朱西民　戴義芹　徐昊辰　孫春剛　范文英　趙冰樵△

(1復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)神經(jīng)生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,2復(fù)旦大學(xué)腦科學(xué)研究院腦科學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心　上?！?00032)

caspase-3限制小鼠腦卒中恢復(fù)期齒狀回神經(jīng)前體細(xì)胞增殖

朱西民1,2▲戴義芹1,2▲徐昊辰1,2孫春剛1,2范文英1,2趙冰樵1,2△

(1復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)神經(jīng)生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,2復(fù)旦大學(xué)腦科學(xué)研究院腦科學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心上海200032)

【摘要】目的探討caspase-3對(duì)腦卒中恢復(fù)期海馬齒狀回(dentate gyrus,DG)神經(jīng)前體細(xì)胞(neuronal precursor cells,NPCs)增殖的作用。方法構(gòu)建小鼠大腦中動(dòng)脈遠(yuǎn)端堵塞(distal middle cerebral artery occlusion,dMCAO)缺血模型,取缺血手術(shù)后第7天缺血側(cè)DG進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)。研究分為對(duì)照組和給藥組(caspase-3抑制劑給藥組);采用Western blot、免疫細(xì)胞化學(xué)、流式細(xì)胞儀和TUNEL染色檢測(cè)DG NPCs中caspase-3的表達(dá)及NPCs的凋亡和增殖情況。在小鼠腦卒中后第14天,采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)caspase-3抑制對(duì)DG NPCs增殖的影響。結(jié)果體外培養(yǎng)的源自腦缺血后DG的神經(jīng)球NPCs大量表達(dá)激活型caspase-3,但是超過(guò)87%的caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞與TUNEL陽(yáng)性沒(méi)有共定位關(guān)系。caspase-3限制了DG NPCs的自我更新,但并未參與細(xì)胞的凋亡過(guò)程。抑制caspase-3可促進(jìn)腦卒中恢復(fù)期DG NPCs的增殖。結(jié)論caspase-3 可通過(guò)細(xì)胞凋亡之外的途徑調(diào)控缺血性腦損傷后的神經(jīng)再生。

【關(guān)鍵詞】腦卒中;神經(jīng)再生;caspase-3;齒狀回;神經(jīng)前體細(xì)胞;小鼠

腦卒中以其高發(fā)病率和高致殘率的特點(diǎn)成為當(dāng)前嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的重大疾病[1]。腦卒中往往引起神經(jīng)細(xì)胞的死亡和多種神經(jīng)功能的退化與喪失,并且可導(dǎo)致患者的運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、語(yǔ)言和認(rèn)知等功能受到不同程度的損害[2]。然而對(duì)于腦卒中所造成的神經(jīng)功能障礙,臨床上至今尚無(wú)有效的治療手段。

在哺乳動(dòng)物的側(cè)腦室室管膜下區(qū)(subventricular zone,SVZ)和海馬齒狀回(dentate gyrus,DG)的顆粒細(xì)胞層(subgranular zone,SGZ)一直存在著神經(jīng)發(fā)生。這一再生功能伴隨于整個(gè)生命過(guò)程,對(duì)于腦結(jié)構(gòu)和功能的可塑性以及記憶的形成具有重要影響。研究表明,腦缺血損傷可以刺激SVZ和DG區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞的增殖。新生的神經(jīng)細(xì)胞遷移至損傷區(qū)周邊或海馬DG的SGZ,分化為成熟的神經(jīng)元后參與腦組織的自我修復(fù)過(guò)程[3-8]。深入研究腦缺血損傷后神經(jīng)細(xì)胞再生的機(jī)制,進(jìn)而更好地促進(jìn)神經(jīng)元的有效新生,將為解決腦卒中后神經(jīng)功能再塑的關(guān)鍵問(wèn)題提供重要的理論依據(jù)。

caspase是一組在細(xì)胞凋亡中起核心作用的半胱氨酸蛋白酶,caspase-3 是caspase家族中最重要的凋亡執(zhí)行者之一。caspase-3能夠裂解大量特定的底物,激活核酸內(nèi)切酶,最終導(dǎo)致細(xì)胞表現(xiàn)出染色質(zhì)濃縮和核內(nèi)DNA斷裂等細(xì)胞凋亡的典型特征[9-11]。caspase-3還具有細(xì)胞凋亡以外的多種重要生物學(xué)功能,例如調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸可塑性和T淋巴細(xì)胞的增殖以及參與單核細(xì)胞、成骨細(xì)胞、紅細(xì)胞、角化細(xì)胞和造血干細(xì)胞等的分化過(guò)程[12-15]。國(guó)內(nèi)外已有許多研究證實(shí)急性腦缺血或腦外傷引起激活型caspase-3在凋亡細(xì)胞中大量表達(dá),而caspase-3基因敲除或caspase-3抑制劑對(duì)急性腦損傷均有非常明顯的保護(hù)作用,急性腦損傷可以通過(guò)激活caspase-3的方式誘導(dǎo)神經(jīng)元的凋亡[16-17]。然而,caspase-3在腦缺血損傷后DG的神經(jīng)再生修復(fù)中起著何種作用,目前尚不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)caspase-3是缺血性腦卒中后調(diào)控DG神經(jīng)再生的一種關(guān)鍵內(nèi)源性分子,抑制caspase-3活性可促進(jìn)腦卒中引起的DG神經(jīng)前體細(xì)胞(neuronal precursor cells,NPCs)增殖。這些發(fā)現(xiàn)將有可能為促進(jìn)腦卒中后的神經(jīng)再生提供理論基礎(chǔ),并為開(kāi)發(fā)腦卒中的治療藥物提供潛在的研究靶點(diǎn)。

材 料 和 方 法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6J實(shí)驗(yàn)小鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。小鼠為8～10周齡,雄性,體質(zhì)量為25～30 g,飼養(yǎng)于室溫(22±2)℃、濕度55%±5%的清潔級(jí)環(huán)境中,12 h交換照明,小鼠自由進(jìn)水進(jìn)食。動(dòng)物飼養(yǎng)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案均嚴(yán)格按照復(fù)旦大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)規(guī)范執(zhí)行。

試劑和儀器BrdU和DMSO購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;4,6-diamino-2-phenylindole (DAPI) 購(gòu)自美國(guó)Vector Laboratories公司;caspase-3抑制劑(Z-DEVD-fmk)購(gòu)自美國(guó)Merck Millipore公司;TUNEL試劑盒購(gòu)自瑞士Roche公司;Annexin V-FITC試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD Bioscience公司;鼠抗BrdU,兔抗激活型caspase-3購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;兔抗β-actin購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司;山羊抗doublecortin(DCX)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司;二抗購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。蛋白電泳系統(tǒng)和凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司;流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司;冰凍切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica公司;激光共聚焦掃描顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。

小鼠腦缺血模型的建立動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到復(fù)旦大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。參照文獻(xiàn)[18-19]建造小鼠大腦中動(dòng)脈遠(yuǎn)端堵塞(distal middle cerebral artery occlusion,dMCAO)缺血模型。小鼠經(jīng)水合氯醛(360 mg/kg,腹腔注射)麻醉,仰臥位固定,行頸正中切口,鈍性分離右側(cè)頸總動(dòng)脈。小鼠左側(cè)臥,打開(kāi)顱骨,挑開(kāi)硬腦膜,暴露大腦中動(dòng)脈,電凝大腦中動(dòng)脈跨越嗅束后的遠(yuǎn)端。血管夾阻斷右側(cè)頸總動(dòng)脈15 min,監(jiān)測(cè)小鼠體溫并維持在(37±0.5)℃。

caspase-3抑制劑注射小鼠腦缺血手術(shù)前10天,麻醉后(360 mg/kg水合氯醛腹腔注射)使用立體定位儀固定頭部,按如下坐標(biāo)埋入帶微量進(jìn)樣針的套管：前囟后0.2 mm,左旁開(kāi)0.9 mm,深1 mm。將caspase-3抑制劑Z-DEVD-fmk溶于DMSO,進(jìn)一步在PBS中稀釋(pH=7.4),在腦缺血后第3、6、9、12天,每天2次(間隔8 h)經(jīng)側(cè)腦室注射Z-DEVD-fmk(240 ng溶于2 μL 1.8% DMSO),對(duì)照組注射2 μL 1.8% DMSO[14]。腦卒中后早期給藥會(huì)減少小鼠腦梗死[20],為排除Z-DEVD-fmk起神經(jīng)保護(hù)作用的可能,在腦缺血后第3天開(kāi)始注射Z-DEVD-fmk。對(duì)照組和給藥組隨機(jī)分配。

BrdU標(biāo)記為了研究Z-DEVD-fmk對(duì)NPCs增殖的影響,在腦缺血后第5～13天,每天2次由腹腔注射BrdU(50 mg/kg)[21],每組6只小鼠。

神經(jīng)球的培養(yǎng)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[22],在腦缺血后第7天將小鼠麻醉,無(wú)菌條件下取全腦,分離缺血側(cè)DG。分離出的組織用胰蛋白酶37℃水浴消化20 min,單細(xì)胞懸液以100×g離心5 min,用培養(yǎng)液重懸,將細(xì)胞密度調(diào)為1×104/mL,接種于經(jīng)多聚賴(lài)氨酸處理的培養(yǎng)皿,置于37℃、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。收集原代培養(yǎng)獲得的神經(jīng)球,消化成單個(gè)細(xì)胞,將細(xì)胞懸液以1 000個(gè)/孔接種于96孔板中。培養(yǎng)基中加入25 μmol/L Z-DEVD-fmk或等量DMSO,7天后統(tǒng)計(jì)神經(jīng)球數(shù)量。

Western blot檢測(cè)收集培養(yǎng)的神經(jīng)球,離心后加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酯酶抑制劑的裂解液裂解,勻漿,提取蛋白,再離心,BCA法測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳,將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜,含5%脫脂奶粉的封閉液封閉1 h,加入兔抗激活型caspase-3一抗,4 ℃過(guò)夜,加入二抗,37 ℃孵育1 h,加入顯影液顯色,在Bio-Rad自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)中拍照,以β-actin為內(nèi)參。

免疫細(xì)胞化學(xué)和TUNEL檢測(cè)免疫細(xì)胞化學(xué)染色：將經(jīng)過(guò)多聚賴(lài)氨酸和層粘連蛋白包被的蓋玻片置于24孔板內(nèi),將神經(jīng)球接種于蓋玻片上,用預(yù)冷的4%多聚甲醛固定,10%驢血清封閉,加入兔抗激活型 caspase-3抗體,4℃過(guò)夜,PBS洗3次,加入熒光二抗(驢抗兔Alexa Fluro 594 IgG),室溫反應(yīng)30 min。按照相同步驟,進(jìn)行Nestin染色。用DAPI標(biāo)記細(xì)胞核。使用TUNEL試劑盒,按照說(shuō)明書(shū)標(biāo)記凋亡細(xì)胞。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡收集對(duì)照組和Z-DEVD-fmk處理7天的神經(jīng)球,加入0.25%胰酶消化成單細(xì)胞,每組1×105細(xì)胞,加入錨定蛋白V-FITC和二碘化丙錠,避光反應(yīng)15 min,用流式細(xì)胞儀(Epics Altra FACScan Flow Cytometer,美國(guó)Beckman Coulter公司)檢測(cè),采用EXPO32 V1.2 分析軟件分析數(shù)據(jù)。

免疫組織化學(xué)小鼠腦缺血手術(shù)后第14天,深麻醉,用PBS和多聚甲醛灌流、取腦。腦組織經(jīng)過(guò)多聚甲醛后固定、蔗糖梯度脫水,包埋,用冰凍切片機(jī)制備海馬DG區(qū)冠狀切片,切片厚度為20 μm。BrdU染色：切片經(jīng)PBS洗滌3次,浸入2 mol/L HCl,37 ℃水浴30 min,洗滌后浸入3% H2O2室溫避光反應(yīng)20 min,0.1%胰酶修復(fù)20 min,封閉液封閉后,加入鼠抗BrdU抗體(1∶200),4 ℃過(guò)夜,洗滌后,加入辣根過(guò)氧化酶(horse radish peroxidase,HRP)標(biāo)記的二抗室溫孵育30 min,PBS漂洗,進(jìn)行DAB顯色[23],經(jīng)光學(xué)顯微鏡成像分析。BrdU/DCX熒光雙標(biāo)記中,一抗分別為鼠抗BrdU抗體(1∶200)和山羊抗DCX抗體(1∶200),二抗為Alexa Fluor 488(1∶1 000)和Alexa Fluor 594(1∶1 000),通過(guò)激光共聚焦掃描顯微鏡觀察和拍照。每個(gè)小鼠以1 mm的間隔取4張切片,通過(guò)Image J 軟件計(jì)數(shù)細(xì)胞。

結(jié)果

體外培養(yǎng)的DGNPCs表達(dá)caspase-3通過(guò)Westernblot檢測(cè),我們發(fā)現(xiàn),源于小鼠腦缺血后DG的神經(jīng)球在不同時(shí)間點(diǎn)均能檢測(cè)到激活型caspase-3,但是Z-DEVD-fmk處理組激活型caspase-3表達(dá)量明顯偏低(圖1A)。通過(guò)細(xì)胞免疫熒光染色發(fā)現(xiàn),源于小鼠腦缺血后DG的神經(jīng)球NPCs大量表達(dá)caspase-3(圖1B),但是通過(guò)TUNEL標(biāo)記發(fā)現(xiàn),在激活型caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞中,TUNEL陽(yáng)性率只有13%(圖1C,D)。綜上,我們初步得知源自腦缺血后DG的NPCs大量表達(dá)caspase-3,但caspase-3 的表達(dá)與細(xì)胞凋亡相關(guān)性不大。

圖 1Caspase-3在體外培養(yǎng)DGNPCs中的表達(dá)

Fig1Caspase-3wasexpressedinculturedDGNPCsin vitro

Caspase-3限制DG NPCs的自我更新,但不參與細(xì)胞凋亡過(guò)程為進(jìn)一步確定DG NPCs中,caspase-3與細(xì)胞凋亡的關(guān)系,我們采用流式細(xì)胞儀和TUNEL試劑盒檢測(cè)了對(duì)照組和 Z-DEVD-fmk處理組細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果顯示,兩組的V-FITC陽(yáng)性細(xì)胞率顯著差異(圖2A,B),兩組的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞率也無(wú)顯著差異(圖2C)。這說(shuō)明在DG 來(lái)源的NPCs中,caspase-3沒(méi)有發(fā)揮細(xì)胞凋亡作用。接下來(lái),我們觀察了對(duì)照組和 Z-DEVD-fmk處理組神經(jīng)球的生長(zhǎng)情況(圖2D),并對(duì)兩組神經(jīng)球計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)分析,發(fā)現(xiàn)兩組神經(jīng)球的數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2E)。這些表明caspase-3雖然限制DG NPCs的自我更新,但不參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

Caspase-3對(duì)小鼠腦卒中恢復(fù)期DG NPCs增殖的調(diào)節(jié)作用我們前期的工作證明,海馬DG區(qū)在生理情況下存在caspase-3激活的細(xì)胞,并且dMCAO缺血模型可增加caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)[24]。為闡明小鼠腦缺血恢復(fù)期caspase-3在DG NPCs中所起的作用,我們對(duì)小鼠進(jìn)行dMCAO缺血手術(shù),手術(shù)后的小鼠被隨機(jī)分為對(duì)照組和Z-DEVD-fmk給藥組,在腦缺血手術(shù)后第14天,收集腦組織。通過(guò)BrdU染色發(fā)現(xiàn),Z-DEVD-fmk給藥組DG的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比對(duì)照組增加42.2%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3A,C)。通過(guò)BrdU和DCX免疫熒光雙標(biāo)染色發(fā)現(xiàn),Z-DEVD-fmk給藥組DG BrdU陽(yáng)性的NPCs數(shù)比對(duì)照組增加48.3%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3B,D)。

討論

對(duì)于caspase-3在中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理過(guò)程中的作用,以往的研究大多關(guān)注其凋亡功能。而在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)caspase-3限制腦缺血后DG來(lái)源神經(jīng)球NPCs的自我更新,但是并不參與細(xì)胞的凋亡過(guò)程,還發(fā)現(xiàn)抑制caspase-3活性能促進(jìn)腦卒中恢復(fù)期DG NPCs的增殖。

在腦缺血急性期,csapase-3表達(dá)增加,caspase-3去磷酸化形成激活型caspase-3,激活型caspase-3通過(guò)切割其作用底物,繼而造成染色質(zhì)濃縮、DNA 損傷以及細(xì)胞凋亡小體的產(chǎn)生,從而引起細(xì)胞凋亡。有研究證明,在腦缺血和腦外傷急性期,抑制caspase-3可明顯減少神經(jīng)元死亡,減輕腦損傷[6,17]。近年來(lái)也有研究發(fā)現(xiàn),在細(xì)胞的增殖、分化,突觸的可塑性變化和軸突的定向等方面,caspase-3也發(fā)揮了非凋亡的重要功能[12-13]。

本研究結(jié)果顯示,激活型caspase-3在體外培養(yǎng)的DG NPCs中大量表達(dá)。我們采取TUNEL標(biāo)記、免疫熒光染色及流式細(xì)胞儀檢測(cè)等多種方法,發(fā)現(xiàn)caspase-3并未執(zhí)行細(xì)胞凋亡的功能。通過(guò)Z-DEVD-fmk抑制caspase-3活性,可促進(jìn)神經(jīng)球的更新,并且顯著增加小鼠腦缺血恢復(fù)期海馬DG NPCs的增殖。結(jié)合以往的研究報(bào)道,我們發(fā)現(xiàn),在腦卒中的疾病過(guò)程中,caspase-3可能扮演以下角色：在腦卒中急性期,caspase-3執(zhí)行細(xì)胞凋亡的功能,造成神經(jīng)元死亡;而在腦卒中恢復(fù)期,caspase-3抑制神經(jīng)細(xì)胞增殖,進(jìn)而影響損傷后腦功能的重塑。今后需要進(jìn)一步研究caspase-3抑制是否能能夠促進(jìn)正常情況下DG NPC的增殖。

圖2Caspase-3可調(diào)節(jié)DGNPCs的自我更新但不參與細(xì)胞凋亡

Fig2Caspase-3regulatedself-renewalofNPCsbutnotcelldeathinculturedDGNPCs

圖3在小鼠腦缺血恢復(fù)過(guò)程中caspase-3對(duì)DGNPCs增殖的調(diào)節(jié)作用

Fig3Caspase-3negativelyregulatedDGNPCsproliferationinmiceduringstrokerecovery

腦卒中能夠引起神經(jīng)元的損傷和修復(fù)過(guò)程,因此增強(qiáng)內(nèi)源性神經(jīng)再生能力可能是治療腦損傷的一條可行途徑[25-26]。然而,僅僅依靠腦組織的自身修復(fù),新生的神經(jīng)元數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足卒中后腦功能修復(fù)的需要。本研究結(jié)果表明,caspase-3限制腦卒中后內(nèi)源性神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖,考慮到在腦缺血急性期caspase-3抑制對(duì)腦損傷具有保護(hù)作用,我們的研究結(jié)果將對(duì)開(kāi)發(fā)腦卒中的新型治療藥物具有重要的參考意義。

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Restricted effect of caspase-3 on proliferation of neuronal precursor cells in dentate gyrus of mice during stroke recovery

ZHU Xi-min1,2▲, DAI Yi-qin1,2▲, XU Hao-chen1,2, SUN Chun-gang1,2,FAN Wen-ying1,2, ZHAO Bing-qiao1,2△

(1StateKeyLaboratoryofMedicalNeurobiology,SchoolofBasicMedicalSciences,2CollaborativeInnovationCenterforBrainScience,InstitutesofBrainScience,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of caspase-3 on the proliferation of neuronal precursor cells (NPCs) in the dentate gyruse (DG) during stroke recovery.MethodsThe stroke model was produced by electrocoagulating the distal middle cerebral artery (dMCA) of mice, then the NPGs were cultered from ischemia DG on the 7thday after stroke. Treatment groups and control groups were assigned in a randomized manner. The expression of caspase-3 and apoptosis and proliferation of NPCs were analyzed by Western blot, immunocytochemistry, flow cytometry analysis and TUNEL staining in NPCs cultured from ischemic DG. Besides, the effects of caspase-3 inhibition on the proliferation of NPCs in the DG was also investigated by immunohistochemistry in the mouse at 14 day after stroke.ResultsCaspase-3 was expressed in cultured NPCs,but more than 87% of the caspase-3 positive cells and TUNEL positive cells were not collocated. Caspase-3 negatively regulated self-renewal of NPCs,but did not participate in cell death in culture DG NPCs. Caspase-3 negatively regulated NPCs proliferation in the DG during stroke recovery.ConclusionsCaspase-3 may possess a novel function that limits the neurogenic response after stroke.

【Key words】stroke;neurogenesis;caspase-3;dentate gyruse;neural precursor cells;mouse

【中圖分類(lèi)號(hào)】R363

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi:10.3969/j.issn.1672-8467.2016.03.005

(收稿日期:2015-09-15;編輯:段佳)

國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(81530034);國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81071062,81271457)

△Corresponding authorE-mail:bingqiaoz@fudan.edu.cn

*This work was supported by the Key Program of National Natural Science Foundation of China (81530034) and the General Program of National Natural Science Foundation of China (81071062,81271457).