張 鑫，吳廣延，侯蓓蓓，劉文賢，余 茜

(1.四川醫(yī)科大學，四川 瀘州 646000；2.第三軍醫(yī)大學，重慶 400038；3.四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院康復科，四川 成都 610072)

大鼠飲水獎賞條件反射的建立及其習得規(guī)律

張 鑫1，吳廣延2，侯蓓蓓1，劉文賢1，余 茜3

(1.四川醫(yī)科大學，四川 瀘州 646000；2.第三軍醫(yī)大學，重慶 400038；3.四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院康復科，四川 成都 610072)

目的 以自由活動的大鼠作為實驗動物建立飲水獎賞條件反射，分析其建立和消退特征。方法 20只成年雄性大鼠，分為配對組和非配對組各10只，配對組給予以聲音作為條件刺激，固定的間隔時間后給予水滴作為獎賞性非條件刺激進行飲水條件反射訓練，非配對組同樣以聲音作為條件刺激，但給予一個隨機的時間間隔后的水滴作為非條件反射進行訓練，利用紅外發(fā)射及接收裝置探查大鼠的飲水反應，通過生理記錄儀記錄相關(guān)行為，比較兩組飲水反應習得率和潛伏期。結(jié)果 配對組大鼠能夠習得飲水獎賞條件反射，7天訓練后習得率維持在60%以上的高水平；反應潛伏期隨訓練時間增加而縮短；消退實驗中大鼠的習得率迅速下降并維持在10%以下的低水平。非配對組不能習得飲水獎賞條件反射，習得率維持在20%以內(nèi)的低水平。結(jié)論 自由活動的大鼠能建立獎賞飲水條件反射，習得后也能迅速消退。

飲水反射；大鼠；習得率；潛伏期

學習記憶是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一項重要的高級生命活動，作為一種最簡單的學習記憶行為，經(jīng)典條件反射包括恐懼性條件反射、眨眼條件反射等已被廣泛地應用于學習記憶研究中，并且極大的推動了我們對學習記憶神經(jīng)機制的了解。相關(guān)研究表明，不同的條件反射類型涉及到的神經(jīng)機制并不一致，其中經(jīng)典條件反射的中樞主要涉及皮質(zhì)下結(jié)構(gòu)，例如恐懼性條件反射屬于情緒性學習，其中樞位于杏仁核，而眨眼條件反射屬于運動性學習，其中樞位于小腦。而獎賞性條件反射行為需要覺察功能的參與，涉及更為復雜的神經(jīng)機制，相關(guān)領(lǐng)域目前對其了解甚少。飲水條件反射是一種涉及獎賞行為的條件反射，Petr等應用飲水條件反射模型研究聽覺皮層和丘腦對聲音刺激行為的調(diào)節(jié)[1]，Heath等應用該行為研究了大腦皮層對學習認知功能的調(diào)控[2]，但類似研究采用固定動物進行訓練，且國內(nèi)相關(guān)領(lǐng)域尚未有應用該模型的研究報道。本研究通過配對呈現(xiàn)條件刺激(CS)與獎賞性非條件刺激(US)，成功建立了大鼠飲水獎賞條件反射，為我們后續(xù)研究條件反射的神經(jīng)機制提供了有效模型，現(xiàn)將大鼠飲水獎賞條件反射訓練裝置和訓練結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 成年SD大鼠20只，雄性，體重約250～300 g，聽力靈敏、嗅覺正常，無明顯耳鼻疾病，由第三軍醫(yī)大學動物中心提供。實驗動物實行單籠飼養(yǎng)，飲食自由，飼養(yǎng)溫度在25 ℃左右，保持環(huán)境干燥通風。該實驗于每日9：00～15：00進行。大鼠按照隨機數(shù)字表分為配對組和假配對組各10只，兩組月齡、體重等差異無統(tǒng)計學意義。

圖1 飲水自動訓練裝置和訓練模式示意圖 a：大鼠在密閉隔音暗箱內(nèi)接受飲水獎賞條件反射行為訓練的模式圖。b：刺激間隔為1500 ms飲水獎賞條件反射行為訓練模式的CS、US的記錄曲線。c：紅外發(fā)射及接收裝置模式圖

1.2 方法 所有大鼠于實驗開始前48小時進行限制飲水，即僅于每日16：00時給予5分鐘的自由飲水，以保持基本飲水需求并制造次日訓練過程的饑渴感，直至實驗結(jié)束。飲水條件反射訓練前3日，每天將大鼠放入訓練箱內(nèi)自由活動1小時，不給予任何CS及US，以適應訓練環(huán)境。條件訓練在密閉隔音暗箱(30 cm×43 cm×35 cm)中進行，環(huán)境聲級為45 dB左右，以2000 Hz、90 dB、500 ms的純音作為CS，以飲水條件反射自動訓練裝置瞬時性給予的水滴作為US，每次約20 μl。通過本實驗室研發(fā)的紅外發(fā)射及接收裝置探察大鼠飲水舌尖對發(fā)光二極管光路的阻斷效應，通過接收二極管將該效應轉(zhuǎn)換為電信號，作為大鼠的飲水反應活動(圖1a)。通過RM6240生理記錄儀(圖1b)對該信號進行記錄，并同步記錄每次訓練過程中的聲音和水滴標記。

配對組的訓練分為適應期3天、配對期10天和消退期5天；假配對組則為適應期3天、假配對試驗10天和消退期5天。訓練次數(shù)均為100次/天。適應訓練是指僅給予CS而不給予US的訓練模式，旨在盡量減小因CS而引起的驚嚇反應，避免影響實驗結(jié)果及數(shù)據(jù)的準確性。假配對訓練是指系統(tǒng)通過隨機的方式呈現(xiàn)CS和US，二者間的呈現(xiàn)間隔2～10 s變化，目的在于使CS與US之間的關(guān)聯(lián)性降到最小。配對訓練是指在CS結(jié)束后1500 ms呈現(xiàn)一個固定的US，每次配對訓練間隔40～50 s(圖1c)；在消退期，僅給予大鼠CS而并不給予任何US。在CS結(jié)束后1500 ms內(nèi)，大鼠在聽見聲音后做出飲水動作稱為一次條件性飲水反應，大鼠的飲水習得率(CR%)=一天訓練總條件性飲水反應次數(shù)/100×100%，飲水潛伏期為CS起點與條件性飲水反應開始時刻之間的時間間隔。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析。所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，采用重復測量雙因素方差分析、拆分單因素方差分析，以及LSD posthoct檢驗。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 條件化飲水反射訓練中的參數(shù)變化 配對組大鼠可以習得條件化飲水反射，其CR%高于假配對組，潛伏期低于假配配對組，差異有統(tǒng)計學意義(P < 0.05)。配對組訓練期第一天CR%為(5.3±4.97)%，且隨訓練天數(shù)的增加而增加，第七天為(60.7±11.15)%，明顯高于第一天(P< 0.05)，之后維持在60%以上高水平。配對組第一天潛伏期為(1094.73±605.1)ms，且隨訓練時間的增加而下降，于第七天下降至(479.63±275.92)ms，明顯低于第一天，后維持在400 ms以下。而在假配對組，大鼠未能習得條件化飲水反射，且習得率始終保持在較低水平(< 30%)。

圖2 兩組大鼠訓練期條件化飲水的參數(shù)變化 a：CR%；b：潛伏期

2.2 消退期參數(shù)變化 消退期中，配對組大鼠的CR%和潛伏期有明顯的時間效應。第一天CR%為(61.2±9.704)%，并隨消退訓練時間增加而逐步遞減，至第3天為(9.9±3.84)%，明顯低于第一天，并維持在10%以內(nèi)低水平；第一天潛伏期為(323.39±144.05)ms，并隨訓練時間的增加而增長，至第三天為(907.87±265.39)ms，并始終維持在1000 ms以上的高水平。非配對組大鼠的CR%和潛伏期無明顯的時間效應(P> 0.05)。見圖3。

圖3 兩組消退期CR%隨訓練時間的變化

3 討論

作為經(jīng)典式條件反射行為，眨眼條件反射、恐懼條件反射都是常用的聯(lián)合型學習記憶模型，聯(lián)合學習指個體對不同時間發(fā)生的事件進行聯(lián)系并從行為上表達出來。眨眼反射是一種聯(lián)合性運動學習，其基本神經(jīng)環(huán)路集中在腦干和小腦環(huán)路[3～5]，并且具有同側(cè)小腦依賴性[6]，但是眨眼反射行為模型容易受到自發(fā)眨眼和驚嚇眨眼的干擾，影響結(jié)果的準確性。恐懼性條件反射屬于情緒性學習，分為線索式和場景式兩類，但其中樞都位于杏仁核[7～9]。作為操作式條件反射行為，條件化飲水反射的建立在國外已有報道，它作為一種實用的復合聯(lián)想型學習行為模型在神經(jīng)科學領(lǐng)域廣泛應用，但多是利用固定動物進行訓練[2]，對于采用自由活動動物建立條件化飲水反射及其行為習得規(guī)律未見具體研究報道。

本文結(jié)果提示自由活動大鼠在配對給予CS與US的第七日可習得條件化飲水反射，但在CS與US間隔時間隨機的假配對實驗中自由活動大鼠卻無法習得該行為，提示配對組大鼠的飲水反應是一種聯(lián)合性學習。Santiago Jaramillo以固定的大鼠訓練其飲水條件反射，發(fā)現(xiàn)在聲音頻率為14 kHz時，其CR%為50%，在聲音頻率為31 kHz時，其CR%為84%[10]，提示高頻率聲音有利于大鼠飲水反射的習得，在本研究中采用的聲音頻率為2000 Hz，大鼠CR%最高可達67.4%，且平均維持在60%左右，可見條件化飲水反射的習得過程對于CS的需求有很寬的頻閾。本研究中CR%低于文獻報道的80%～90%，除了CS頻率較低的原因之外，也有可能與自由活動的大鼠在聽到聲音CS后，有時沒有足夠時間到達給水口有關(guān)，因CS-US有效總間隔僅為2000 ms，實驗中，我們發(fā)現(xiàn)大鼠有時接觸到給水口已經(jīng)在US呈現(xiàn)后。因此，適當延長CS-US應該可以提高CR%，另外Teresa E以小鼠為實驗動物建立飲水條件反射研究研究吞咽功能，其CR%可達80%[11]，與本實驗結(jié)果接近。

大鼠條件化飲水反射行為的習得非常迅速，在第七天的訓練后基本可達到60%以上水平，潛伏期也降至500 ms內(nèi)，而且消退也同樣迅速，在第三天迅速降至10%以內(nèi)，與眨眼條件反射習得和消退所需的時間相似，但是明顯長于恐懼性條件反射。對于不同的聯(lián)合性學習類型的習得和消退所需的時間差異及其神經(jīng)機制是值得深入探討的問題。

就技術(shù)細節(jié)而言，該模型建立的主要難點在于獎賞性US的量的控制。當水量過小時，動物對CS與US的敏感性降低，有時對二者產(chǎn)生不易產(chǎn)生聯(lián)系；當水量過大時，動物有時會出現(xiàn)非觸發(fā)式飲水，即不通過給水噴頭獲取飲用水，轉(zhuǎn)而利用水滴直接滴落在口腔的“接飲”式飲水。不管是水量過小還是過大，都將影響到行為訓練的進展和實驗數(shù)據(jù)的準確性，所以如何將水流量控制在最佳水平是該模型成功的關(guān)鍵。

條件化飲水獎賞反射行為涉及復雜的神經(jīng)機制，該模型的建立為探討操作式條件反射以及復雜學習記憶行為的中樞機制打下了基礎。由于該行為涉及高級覺察功能，未來應針對前額葉、海馬等腦區(qū)對于該行為的影響及其中樞通路機制進行深入研究。

[1] Petr Z，Zador AM.Corticostriatal neurons in auditory cortex drive decisions during auditory discrimination[J].Nature，2013，497(7450)：482-485.

[2] Heath FC，Jurkus R，Bast T，et al.Dopamine D1-like receptor signalling in the hippocampus and amygdala modulates the acquisition of contextual fear conditioning[J].Sychopharmacology，2015，232(14)：2619-2629.

[3] Kotani S，Kawahara S，Kirino Y.Trace eyeblink conditioning in decerebrate guinea pigs[J].European Journal of Neuroscience，2003，17(7)：1445-1454.

[4] Woodruff DS.Where is the trace in conditioning？[J].Trends in Neurosciences，2008，31(2)：105-112.

[5] Orion P，Keifer Jr，Kerry J，et al.The physiology of fear：reconceptualizing the role of the central amygdala in fear learning[J].Physiology，2015，30：389-401.

[6] Takahiro H，Shigenori K.Effects of ipsilateral cerebellum ablation on acquisition and retention of classically conditioned eyeblink responses in rats[J].Neuroscience Letters，2010，472：148-152.

[7] Keifer OP，Hurt RC，Ressler KJ，et al.The Physiology of Fear：Reconceptu- alizing the Role of the Central Amygdala in Fear Learning[J].American Physiological Society，2015，30(5):389-401.

[8] Greco JA，Liberzon I.Neuroimaging of Fear-Associated Learning[J].Neuropsychopharmacology，2015，30：255.

[9] Plakke B，F(xiàn)reeman JH，Poremba A.Metabolic mapping of the rat cerebellum during delay and trace eyeblink conditioning[J].Neurobiology of Learning and Memory，2007，88(1)：11- 18.

[10]Santiago J，Katharine B，Zador AM.Auditory Thalamus and Auditory Cortex Are Equally Modulated by Context during Flexible Categorization of Sounds[J].Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience，2014，34(15)：5291-5301.

[11]Teresa E，Lever Ryan T，Brooks Lori A.Videofluoroscopic Validation of a Translational Murine Model of Presbyphagia[J].Dysphagia，2015，30：328-342.

The establishment of rat’s drinking water reward conditioned reflex and its acquisition characteristics

ZHANG Xin1，WU Guang-yan2，HOU Bei-bei1，LIU Wen-xian1，YU Qian3

(1.Sichuan Medical University，Luzhou 646000，China；2.Third Military Medical University，Chongqing 400038，China；3.Rehabilitation Department，Sichuan Academy of Medical Sciences&Sichuan Provincial People’s Hospital，Chengdu 610072，China)

YUQian

Objective To establish the drinking water reward conditioned reflex on freely moving rats for analyzing its establishment and fading characteristics.Methods Twenty adult male rats were divided into paired group and non-paired group，10 in each group.The paired group was treated with voice as conditioned stimulus and given the water droplets as reward unconditioned stimulus in a fixed time interval.The non-paired group was also treated with voice as conditioned stimulus and given the water droplets as reward unconditioned stimulus in a random time interval.Their drinking reaction was detected through an infrared transmitter and receiver.The acquisition and incubation period of drinking reaction was surveyed by using multi-channel recorder.The acquisition rate and incubation time were compared between the two groups.Results Acquisition of conditioned reflex during drinking reward was founded in the paired group and maintained a high level with more than 60% acquisition rate after 7 days training.With increasing of training time，the response latency period was reduced.In fade test，acquisition rate dropped rapidly and keep a low level under 10%.Acquisition of conditioned reflex during drinking reward was not founded in the non-paired group and maintained a low level of within 20% acquisition rate.Conclusion The drinking water reward conditioned reflex can be built on freely moving rats and it will disappear after they complete the acquisition.

Drinking water reflection； Rat； Acquisition rate； Incubation

四川省科技廳科研基金資助項目(編號：2014JY0032)

余 茜

R338.61

A

1672-6170(2016)02-0057-04

2015-12-24；

2016-01-08)