冉仁國　羅　政　張岱陽　劉　俊　黃　瓊

(湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院骨外科，湖北　恩施　445000)

實 驗 研 究

超聲經(jīng)皮促滲術(shù)聯(lián)合骨傷膏對創(chuàng)傷性骨折愈合兔血清堿性磷酸酶活性水平及鈣、磷含量的影響※

冉仁國羅政△張岱陽劉俊黃瓊1

(湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院骨外科，湖北恩施445000)

【摘要】目的觀察超聲經(jīng)皮促滲術(shù)聯(lián)合骨傷膏對創(chuàng)傷性骨折愈合兔血清堿性磷酸酶(AKP)活性水平及鈣、磷含量的影響。方法將80只雄性健康新西蘭兔隨機分為超聲經(jīng)皮促滲術(shù)聯(lián)合骨傷膏組(簡稱聯(lián)合組)和單純骨傷膏對照組(簡稱對照組)，每組40只，均建立右側(cè)橈骨骨折模型，以治療第 2、4、6、8 周4個時間點將每組動物隨機等分成4個小組，每組10 只，聯(lián)合組所有動物右側(cè)骨折部位給予超聲經(jīng)皮促滲術(shù)聯(lián)合骨傷膏治療，對照組右側(cè)骨折部位單純給予骨傷膏治療。2組在治療第 2、4、6、8 周4 個時間點，各取相應時間點的10 只動物進行血清堿性磷酸酶(AKP)活性水平及鈣、磷含量測定，X 線影像學檢查，組織切片和形態(tài)學檢測。結(jié)果聯(lián)合組實驗兔治療第2、4、6、8周血清AKP活性水平及鈣、磷含量均高于對照組治療同期(P<0.05，P<0.01)，隨著時間的推移，治療第6、8周，聯(lián)合組上述指標水平變化更明顯(P<0.01)。2組實驗兔治療第2、4、6、8周X線評分比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)，聯(lián)合組X線評分高于對照組。2組治療第4 、8周骨折斷端的礦化骨痂均寬(AWMC)及礦化骨痂面積(MCA)比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)，聯(lián)合組高于對照組。結(jié)論超聲經(jīng)皮促滲術(shù)聯(lián)合骨傷膏通過對骨折愈合的整個過程施加影響從而加速了骨折的愈合。

【關(guān)鍵詞】創(chuàng)傷和損傷；骨折愈合；動物，實驗；超聲檢查，介入性；膏劑；堿性磷酸酶；骨和骨組織

日常生活中，骨折是一種常見的創(chuàng)傷性疾病，其愈合涉及非常復雜的生物組織學過程，以骨組織形態(tài)和功能完全恢復作為骨折愈合的標志[1]。隨著人口老齡化的到來，骨折的發(fā)生率和延遲愈合率均不斷增高，由此導致的骨移植等輔助治療在精神及物質(zhì)上均給患者帶來非常大的痛苦，因此對如何促進骨折愈合的研究顯得尤為重要，近年來植骨術(shù)甚至基因給藥等方法在骨折愈合領(lǐng)域的應用獲得了一定的進展，但仍不能很好地解決上述問題[2]。國外近年出現(xiàn)了一種低頻超聲波介導經(jīng)皮給藥的新技術(shù)，該項技術(shù)基于無創(chuàng)靶向滲透給藥理論，通過超聲空化和電致孔等技術(shù)，克服了皮膚、組織膜和細胞膜等屏障，較好地使藥物滲透進皮膚組織和體循環(huán)，達到發(fā)揮藥效之目的[3-4]。骨傷膏是土家族地區(qū)常用的骨科用藥，經(jīng)湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院骨科臨床應用具有較好的療效，可縮短骨折愈合時間和提高骨折愈合質(zhì)量，但單純應用該方療效發(fā)揮較緩慢。為更好地發(fā)揮骨傷膏的作用，我們應用超聲經(jīng)皮促滲術(shù)將骨傷膏定向滲透進骨折部位，用動物實驗方法觀察超聲經(jīng)皮促滲術(shù)聯(lián)合骨傷膏對骨折愈合的影響，為骨傷膏更好地服務臨床、發(fā)揮臨床療效奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物雄性健康純種新西蘭兔80只，體質(zhì)量(2.25±0.25) kg，購自華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心，動物合格證號：SKSF(鄂)20140605。飼養(yǎng)在空調(diào)恒溫室內(nèi)，溫度為(22±2) ℃，濕度為40%～60%，自由飲水，每日光照12 h。

1.1.2實驗儀器SLC-006型超聲脈沖電導治療儀(河南三浪醫(yī)療新技術(shù)有限公司)，治療參數(shù)：電致孔脈沖持續(xù)時間(200±10) ms，超聲波頻率(1±0.1) MHz，中頻輸出頻率(2±0.2) KHz，低頻輸出頻率50 Hz，允差±0.1，額定輸出功率≤100 VA。

1.1.3實驗藥物骨傷膏由湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院藥劑科制備，鄂藥準字Z20121360，由本地產(chǎn)特有植物藥刺老苞、野葡萄、刺五加、蜂蜜按2∶1∶1∶4的比例，先將刺老苞、野葡萄、刺五加粉碎，再加入蜂蜜，并加適量凡士林膏調(diào)和而成，裝塑料盒備用。

1.2方法

1.2.1動物選擇將80只實驗兔隨機分為超聲經(jīng)皮促滲術(shù)聯(lián)合骨傷膏組(簡稱聯(lián)合組)和單純骨傷膏對照組(簡稱對照組)，每組40只，以治療第 2、4、6、8 周4個時間點將每組實驗兔隨機分為4個小組，每組10只。

1.2.2模型制備每只實驗兔用5%戊巴比妥鈉1 mL/kg靜脈麻醉，將右側(cè)前臂膚毛剪除，常規(guī)酒精消毒，在右側(cè)橈骨中段縱向切開1個2.0 cm切口，并將骨膜剝離，用消毒后的線鋸將骨膜和橈骨鋸斷，并造成1個3 mm 的骨缺損，然后將傷口逐層縫合，不予固定，造模后3 d予注射用青霉素鈉(華北制藥股份有限公司，國藥準字H13020657)50萬U，每日1次肌肉注射。

1.2.3治療方法造模后，觀察傷口情況，如傷口干燥，則可按前述分組進行治療。聯(lián)合組實驗兔右側(cè)骨折部位給予超聲經(jīng)皮促滲術(shù)聯(lián)合骨傷膏治療，用藥劑量按體表面積公式和等效臨床劑量計算，每只實驗兔取骨傷膏30 g，此劑量與人的等效劑量相當，用一定量0.9%氯化鈉注射液稀釋后平攤于醫(yī)用紗布上，然后包裹在骨折部位，外包連接超聲脈沖電導治療儀的電極板，由陰極導入，連接陽極的電極板用0.9%氯化鈉注射液浸濕后置于離骨折部位10 cm的橈骨兩端，外用繃帶膠布固定，超聲脈沖電導治療儀持續(xù)治療40 min，電致孔脈沖強度設(shè)為5，超聲波強度設(shè)為7，每日治療1次。對照組實驗兔右側(cè)骨折部位單純給予骨傷膏外敷治療，方法同聯(lián)合組的骨傷膏治療。

1.2.4觀察指標

1.2.4.1血清堿性磷酸酶(AKP)活性水平及鈣、磷含量測定治療第2、4、6、8 周相應組實驗兔處死前通過心臟采血制備血清，酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)測定血清AKP活性水平，滴定分析法測鈣、磷含量，步驟操作嚴格按試劑盒說明書進行。

1.2.4.2X線影像學檢測治療第2、4、6、8 周，相應組實驗兔行正位X 線攝片，X線攝片下用評分的方法半定量分析每組實驗兔外骨痂和骨折線變化，將半定量分析后的數(shù)值相加即為骨折愈合質(zhì)量的X 線評分，具體評分標準見表1。

表1　X線外骨痂和骨折線評分標準

1.2.4.3組織切片和形態(tài)學檢測X 線影像學檢測后，處死動物，以骨折線為中心，左右截取0.5 cm 長的一段標本，中性甲醛液固定48 h，酸類混合脫鈣液脫鈣，石蠟包埋，取骨痂最大處切片，蘇木精-伊紅染色法(HE)染色，100倍光鏡下觀察骨痂部位組織學變化，并于治療第4、8周時測定標本的礦化骨痂均寬(The average width of mineralized bone callus，AWMC)和礦化骨痂面積(Mineralized callus area，MCA)。

2結(jié) 果

2.12組實驗兔治療第2、4、6、8周血清AKP活性水平及鈣、磷含量比較見表1。

表1　2組實驗兔治療第2、4、6、8周血清AKP活性水平及鈣、磷含量比較　±s

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

由表1可見，聯(lián)合組實驗兔治療第2、4、6、8周血清AKP活性水平及鈣、磷含量均高于對照組治療同期(P<0.05，P<0.01)，隨著時間的推移，治療第6、8周，聯(lián)合組上述指標水平變化更明顯(P<0.01)。

2.22組實驗兔治療第2、4、6、8周X 線評分比較見表2。

表2　2組實驗兔治療第2、4、6、8周X 線評分比較　分，

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

由表2可見，2組實驗兔治療第2、4、6、8周X 線評分比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)，聯(lián)合組X 線評分高于對照組。2組影像學比較：治療第2周，聯(lián)合組外骨痂顯現(xiàn)明顯，骨折線連接明顯；對照組骨膜稍有變化，骨折線欠明晰。治療第 4 周，聯(lián)合組外骨痂吸收開始，骨折線消失；對照組僅皮質(zhì)骨橋形成，骨折線連接明顯。治療第 6 周，聯(lián)合組外骨痂吸收明顯，骨髓腔密度下降顯著；對照組外骨痂吸收剛開始，骨折線消失。治療第 8 周，聯(lián)合組外骨痂幾乎吸收完全，骨髓腔再通；對照組外骨痂吸收不完全，骨髓腔密度顯著下降，但未完全通暢。

2.32組實驗兔治療第2、4、6、8周骨痂組織光鏡下形態(tài)表現(xiàn)治療第2周，聯(lián)合組骨折處有纖維骨痂和軟骨骨痂形成，有些地方出現(xiàn)膜內(nèi)化骨(見圖1)；對照組骨折處未見纖維骨痂和軟骨骨痂形成(見圖2)。治療第4周，聯(lián)合組骨折處軟骨骨痂開始增多，存在較多的破骨細胞，而且部分區(qū)域開始出現(xiàn)鈣化和骨化(見圖3)；對照組骨折處軟骨骨痂數(shù)量較少，且鈣化和骨化不明顯(見圖4)。治療第6周，聯(lián)合組骨折處出現(xiàn)大量的小梁骨，軟骨骨痂已很少，骨髓腔密度下降顯著(見圖5)；對照組膜內(nèi)化骨明顯，但骨痂仍然以編織骨為主，骨髓腔密度下降不顯著(見圖6)。治療第8周，聯(lián)合組骨折處基本恢復正常結(jié)構(gòu)，全部由小梁骨相連，骨髓腔再通完全(見圖7)；對照組骨折處正常結(jié)構(gòu)恢復不完全，纖維骨痂減少明顯，骨髓腔未完全再通(見圖8)。

圖1 治療第2周聯(lián)合組骨痂部位組織學觀察(HE,×100)圖2 治療第2周對照組骨痂部位組織學觀察(HE,×100)圖3 治療第4周聯(lián)合組骨痂部位組織學觀察(HE,×100)圖4 治療第4周對照組骨痂部位組織學觀察(HE,×100)

圖5 治療第6周聯(lián)合組骨痂部位組織學觀察(HE,×100)圖6 治療第6周對照組骨痂部位組織學觀察(HE,×100)圖7 治療第8周聯(lián)合組骨痂部位組織學觀察(HE,×100)圖8 治療第8周對照組骨痂部位組織學觀察(HE,×100)

2.42組實驗兔治療第4、8周骨折部位形態(tài)計量學比較見表3。

表3　2組實驗兔治療第4、8周骨折部位形態(tài)計量學比較　±s

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

由表3可見，2組治療第4、8周骨折斷端的AWMC及MCA比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)，聯(lián)合組高于對照組。

3討論

骨折愈合涉及生物組織學、生物力學等多學科，是一個較為復雜的過程[5]。長期的臨床實踐已充分證明中醫(yī)藥在骨折治療方面具有很大的優(yōu)勢,相應的中醫(yī)藥治療手段已廣泛應用于臨床[6-7]。骨傷膏是土家族地區(qū)廣泛使用的骨科用藥，主藥刺老苞具有祛風止痛、解毒活血、健骨療傷之功；野葡萄化瘀止痛，解毒活血；刺加皮祛風止痛，強健筋骨[8-10]；蜂蜜調(diào)敷，使藥物功效延長。超聲經(jīng)皮促滲術(shù)通過電致孔、超聲空化等高端物理手段，在皮膚、組織和細胞膜之間形成特定的人工生物通道，再通過超聲波對流轉(zhuǎn)運、輻射壓等功能的強力驅(qū)動作用，使藥物沿人工生物通道直接進入病變的器官和組織，并在局部迅速形成藥物高濃度浸潤區(qū)，促進藥物向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運，直接發(fā)揮藥物的治療作用，這一手段被醫(yī)藥界稱為第三代給藥方法[11-12]。為進一步加強骨傷膏的臨床療效，本實驗將骨傷膏與超聲經(jīng)皮促滲術(shù)聯(lián)合起來應用，以探討如何更好地發(fā)揮骨傷膏在骨傷科領(lǐng)域的應用。

實驗結(jié)果顯示，從術(shù)后第2周開始，聯(lián)合組的實驗兔骨折部位X線攝片與對照組比較骨折愈合情況愈發(fā)顯著，從術(shù)后第2、4、6、8 周光鏡觀察結(jié)果和術(shù)后第4、8周骨折部位形態(tài)計量學分析也進一步說明了超聲經(jīng)皮促滲術(shù)聯(lián)合骨傷膏這一新的給藥方法對加快骨痂生成、骨骼重塑及加速骨折愈合具有很好的促進作用。作為骨生成所必需的酶, AKP是考察骨折愈合的常用指標[13]，其活性強弱反映了成骨細胞活動性的強弱和骨組織結(jié)構(gòu)再建的活躍性，而鈣、磷是骨折愈合的要素之一，可促進鈣鹽沉積，加速骨折愈合，其血清濃度高低反映了骨折愈合能力的強弱[14-15]。對實驗兔血清學的檢測結(jié)果說明聯(lián)合組無論血清AKP活性水平還是鈣、磷含量均明顯高于對照組同期。

綜上所述，超聲經(jīng)皮促滲術(shù)聯(lián)合骨傷膏不僅對骨愈合的某一特定階段產(chǎn)生作用，而且對骨折后的炎癥期、愈合期和塑形期這一骨折愈合的整個過程施加了有益的影響。該聯(lián)用技術(shù)可使藥物利用率提高，藥物用量減少，藥物不良反應下降，治療方法安全有效，其在骨傷科相關(guān)疾病中的應用還需進一步的研究與推廣。

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(本文編輯：習沙)

Effects of ultrasound-mediated transdermal drug delivery combined with Gushang paste on alkaline phosphatase activities, calcium and phosphorus content in rabbit with traumatic bone fracture healing

RANRenguo,LUOZheng,ZHANGDaiyang,etal.

DepartmentofBoneSurgery,EnshiTujiaandMiaoAutonomousPrefectureCenterHospitalinHubeiProvince,Hubei,Enshi445000

【Abstract】Objective To observe the ultrasound-mediated transdermal drug delivery combined with Gushang paste on alkaline phosphatase (AKP) activities, calcium (Ca) and phosphorus (P) content in rabbit with traumatic bone fracture healing. Methods 80 male New Zealand Rabbits were randomly divided into combination group and control group, 40 rabbits in each group, and then the right radius fractures models were established. Rabbits of the two groups were divided into four group according to different time-points of 2, 4, 6, 8 weeks after treatment, 10 rabbits in each group．The combination group received ultrasound-mediated transdermal drug delivery combined with Gushang paste on the fracture area, and the control group received simple Gushang paste. The contents of AKP, Ca and P of 2, 4, 6, 8 weeks after treatment were detected in corresponding group of combination and control group, respectively, as well as the X-ray examination, tissue section and morphological assay. Results The contents of AKP, Ca and P 2，4，6，8 weeks after treatment in combination group were higher than those in control group (P<0.05，P<0.01), and the changes of such contents,8 weeks after treatment were more obvious as the time passage in combination group(P<0.01). There was statistical difference on the X-ray score among 2, 4, 6, 8 weeks after treatment in two groups (P<0.05，P<0.01), and the scores in combination group were higher than those in control group. There were statistical differences on average width of mineralized bone callus (AWMC) and mineralized callus area (MCA) of fracture side between 4 and 8 weeks after treatment in two groups (P<0.05,P<0.01), the AWMC and MCA in combination group were higher than those in control group. Conclusion Ultrasound-mediated transdermal drug delivery combined with Gushang paste has the acceleration and promote effects in the whole process of fracture healing.

【Key words】Trauma and injury; Fracture healing; Animals; Experiment; Ultrasonic testing; Interventional; Paste; alkaline phosphatase; Bone and bone tissues

doi:10.3969/j.issn.1002-2619.2016.05.023

通訊作者：△湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院骨外科，湖北恩施445000

作者簡介：冉仁國(1967—)，男，副主任醫(yī)師，副教授。從事中西醫(yī)結(jié)合對骨傷科疾病的防治研究工作。

【中圖分類號】R287；R641；R-332；R683；R683.41

【文獻標識碼】A

【文章編號】1002-2619(2016)05-0720-05

(收稿日期：2014-10-13)

※ 項目來源：國家自然科學基金委員會2013年度第二批項目(編號：81360570)

1湖北民族學院中醫(yī)藥學院中醫(yī)基礎(chǔ)教研室，湖北恩施445000