孫昌瑞，鄧 君，馮 林，洪 華，江詠梅

(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 成都 610072；2.四川省婦幼保健醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 成都 610071；3.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 成都 610041)

SYBR GREEN熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測粘蛋白1在乳腺癌診斷中的應(yīng)用

孫昌瑞1，鄧 君1，馮 林2，洪 華1，江詠梅3

(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 成都 610072；2.四川省婦幼保健醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 成都 610071；3.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 成都 610041)

目的 探討SYBR GREEN熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法檢測外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞中粘蛋白1基因表達(dá)水平在乳腺癌診斷和治療監(jiān)測中的應(yīng)用。方法 以β-actin為內(nèi)對照，采用SYBR GREEN熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法測定45名健康女性體檢者、91例良性乳腺疾病患者和193例乳腺癌患者以及87例其它腫瘤患者外周血中粘蛋白1的表達(dá)量，分析不同臨床病理因素與基因表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果 乳腺癌患者粘蛋白1陽性率顯著高于健康體檢者、良性乳腺疾病和其它腫瘤患者(P< 0.05)；良性乳腺疾病及其它腫瘤患者粘蛋白1陽性率顯著高于健康體檢者(P< 0.05)，而良性乳腺疾病與其它腫瘤患者粘蛋白1陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)； 乳腺癌臨床分期、組織學(xué)分級、腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及HER2/neu表達(dá)是MUC1 mRNA表達(dá)獨(dú)立相關(guān)因素(P< 0.05)。結(jié)論 SYBR GREEN 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法是靈敏較高、特異較強(qiáng)的快速定量檢測粘蛋白1方法，可有效監(jiān)測乳腺癌診斷、療效、轉(zhuǎn)移和預(yù)后。

SYBR GREEN；熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)；粘蛋白1；乳腺癌

2011年1月至2014年6月四川省人民醫(yī)院采用SYBR GREEN 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測45例健康女性體檢者、91例良性乳腺疾病患者、193例乳腺癌患者和87例其它腫瘤患者外周血中粘蛋白1(human mammaglobin，MUC1)基因的表達(dá)量，探討其對乳腺癌診斷和療效監(jiān)測的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2011年1月至2014年6月來自四川省人民醫(yī)院門診和住院部的91例良性乳腺疾病患者(年齡28～77歲)、193例乳腺癌患者(年齡31～78歲)以及87例其它腫瘤患者(年齡32～81歲)，均經(jīng)病理學(xué)確診。91例良性乳腺疾病患者中53例為纖維瘤，38例為脂肪瘤，排除患其它腫瘤的可能性。87例其它腫瘤患者中結(jié)腸癌31例、肺癌26例，卵巢癌30例。良性乳腺疾病患者、乳腺癌和其它腫瘤患者均于手術(shù)前1周內(nèi)取晨血5 ml。對照組為同期健康女性體檢者45名(年齡27～75歲)。

1.2 試劑和儀器 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系、FQ-PCR反應(yīng)體系和β-actin內(nèi)對照試劑盒均來自美國ABI生物公司，7700 Sequence Detector 分析儀為美國ABI生物公司生產(chǎn)，cDNA標(biāo)準(zhǔn)品由上海申友公司合成。

1.3 FQ-PCR引物和探針 采用PE公司Primer Express軟件設(shè)計(jì)MUC1的引物和探針，引物和探針序列：MUC1 正義引物正向，5′-3′CGTCGTGGACATTGATGGTACC，MUC1反義引物，5′-3′ GGTACCTCCTCTCACCTCCTCCAA，β-actin引物：正向，5′-3′ctcttccagccttccttcct，反向，5′-3′ agcactgtgttggcgtacag，由上?；瞪锕竞铣伞?/p>

1.4 FQ-PCR反應(yīng) ①取靜脈血5 ml，棄去開始的1 ml，以防上皮細(xì)胞的污染，1 mg/ ml EDTA抗凝，生理鹽水稀釋2～3倍，用淋巴細(xì)胞分離液分離出淋巴細(xì)胞，采用異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取細(xì)胞總RNA。②cDNA合成：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20 μl，包括細(xì)胞總RNA 1 μg，隨機(jī)引物200 ng，RNasin 20 U，5×逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液4 μl，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶20U。42 ℃反應(yīng)55 min。③PCR：反應(yīng)體系逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5 μl，寡聚核苷酸引物各為400 nmol/L，探針150 nmol/L，dATP 、dCTP和dGTP各200 μmol/L，dUTP 400 μmol/L，10×緩沖液5 μl，MgCl25 mmol/L，Taq DNA聚合酶1.25U，尿嘧啶N-糖基化酶(UNG)0.5U。在7700 Sequence Detector 分析儀上測定標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本MUC1和β-actin含量。擴(kuò)增參數(shù)為：50 ℃2 min，95 ℃10 min；再94 ℃30 s，66 ℃1 min，40個(gè)循環(huán)，采用ABIfast 7500熒光分析儀進(jìn)行測定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，儀器自動(dòng)計(jì)算出標(biāo)本中MUC1和β-actin的拷貝數(shù)/ml，以MUC1和β-actin比值作為MUC1的表達(dá)水平。

1.5 陽性判斷 應(yīng)用 2-ΔΔCt方法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量(Ct 為循環(huán)閾值)。ΔCt 值=目的基因(MUC1)Ct 值-β-actin 基因 Ct 值，以 β-actin 為對照；ΔΔCt =乳腺癌組的 ΔCt 值-健康體檢組的 ΔCt 值，以健康體檢組為對照。30例健康人的基因表達(dá)相對量為 1.003±0.087，2-ΔΔCt值為乳腺癌組基因相對健康體檢組基因表達(dá)的倍數(shù)，測定值以2-ΔΔCt>2 為表達(dá)陽性。陽性率=陽性表達(dá)人數(shù)/總?cè)藬?shù)×100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。MUCl陽性率的比較采用卡方檢驗(yàn)。采用多因素logistic回歸分析檢驗(yàn)MUC1癌基因表達(dá)與乳腺癌臨床病理因素的關(guān)系。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 健康體檢者、良性乳腺疾病、其它腫瘤患者和乳腺癌患者M(jìn)UC1陽性率比較 乳腺癌患者M(jìn)UC1陽性率顯著高于健康體檢者、良性乳腺疾病和其它腫瘤患者(χ2分別為5.03，4.78，3.79，均P< 0.05)；良性乳腺疾病和其它腫瘤患者M(jìn)UC1陽性率顯著高于健康體檢者(χ2分別為4.02，4.23，均P< 0.05)，而良性乳腺疾病和其它腫瘤患者M(jìn)UC1陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.56，P> 0.05)，見表1。

表1 健康女性和乳腺疾病患者M(jìn)UC1陽性率

2.2 MUC1癌基因表達(dá)與乳腺癌臨床病理因素的關(guān)系 以患者年齡、大小、類型和雌激素受體ER、孕激素受體PR的表達(dá)水平、乳腺癌臨床分期、組織學(xué)分級、腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和HER2/neu表達(dá)為自變量，以是否有MUC1 mRNA表達(dá)為因變量進(jìn)行多元回歸分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳腺癌臨床分期、組織學(xué)分級、腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和HER2/neu表達(dá)是MUC1 mRNA表達(dá)獨(dú)立相關(guān)因素(P< 0.05)；患者年齡、大小、類型和雌激素受體ER、孕激素受體PR的表達(dá)水平不是MUC1 mRNA表達(dá)獨(dú)立相關(guān)因素 (P> 0.05)，見表2。

表2 乳腺癌患者M(jìn)UC1 mRNA表達(dá)陽性多因素回歸分析

3 討論

粘蛋白(MUC)是廣泛分布于機(jī)體正常黏膜表面的高分子量糖蛋白，迄今發(fā)現(xiàn)有13種(MUC1～MUC13)[1]。MUC1基因定位于染色體1q21，cDNA長1821bp，具有基因多態(tài)性。MUC1基因是通過篩選從乳腺癌、胰腺癌等細(xì)胞系構(gòu)建的cDNA表達(dá)文庫克隆而得到的。MUC1基因的編碼產(chǎn)物MUC1粘蛋白是一種具有跨膜序列的附膜糖蛋白，其分子由肽核心和糖鏈組成。由于MUC1基因被成功克隆，發(fā)現(xiàn)MUC1在正常人體主要存在于胃腸道、呼吸道、泌尿生殖道及乳腺等多種上皮組織中，除有對正常的上皮起潤滑和保護(hù)作用，還有介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞粘附功能，免疫活化和抑制作用等[2]。而在乳腺腫瘤組織中MUC1多出現(xiàn)量和質(zhì)的異常表達(dá)。因此，MUC1可能成為一種新的腫瘤標(biāo)志物，用于乳腺癌的診斷、治療和預(yù)后判斷。

近年來，采用PCR方法檢測MUC1 mRNA表達(dá)有一些相關(guān)報(bào)道，Strati等發(fā)現(xiàn)，采用FQ-PCR檢測51例確診的轉(zhuǎn)移性乳腺癌的外周血，MUC1基因表達(dá)陽性率為45.1%[3]。Mana等報(bào)道，采用RT-PCR檢測60例乳腺癌患者外周血，MUC1 mRNA的表達(dá)陽性率為90.0%[4]。Cheng等報(bào)道，采用RT-PCR檢測34例轉(zhuǎn)移性乳腺癌外周血，MUC1 mRNA化療前后的陽性率分別為88.2%和70.6%[5]。

FQ-PCR是目前采用得較多的研究乳腺癌基因表達(dá)的分子學(xué)方法[6，7]，本試驗(yàn)用FQ-PCR檢測了45名健康女性體檢者、91例良性乳腺疾病患者、87例其它腫瘤患者和193例乳腺癌患者的外周血中MUC1的基因表達(dá)，并以β-actin作為內(nèi)對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者M(jìn)UC1陽性率顯著高于健康體檢者、良性乳腺疾病和其它腫瘤患者，良性乳腺疾病和其它腫瘤患者M(jìn)UC1陽性率顯著高于健康體檢者，良性乳腺疾病和其它腫瘤患者M(jìn)UC1陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

在與病理學(xué)特性的比較中，以患者年齡、大小、類型和雌激素受體ER、孕激素受體PR的表達(dá)水平、乳腺癌臨床分期、組織學(xué)分級、腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和HER2/neu表達(dá)為自變量，以是否有MUC1 mRNA表達(dá)為因變量進(jìn)行多元回歸分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳腺癌臨床分期、組織學(xué)分級、腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和HER2/neu表達(dá)是MUC1 mRNA表達(dá)獨(dú)立相關(guān)因素；患者年齡、大小、類型和雌激素受體ER、孕激素受體PR的表達(dá)水平不是MUC1 mRNA表達(dá)獨(dú)立相關(guān)因素。

綜上所述，F(xiàn)Q-PCR法能快速定量檢測外周血中MUC1的基因表達(dá)，具有高靈敏度、高特異性、高精確性、高效率和污染小等特點(diǎn)，而且標(biāo)本來源容易，對于乳腺癌的診斷、治療和轉(zhuǎn)移提供更為可靠客觀的根據(jù)，是一種值得推薦的實(shí)驗(yàn)室診斷方法。

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The application of SYBR GREEN fluorescent quantification polymerase chain reaction for the detection of human mammaglobin mRNA in the diagnosis of breast cancer

SUN Chang-rui1，DENG Jun1，F(xiàn)ENG Lin2，HONG Hua1，JIANG Yong-mei3

(1.Clinical Laboratory，Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial People’s Hospital，Chengdu 610072，China；2.Clinical Laboratory，Maternal and Child Health Hospital of Sichuan Province，Chengdu 610071，China；3.Clinical Laboratory，West China Second University Hospital，Sichuan University，Chengdu 610041，China)

DENGJun

Objective To investigate the application of SYBR GREEN fluorescent quantification polymerase chain reaction (SYBR GREEN FQ-PCR)to detect the MUC1 mRNA of circulating tumor cells in diagnosis and therapeutic monitoring of breast cancer.Methods With β-actin as internal control，MUC1 mRNA in peripheral blood cell samples in 45 health women，91 patients with benign breast disease and 193 patients with breast cancer and 87 with other cancer patients were detected by SYBR GREEN FQ-PCR.The relationship between MUC1 mRNA and clinicopathological parameters was analyzed.Results The positive rate of MUC1 mRNA detection in the patients with breast cancer was significantly higher than that in healthy individuals，patients with benign breast disease patients and other types of cancers (P< 0.05).The positive rate in the patients with benign breast disease and other types of cancers was significantly higher than that in the healthy individuals (P< 0.05).There was no significant difference in the positive rate between benign breast disease patients and other cancer patients (P>0.05).The independent factors of MUC1 mRNA expression were clinical stage，histological grade and axillary metastatic lymph node and HER2/neu (P<0.05).Conclusion FQ-PCR is a rapid and sensitive and specific method for quantitative detection of mucin1 mRNA.It can be used for the diagnosis，therapy，metastasis and prognosis of breast cancer.

SYBR Green；Polymerase chain reaction；Mucin1；Breast cancer

四川省杰出青年基金資助項(xiàng)目(編號：2007-5-345)；四川省衛(wèi)生廳科研基金資助項(xiàng)目(編號：120112)

鄧 君

R446.62

A

1672-6170(2016)02-0054-03

2015-09-16；

2015-12-10)