表1。

2.2免疫組化 正常組及假手術(shù)組未見或可見少量HSP70表達；腦出血組和AG-490組造模成功后6 h血腫周圍可見少量HSP70表達， 24 h開始明顯增多，48 h達高峰(P<0.05)，7 d仍有少量表達，各時間點其表達均高于假手術(shù)組(P<0.05)，AG0-490組各時間點HSP70表達均低于腦出血組(P<0.05)。結(jié)果見表2、圖1。

2.3Western blot檢測 各組大鼠血腫周圍組織P-JAK2和P-STAT3表達變化趨勢與HSP-70變化一致。具體結(jié)果見表3、4和圖2。

2.4相關(guān)性分析 腦出血組大鼠NSS評分與HSP70表達呈負相關(guān)(r=-0.511，P<0.05)，HSP70與P-JAK2、P-STAT3的表達呈正相關(guān)(r=0.790，P<0.05；r=0.447，P<0.05)。

3討論

JAK/STAT信號通路根據(jù)結(jié)構(gòu)差異可分為兩類[8]：一類是JAK家族，其本質(zhì)是一組蛋白酶,相對分子質(zhì)量120 000～130 000之間，包括JAK1、JAK2、JAK3和TYK2；另一類是在研究干擾素時發(fā)現(xiàn)的STAT家族，是位于染色體內(nèi)的一組轉(zhuǎn)錄因子，相對分子量約4 000～113 000，約由750～850個氨基酸構(gòu)成，是JAK的下游底物，包括STAT1-4，STAT5a、b和STAT6。JAK2/STAT3信號傳導(dǎo)是指信使物質(zhì)遇到細胞外的刺激時，識別并結(jié)合于胞膜的受體誘導(dǎo)其在胞漿內(nèi)形成JAK2結(jié)合位點，結(jié)合后JAK2發(fā)生磷酸化并暴露STAT3的錨定點，STAT3磷酸化而活化并移向胞核內(nèi)，完成與目的基因的信號傳導(dǎo)和表達調(diào)控[9]。由此可知，JAK2/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活在JAK2與STAT3發(fā)生磷酸化后實現(xiàn)，因此動態(tài)監(jiān)測P-JAK2和P-STAT3蛋白的表達，可以了解JAK2/STAT3信號通路的活化情況。徐海發(fā)等[1]實驗結(jié)果顯示：大鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織P-JAK2、P-STAT3表達增多，JAK2/STAT3信號通路被激活，其可能參與腦損傷的過程。本實驗結(jié)果顯示：P-JAK2和P-STAT3在腦出血組中表達明顯較正常組和假手術(shù)組高，表明腦出血時JAK2/STAT3信號通路被激活。AG-490是一種選擇性拮抗JAK2酪氨酸磷酸化的抑制劑, 可有效阻斷其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子STAT3的活化, 進而阻斷JAK2/STAT3信號通路[10]。本實驗結(jié)果顯示：P-JAK2和P-STAT3在AG-490組表達較假手術(shù)組高，而較腦出血組低，表明AG-490能有效地阻斷JAK2/STAT3信號通路。除此之外，AG-490能影響人的多項生命活動，如可顯著縮小腦梗死面積, 減少細胞凋亡, 改善神經(jīng)功能缺損[11]；亦可抑制骨髓瘤淋巴細胞細胞的增殖, 誘導(dǎo)細胞凋亡等[3]。

表 1　各組大鼠造模成功后不同時間NSS評分比較

注：NNS：神經(jīng)功能缺損評分；AG-490：α-氰基-(3,4-羥基)N-芐苯乙烯胺，表2～4同；分別與正常組、假手術(shù)組比較，aP<0.05；與腦出血組比較，bP<0.05；與組內(nèi)其他時間點比較，cP<0.05

表 2　各組大鼠造模成功后不同時間點HSP70表達的累積光密度值±s，n=5)

注：HSP-70：熱休克蛋白70；分別與正常組、假手術(shù)組比較，aP<0.05；與腦出血組比較，bP<0.05；與其他時間點比較，cP<0.05；-：表示未進行統(tǒng)計學(xué)處理

A:組正常；B：假手術(shù)組；C:腦出血組；D:AG-490干預(yù)組；箭頭所示為HPS70陽性細胞

圖1各組大鼠造模成功后48 h血腫周圍HSP70陽性細胞表達(免疫組化染色×400)

表 3　各組大鼠造模成功后不同時間點P-JAK2表達的相對吸光度值比較±s，n=5)

注：P-JAK2：磷酸化蛋白酪氨酸激酶2；與正常組、假手術(shù)組比較，aP<0.05；與腦出血組比較，bP<0.05；與其他時間點比較，cP<0.05；-：表示未進行統(tǒng)計學(xué)處理

表 4　各組大鼠造模成功后不同時間點P-STAT3表達的相對吸光度值比較±s，n=5)

注：P-STAT3：磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3；與正常組、假手術(shù)組比較，aP<0.05；與腦出血組比較，bP<0.05；與其他時間點比較，cP<0.05；-：表示未進行統(tǒng)計學(xué)處理

圖2各組大鼠血腫周圍P-JAK2(A)和P-STAT3(B)表達(Western blotting)

HSP是指細胞在應(yīng)激原和高溫誘導(dǎo)下生成的一類具有高度保守性的蛋白質(zhì)，其相對分子質(zhì)量在80 000～110 000、68 000～74 000和18 000～30 000之間，可分為HSP110、HSP70、HSP60和小分子量HSP等幾個家族。當細胞在受到某些不利因素，如高熱、感染、缺血、缺氧及化學(xué)物質(zhì)等刺激時，HSP70會迅速短暫地大量合成而發(fā)揮細胞保護功能。相關(guān)研究結(jié)果顯示HSP70具有神經(jīng)功能保護作用[12-13]，其機制包括：(1)分子伴侶作用，HSP70能對抗內(nèi)源性損傷因子引起的毒性作用，清除細胞內(nèi)異常的蛋白質(zhì)，減輕損傷及應(yīng)激反應(yīng)引起的細胞膜蛋白的變性，保護腦組織細胞的蛋白；(2)減少氧自由基釋放, 穩(wěn)定細胞膜和溶酶體, 防止蛋白質(zhì)變性；(3)抑制細胞因子的炎性反應(yīng)，起一定的非特異性免疫保護作用；(4)抗凋亡作用，凋亡是腦組織缺血低氧性損傷后的主要病理改變，Kitamura等[14]研究發(fā)現(xiàn)，JAK2/STAT3信號通路是導(dǎo)致創(chuàng)傷后神經(jīng)細胞凋亡的重要途徑，而HSP70是其中的一種抑制分子。劉勝中等[15]研究表明：心臟經(jīng)停搏液處理后,心肌組織中HSP70表達明顯增加；同時加用AG-490阻斷JAK2/STAT3信號通路后,HSP70表達降低，凋亡心肌細胞增加，提示心臟停搏液可能通過JAK2/STAT3途徑，激活STAT3，上調(diào)HSP70表達，調(diào)動心臟內(nèi)源性的保護機制。本實驗結(jié)果顯示：AG-490組NSS評分較假手術(shù)組低，較腦出血組高，P-JAK2、P-STAT3、HSP70的表達較假手術(shù)組高，而較腦出血組低，且P-JAK2、P-STAT3與HSP70的表達呈正相關(guān)，表明在SD大鼠造模后腹腔注射通道阻斷劑AG-490，可下調(diào)HSP70在大鼠血腫周圍的表達，進而產(chǎn)生神經(jīng)保護作用，此作用可能由JAK2/STAT3途徑介導(dǎo)。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，大鼠腦出血時JAK2/STAT3信號通路被激活，血腫周圍腦組織HSP70表達增多，而JAK2/STAT3通道阻滯劑AG-490干預(yù)可使大鼠神經(jīng)功能缺損減輕，降低大鼠腦組織血腫周圍P-JAK2、P-STAT3、HSP70的表達，且P-JAK2、P-STAT3與HSP70的表達呈正相關(guān)，提示JAK2/STAT3信號通路可能通過上調(diào)HSP70的表達進而對大鼠腦出血后起神經(jīng)保護作用，此研究可為進一步明確腦出血后腦組織損傷機制及治療提供新的線索。

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(本文編輯：時秋寬)

The neuroprotective effect of heat shock protein 70 through the JAK2/STAT3 signaling pathway in cerebral hemorrhage

YUANZhijun,LIXiaogang,HEXiaoying*.

*DepartmentofNeurology,TheFirstAffiliatedHospitalofSichuanMedicalCollege,LuzhouSichuan646000,ChinaCorresponding author: HE Xiaoying, Email: 102050228@qq.com

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the effect of Alpha cyano-(3-hydroxy) N-styrene benzyl amine (AG-490) [the janus kinase 2-signal transducer and activator of transcription 3(JAK2/STAT3) signaling pathways specific antagonist] on the expression of heat shock protein 70 (HSP70), phosphorylated janus kinase 2( P-JAK2) and activator of transcription 3(P-STAT3) in cerebral hemorrhage rat models, and the correlation between the JAK2/STAT3 signaling pathway and the expression of HSP70. To investigate the role of JAK2/STAT3 signal pathway and HSP70 in neuroprotective effects of cerebral hemorrhage rats. MethodsOne hundred healthy male Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups: the normal group, the sham operation group, the cerebral hemorrhage group and the AG-490 group. The autologous arterial blood was stereotaxically injected to the right caudate nucleus to establish cerebral hemorrhage rat models. According to the different sacrificed time, every group was divided into 5 subgroups: 6 h, 24 h, 48 h, 72 h, 7 d. The rats were evaluated by the neurological deficit scores (Neurological Severity Scores, NSS), the expressions of HSP70, P-JAK2, and P-STAT3 were detected by immunostaining and Western blot using rat brain tissue around the hematoma. ResultsHSP70, P-JAK2 and P-STAT expressions in the cerebral hemorrhage group and the AG-490 group were higher than those of the sham group and the normal group (P<0.05), and 48 h after modeling their expressions reached a peak (P<0.05). HSP70, P-JAK2 and P-STAT expressions in the AG-490 group were lower than those of the cerebral hemorrhage group (P<0.05). NSS and HSP70 expression were negatively correlated (r=-0.511, P<0.05), HSP70 expression was positively correlated with P-JAK2 and P-STAT3 expression (r=0.790, P<0.05; r=0.447, P<0.05) in the cerebral hemorrhage group. ConclusionsJAK2/STAT3 signaling pathway may play a role in neuroprotection after cerebral hemorrhage by upregulating the expression of HSP70.

Key words:cerebral hemorrhage; HSP70 heat-shock proteins; janus kinase 2；STAT3 transcription factor

doi：10.3969/j.issn.1006-2963.2016.01.004

基金項目：四川省衛(wèi)生廳科研課題(110368)

通訊作者：何曉英，Email:l02050228@qq.com

中圖分類號：R744.5

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2963 (2016)01-0014-05

(收稿日期：2015-04-02)