黃國全，孫建華，吳泉峰(湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院胃腸外科，湖北 恩施 445000)

三磷酸腺苷酶家族蛋白2過表達(dá)作為胃癌預(yù)后標(biāo)志物可行性研究

黃國全，孫建華，吳泉峰
(湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院胃腸外科，湖北 恩施 445000)

目的 探討三磷酸腺苷酶家族蛋白2(ATAD2)表達(dá)與胃癌患者疾病預(yù)后關(guān)系。方法 采用定量PCR方法檢測15例新鮮胃癌組織和臨近非腫瘤組織中ATAD2 mRNA表達(dá)情況，采用免疫組織化學(xué)方法檢測166例胃癌組織石蠟包埋樣本中ATAD2表達(dá)情況，分析ATAD2表達(dá)與166例胃癌患者疾病臨床病理學(xué)特征的關(guān)系。結(jié)果 與臨近非腫瘤組織比較，胃癌組織中ATAD2 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高(P< 0.001)。腫瘤臨床分期、腫瘤侵襲深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移為影響胃癌組織ATAD2過表達(dá)的顯著性因素。生存分析結(jié)果顯示，ATAD2過表達(dá)是胃癌患者疾病預(yù)后不良的獨立預(yù)后因素(P< 0.001)。結(jié)論 ATAD2過表達(dá)胃癌患者的總生存率低于低表達(dá)患者，ATAD2過表達(dá)可以作為胃癌患者疾病預(yù)后生物標(biāo)志物。

三磷酸腺苷酶家族蛋白2；胃癌；預(yù)后；生物標(biāo)志物

胃癌在腫瘤性疾病中發(fā)病率僅次于肺癌、乳腺癌和結(jié)腸直腸癌，死亡率僅次于肺癌[1]，中國的胃癌患者約占全球的33%[2～4]。研究表明，美國2015年胃癌新發(fā)病例24590例，胃癌死亡患者10720例[5]。大多數(shù)胃癌患者在確診后均被診斷為局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且一半胃癌患者手術(shù)切除后會復(fù)發(fā)[6]。因此，臨床上尋找一種與胃癌患者臨床病理學(xué)特性相關(guān)的疾病預(yù)后標(biāo)志物十分有必要。本研究檢測胃癌組織中三磷酸腺苷酶家族蛋白2(ATPase family，AAA domain containing 2，ATAD2)mRNA和蛋白表達(dá)情況，分析其表達(dá)與胃癌患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，以評估ATAD2表達(dá)作為胃癌患者疾病預(yù)后生物標(biāo)志物的可行性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2004～2008年在我院腫瘤科治療的166例胃癌患者，男104例，女62例，術(shù)中采集胃癌及臨近非腫瘤樣本并浸于石蠟中。其中15例新鮮臨床樣本為醫(yī)院新近接收的胃癌患者，術(shù)中采集臨床樣本并采用液氮浸泡后提取總RNA。166例胃癌患者術(shù)后隨訪8年，通過查閱病歷獲取患者一般資料見表1。所有患者均為首次發(fā)病，入組前均采用其它方法進行治療。本研究通過我院倫理委員會審批，患者知情并同意。

1.2 定量PCR檢測 采用TRIzoI試劑(Takara，日本)提取15例新鮮樣本的總RNA，按照Prime ScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明制備cDNA。通過SYBR Premix Ex TaqTM II(RR820，日本)測定樣本中ATAD2基因拷貝數(shù)。引物序列及操作方法參考文獻[7，8]。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測 采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測166例石蠟包埋胃癌樣本中ATAD2蛋白表達(dá)情況，切片厚度為4 μm，采用二甲苯脫石蠟和脫水，采用過氧化氫來滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性，之后浸入10%濃度的脫脂奶中，37 ℃封閉30 min。切片放入小鼠抗人ATAD2單克隆抗體(1∶3000稀釋，Abcam公司，美國)中，4 ℃冰箱孵育過夜，次日，采用PBST反復(fù)洗滌，放入親和素標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗中，反復(fù)洗滌，加入標(biāo)記HRP的生物素，孵育20 min，完成上述步驟后加入DAB進行顯色。

表1 ATAD2表達(dá)與胃癌患者臨床病理學(xué)特征

1.4 評價標(biāo)準(zhǔn) 組織切片的ATAD2蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果由兩位對患者臨床資料不了解的病理學(xué)家進行評分：①按照染色強度分成0分(染色陰性)，1分(弱陽性)和2分(強陽性)。②根據(jù)陽性細(xì)胞計數(shù)結(jié)果分為0分(0～5%)，1分(5%～20%)，2分(21%～50%)和3分(>51%)。免疫組織化學(xué)染色最終結(jié)果由上述兩部分結(jié)合而成[20]，總分0～6分，≥3分為高表達(dá)，<3分為低表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理。計數(shù)資料比較采用卡方檢驗；等級資料比較采用Wilcoxon檢驗；生存情況分析采用Kaplan-Meier曲線和單一與多重變量Cox線性回歸分析。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織ATAD2 腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)和胞核中均有ATAD2表達(dá)，其中胞核中表達(dá)強度顯著高于胞質(zhì)(圖1)。mRNA與蛋白過表達(dá)情況 采用定量PCR方法檢測15例胃癌腫瘤組織和臨近非腫瘤組織ATAD2表達(dá)情況，結(jié)果表明胃癌組織中ATAD2表達(dá)水平顯著高于臨近非腫瘤組織(圖2)。采用免疫組織化學(xué)方法檢測166例胃癌石蠟包埋樣本中ATAD2蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示腫瘤樣本中有51.8%為ATAD2高表達(dá)，而在臨近非腫瘤組織中僅有18.7%的樣本為高表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.19，P= 0.005)，見表2。

圖1 免疫組織化學(xué)染色檢測胃癌組織ATAD2表達(dá) a：臨近非腫瘤組織樣本中陰線對照；b：臨近非腫瘤組織樣本中弱陽性樣本；c：胃癌組織中陰性樣本；d：胃癌組織中弱陽性樣本；e：胃癌組織中中等表達(dá)樣本；f：胃癌組織中強陽性樣本

圖2 定量PCR檢測15例新鮮胃癌樣本及臨近非腫瘤組織

表2 166例胃癌樣本與臨近非腫瘤樣本中ATAD2表達(dá)情況 [n(%)]

2.2 胃癌患者ATAD2過表達(dá)的臨床意義 采用Kaplan-Meier曲線進行生存分析發(fā)現(xiàn)，166例胃癌患者中ATAD2過表達(dá)患者的總生存率低于低表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(圖3)。調(diào)整臨床分期、腫瘤侵襲深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移因素的多變量分析結(jié)果表明，ATAD2過表達(dá)是胃癌患者疾病預(yù)后的獨立因素，見表3。

圖3 ATAD2表達(dá)與胃癌患者疾病總生存期分析

表3 166例患者單一與多重變量Cox回歸分析

3 討論

ATAD2是AAA+ATPase家族成員[9]，包含兩個ATPase相關(guān)細(xì)胞活性域，均為雌激素受體共激活劑[10]。ATAD2基因位于基因組8q24，該區(qū)域為癌癥基因活躍區(qū)，ATAD2直接參與原癌基因的調(diào)節(jié)，例如ACTR、AIB1和SRC-3。已有研究表明ATAD2通過調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡和細(xì)胞周期，進而參與腫瘤發(fā)生[11，12]。近幾年，多篇文獻報道了ATAD2基因在不同種類組織中表達(dá)的臨床意義，例如乳腺癌[13～16]、肝癌[11，17，18]、淋巴瘤[15，19]、子宮內(nèi)膜癌[20，21]、卵巢癌[22]和肺癌[23]等。然而，ATAD2表達(dá)對胃癌患者疾病預(yù)后價值臨床研究較少。

ATAD2蛋白空間結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，其含一個肩部域和ATPase域，其基因位于癌癥基因活動頻繁的染色體8q24區(qū)域[8]。ATAD2結(jié)果表明其主要參與遺傳基因調(diào)節(jié)，包括細(xì)胞增生、分化和凋亡。在乳腺癌細(xì)胞中，ATAD2為雌激素作用靶點，且是雌激素介導(dǎo)的細(xì)胞增生和細(xì)胞周期發(fā)展所必須的[7]。有意思的是ATAD2也是雄激素依賴的前列腺癌細(xì)胞增殖和存活所必須的[24]。除采用雌激素和雌激素受體途徑外，ATAD2也是連接E2F和MYC途徑所的主要成分，通過增強MYC依賴的轉(zhuǎn)錄促進腫瘤的侵襲[8，14]。

早期Zou等采用基因芯片分析過乳腺癌細(xì)胞表達(dá)ACTR時，意外發(fā)現(xiàn)ATAD2基因表達(dá)升高[7]。此后，大量研究報道ATAD2在多種腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)，例如乳腺癌[14]、宮頸癌[10]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[9]、肝細(xì)胞癌[11]和卵巢癌[20]。本研究結(jié)果與上述研究報道一致，與臨近非腫瘤組織相比，胃癌組織中ATAD2表達(dá)顯著升高。

盡管大量文獻分析了ATAD2過表達(dá)與多種腫瘤患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，而較少見到關(guān)于其在胃癌中的報道。為檢測ATAD2蛋白在胃癌患者中表達(dá)的意義，本研究采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測了166例胃癌樣本中ATAD2表達(dá)情況，并探討其表達(dá)與胃癌患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系。結(jié)果提示ATAD2蛋白過表達(dá)與臨床分期、腫瘤侵襲深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)關(guān)系。這一結(jié)果與Zhang等在肺癌的研究結(jié)果一致，此外，其研究結(jié)果還提示ATAD2過表達(dá)還與肺癌患者腫瘤分化、腫瘤大小有關(guān)[19]。Wan等檢測ATAD2在110例卵巢癌中表達(dá)情況，結(jié)果證實其表達(dá)與患者腫瘤分期，網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移、腹水及CA125等密切相關(guān)[20]。此外，通過基因敲除卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)TAD2基因，結(jié)果表明其生長顯著抑制[20]。

本研究結(jié)果提示，胃癌患者ATAD2過表達(dá)時其基本總生存期預(yù)后不良，多重變量分析結(jié)果表明，ATAD2過表達(dá)是胃癌患者疾病預(yù)后不良的獨立因素。這一結(jié)果與Fellenberg等報道一致，其研究證實ATAD2過表達(dá)的骨肉瘤患者疾病總生存期顯著短于低表達(dá)患者[25]。此外，Kalashnikova等檢測185例乳腺癌樣本中ATAD2表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，ATAD2過表達(dá)與腫瘤分期相關(guān)，且過表達(dá)患者疾病臨床預(yù)后不良[14]。

總之，本研究結(jié)果證實胃癌組織中ATAD2 mRNA和蛋白過表達(dá)，且與患者臨床分期、腫瘤侵襲深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，且ATAD2過表達(dá)是胃癌患者疾病預(yù)后的獨立因素。

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ATAD2 over-expression is an independent poor prognostic biomarker for patients with gastric cancer

HUANGGuo-quan，SUNJian-hua，WUQuan-feng
(DepartmentofGastrointestinalSurgery，CentralHospitalofEnshiTujia-MiaoAutonomousPrefecture，Enshi445000，China)

Objective To investigate the prognostic value of expression of ATPase family AAA domain containing 2 (ATAD2) in patients with gastric cancer.Methods qRT-PCR was used to quantitatively detect the ATAD2 mRNA expression in 166 samples of fresh cancer and para-carcinoma tissues. Immunohistochemistry was used to examine ATAD2 protein expression in 166 paraffin-embedding samples. The relationship between clinicopathological features and ATAD2 expression was analyzed.Results The expression of ATAD2 mRNA and protein in gastric cancer samples were significantly higher than that in normal tissues (P< 0.001). ATAD2 over-expression was highly correlated with cancer clinical stage，tumor depth，lymph node metastasis and distant metastasis. According to our survival analysis，ATAD2 protein over-expression was a poor independent prognostic factor for patients with gastric cancer (P< 0.001).Conclusion ATAD2 could be used as a prognostic biomarker for patients with gastric cancer.

Gastric cancer，Prognosis；ATAD2；Biomarker

孫建華

R735.2

A

1672-6170(2016)06-0029-05

2016-01-09；

2016-06-24)