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        QKI基因多態(tài)位點(diǎn)與四川地區(qū)漢族人群冠心病的相關(guān)性分析

        2016-06-21 15:12:23楊馭媒毛元英成都市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科四川成都6005四川大學(xué)華西醫(yī)院心內(nèi)科四川成都6004
        實(shí)用醫(yī)院臨床雜志 2016年6期
        關(guān)鍵詞:單倍體等位基因多態(tài)性

        楊馭媒,毛元英,張 可,鄭 翼(.成都市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,四川 成都 6005;.四川大學(xué)華西醫(yī)院心內(nèi)科,四川 成都 6004)

        QKI基因多態(tài)位點(diǎn)與四川地區(qū)漢族人群冠心病的相關(guān)性分析

        楊馭媒1,毛元英1,張 可1,鄭 翼2
        (1.成都市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,四川 成都 610051;2.四川大學(xué)華西醫(yī)院心內(nèi)科,四川 成都 610041)

        目的 研究QKI基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)與四川地區(qū)漢族人群冠心病(coronary heart disease,CHD)發(fā)病的相關(guān)性。方法 入選570例CHD患者和735例正常對(duì)照(NC)樣本,通過(guò)病例-對(duì)照關(guān)聯(lián)研究方法,選擇QKI基因上4個(gè)標(biāo)簽SNP(rs7756185、rs6941513、rs7745161、rs7751144),以單堿基延伸(SNaPshot)方法進(jìn)行基因分型,并分析其與CHD的相關(guān)性。結(jié)果 QKI基因4個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P> 0.05)。其等位基因頻率在CHD組與NC組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。通過(guò)單倍體型分析發(fā)現(xiàn),這4個(gè)SNP位點(diǎn)處于同一個(gè)連鎖不平衡區(qū)域,其風(fēng)險(xiǎn)單倍體型TGGG可以增加CHD易感性0.25倍(P= 0.0051),而保護(hù)型的單倍體型GACA可降低CHD患病風(fēng)險(xiǎn)31%(P= 0.0003)。結(jié)論 QKI基因多態(tài)性位點(diǎn)與四川地區(qū)漢族人群CHD發(fā)病顯著相關(guān),其保護(hù)型等位基因可降低CHD的易感性。

        QKI基因;單核苷酸多態(tài)性;冠心??;易感性

        冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(coronary heart disease,CHD)嚴(yán)重危害人類健康。2013年,全球由冠心病導(dǎo)致的死亡人數(shù)超過(guò)800萬(wàn),居所有死亡原因的首位[1,2]。在我國(guó),CHD死亡率逐年上升;2014年,我國(guó)CHD死亡率城市為107.5/10萬(wàn)、農(nóng)村為105.37/10萬(wàn),僅次于腦卒中,居死亡原因第二位[3]。研究表明,CHD是由遺傳因素、環(huán)境因素和不良生活習(xí)慣共同作用所導(dǎo)致的復(fù)雜疾病[4~6],年齡、性別、吸煙、高血壓、高血脂、高血糖、肥胖、缺乏體力活動(dòng)以及過(guò)量飲酒等均與CHD的發(fā)生有關(guān)[7],遺傳因素也是CHD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵因子[8,9]。隨著全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome Wide Association Study,GWAS)方法的成功應(yīng)用,超過(guò)50個(gè)染色體區(qū)域被報(bào)道與CHD相關(guān)[10,11]。包括與血栓形成、血管收縮/舒張、能量代謝、脂質(zhì)代謝和炎癥相關(guān)的多個(gè)基因/位點(diǎn),其中9p21.3是比較公認(rèn)的CHD易感區(qū)域[10~12],但仍有部分研究結(jié)果因不同種族、不同地區(qū)人群以及不同研究方法而存在較大差異。最近,Abbas Dehghan等對(duì)15個(gè)歐洲人群,共計(jì)64297例研究對(duì)象:包含 3898例心肌梗塞(myocardial infarction,MI)患者和5465例 CHD患者,進(jìn)行GWAS meta分析,發(fā)現(xiàn)6q26區(qū)域QKI基因上的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)位點(diǎn)rs6941513與心肌梗塞和CHD均顯著相關(guān)[13]。該結(jié)果是基于歐洲人群的發(fā)現(xiàn),在中國(guó)人群中還未見(jiàn)QKI基因與CHD相關(guān)性的報(bào)道。因此,本研究選取QKI基因上的4個(gè)標(biāo)簽SNP位點(diǎn)(包括rs7756185、rs6941513、rs7745161和rs7751144),通過(guò)病例-對(duì)照關(guān)聯(lián)研究分析這4個(gè)位點(diǎn)與四川地區(qū)中國(guó)漢族人群CHD發(fā)病的相關(guān)性。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料 選取2009年3月至2015年10月期間,四川大學(xué)華西醫(yī)院和成都市第六人民醫(yī)院確診為CHD的住院患者570例為病例組(CHD組),平均年齡55.2歲(37~86歲),其中男性326例(57.2%)。CHD診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)國(guó)際心臟病協(xié)會(huì)/世界衛(wèi)生組織臨床命名標(biāo)準(zhǔn)化專題組聯(lián)合制定的指南,或者冠狀動(dòng)脈造影陽(yáng)性(顯示有至少一支冠狀動(dòng)脈直徑狹窄≥50%)。選取健康體檢人群735例作為正常對(duì)照組(NC組),平均年齡62.6歲(50~81歲),其中男性399例(54.3%)。兩組均為四川地區(qū)漢族人群,CHD組的血壓、空腹血糖、甘油三酯、低密度脂蛋白水平均高于NC組(P < 0.05),一般資料比較見(jiàn)表1。本項(xiàng)研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有調(diào)查和取樣均征得受試者同意并簽署知情同意書(shū)。

        表1 兩組一般資料比較

        與對(duì)照組比較,*P< 0.05;**P< 0.01

        1.2 生化指標(biāo)檢測(cè) 血漿總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、葡萄糖(GLU)測(cè)定:受試者過(guò)夜空腹(8小時(shí)以上)后采集靜脈血;所有生化檢測(cè)均在成都市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科進(jìn)行。

        1.3 基因組DNA提取 采集受試者外周靜脈血5 ml(EDTA抗凝),加入0.2%NaCl溶液,振蕩,置冰上15分鐘,3000 rpm離心30分鐘,棄掉上清液,用0.2%的NaCl溶液洗滌一次,加入10 mM Tris-HCl (pH=8.0)和10 mM EDTA (4 ml),10% SDS,25 mg/ml的蛋白酶K和10 mg/ml的RNaseA,加入量分別為4 ml、16 μl和20 μl,混勻,37 ℃過(guò)夜孵育,加入4 ml酚/Tris溶液,混勻,3000 rpm離心10分鐘,氯仿抽提兩次,采集水相,加入l/10體積的3M NaAC (pH=5.2),兩倍體積的無(wú)水乙醇,使DNA沉淀,再用70%的乙醇洗滌兩次以獲得基因組DNA,溶解于TE溶液中,然后定量測(cè)定在260 nm的吸收率,計(jì)算DNA濃度,并將DNA工作液濃度校正至50 ng/μl,置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增目的片段 從基因組數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=snp&cmd)獲取QKI基因4個(gè)SNP(rs7756185、rs6941513、rs7745161、rs7751144)位點(diǎn)周圍的基因組序列,采用Primer 3.0在線軟件輔助設(shè)計(jì)引物,由上海生工生物工程有限公司合成(PCR引物序列見(jiàn)表2)。PCR 反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性 5分鐘,經(jīng)(95 ℃ 30秒,57 ℃ 30秒,72 ℃延伸30秒)× 35個(gè)循環(huán),72 ℃延伸7分鐘,12 ℃保溫。

        表2 QKI基因4個(gè)SNP位點(diǎn)的PCR和SNaPshot引物序列

        1.5 基因分型 采用單堿基延伸(SNaPshot)法。PCR產(chǎn)物純化:9 μl PCR 產(chǎn)物(4個(gè)位點(diǎn)各2.25 μl)加入1 U堿性磷酸酶(美國(guó)Promega公司)以及1 U 核酸外切酶(英國(guó)Biolabs公司),混勻,37 ℃ 30分鐘,75 ℃ 15分鐘。取純化后的產(chǎn)物1μl,分別加入4個(gè)SNaPshot引物各0.2 μl(SNaPshot引物序列見(jiàn)表2),SNPshot Multiplex試劑1μl(美國(guó)ABI公司),ddH2O補(bǔ)足5 μl。反應(yīng)條件:96 ℃1 分鐘,經(jīng)(96 ℃ 10秒,50 ℃ 5秒,60 ℃ 30秒)× 25個(gè)循環(huán),12 ℃保溫。5 μl上述產(chǎn)物中加入1 U堿性磷酸酶,混勻,37 ℃ 15分鐘,75 ℃ 15分鐘。取上步產(chǎn)物1 μl,加入HD 9 μl,ABI 3730XL測(cè)序儀檢測(cè)基因型,通過(guò)Genemap軟件讀取基因分型情況。

        1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。單倍型分析采用Haploview 4.2軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用t檢驗(yàn)。Hardy-Weinberg 平衡、基因型、等位基因頻率的組間分布比較采用χ2檢驗(yàn),應(yīng)用多因素回歸分析基因多態(tài)性與CHD的相關(guān)性。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 QKI基因SNP位點(diǎn)基因型分布情況 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯示,4個(gè)位點(diǎn)的基因型在CHD組和NC組中的分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P> 0.05,表3),說(shuō)明本研究資料具有群體代表性。CHD和NC組間4個(gè)位點(diǎn)的基因型分布比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P< 0.01);各自小等位基因的純合子對(duì)于CHD的發(fā)生具有保護(hù)作用。見(jiàn)表3。

        表3 兩組QKI基因4個(gè)SNP位點(diǎn)中基因型分布情況

        2.2 QKI基因SNP位點(diǎn)在CHD組和NC組間的等位基因頻率比較 校正年齡、性別等參數(shù)之后,CHD患者(CHD)組和對(duì)照(NC)組QKI基因上4個(gè)SNP位點(diǎn)的等位基因頻率比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P< 0.01),見(jiàn)表4。

        表4 兩組QKI基因4個(gè)SNP位點(diǎn)等位基因頻率比較

        2.3 連鎖不平衡和單倍體型分析 采用Haploview 4.2 軟件對(duì)QKI基因4個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,這4個(gè)SNP位點(diǎn)處于同一連鎖不平衡區(qū)域(linkage disequilibrium block,LD)。進(jìn)一步比較4個(gè)位點(diǎn)所組成的單倍體型發(fā)現(xiàn),共產(chǎn)生6個(gè)單倍體型,其中風(fēng)險(xiǎn)單倍體型(H1:TGGG)可以增加CHD易感性0.25倍(P= 0.0051,表5),而保護(hù)型的單倍體型(H2:GACA)則可降低CHD的患病風(fēng)險(xiǎn)31%(P= 0.0003),見(jiàn)表5。

        3 討論

        近年來(lái),GWAS已經(jīng)成功應(yīng)用于多種復(fù)雜疾病的易感基因研究,包括老年黃斑變性、糖尿病、肺癌和結(jié)腸癌等。但關(guān)鍵問(wèn)題是GWAS的結(jié)果是否適用于不同種族以及不同人群;因此,要鑒定出真正的疾病易感基因,還需要對(duì)GWAS結(jié)果在其他獨(dú)立樣本人群中進(jìn)行驗(yàn)證。本研究針對(duì)最近的一項(xiàng)歐洲人群CHDGWAS meta分析的結(jié)果[13],在四川地區(qū)漢族人群中進(jìn)行了進(jìn)一步的驗(yàn)證。選取QKI基因上4個(gè)SNP位點(diǎn)(rs7756185、rs6941513、rs7745161和rs7751144)在570例CHD組和735例NC組中進(jìn)行基因分型,并對(duì)其基因型和等位基因頻率在兩組之間統(tǒng)計(jì)比較。發(fā)現(xiàn)這4個(gè)SNP位點(diǎn)均與CHD發(fā)病顯著相關(guān),其小等位基因可以降低CHD的易感性,本研究結(jié)果證實(shí)了歐洲人群的發(fā)現(xiàn)。

        表5 QKI基因4個(gè)SNP位點(diǎn)的單倍體型分析

        QKI基因編碼QUAKING蛋白,是一類RNA結(jié)合蛋白,對(duì)基因表達(dá)起著關(guān)鍵性的調(diào)控作用[14,15]。功能學(xué)研究表明,QKI對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的收縮具有重要調(diào)控作用,抑制QKI活性可以促進(jìn)血管損傷時(shí)的纖維化進(jìn)程[16]。QKI的RNA結(jié)合活性在單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞的過(guò)程中有著舉足輕重的作用[17]。單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞時(shí)都伴隨著QKI表達(dá)的降低,這在斑塊內(nèi)出血導(dǎo)致的動(dòng)脈粥樣硬化損傷中均能檢測(cè)到。QKI的低表達(dá)同時(shí)也會(huì)延緩單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞的進(jìn)程,干擾其形成泡沫細(xì)胞的能力,并且阻滯動(dòng)脈粥樣硬化損傷過(guò)程中單核細(xì)胞的滲透[17]。

        結(jié)合這些功能研究和遺傳學(xué)的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)QKI在炎癥反應(yīng)過(guò)程中起著一定作用,可以作為心血管疾病潛在的治療靶點(diǎn)。進(jìn)一步研究QKI基因及其編碼蛋白的功能和作用機(jī)理將有助于CHD的早期診斷及精準(zhǔn)防治。

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        Association Study between SNPs in the QKI Gene and Coronary Heart Disease in a Sichuan Han Chinese Population

        YANGYu-mei1,MAOYuan-ying1,ZHANGKe1,ZHENGYi2
        (1.ClinicalLaboratory,No.6People’sHospitalofChengdu,Chengdu610051,China;2.DepartmentofCardiovascularMedicine,WestChinaHospital,SichuanUniversity,Chengdu610041,China)

        ZHENGYi

        Objective To investigate the association between single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the QKI gene and coronary heart disease (CHD) in a Sichuan Han Chinese population. Methods Four SNPs (rs7756185,rs6941513,rs7745161 and rs7751144) in the QKI gene were genotyped by the SNaPshot method in a cohort composed of 570 patients with CHD and 735 normal controls of Han Chinese descent. Results All the genotype frequencies of these SNPs were in Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) (P> 0.05). We found that these four SNPs were significantly associated with CHD in this cohort (均P< 0.01). These four SNPs were in the same linkage disequilibrium (LD) block. The risk haplotype TGGG generated by the four SNPs showed significant association with CHD (P= 0.0051,OR=1.25),and the protective haplotype GACA also showed significant association with CHD (P= 0.0003,OR=0.69) in this cohort. Conclusion Our results suggest that genetic variants in the QKI gene were significantly associated with CHD in the Sichuan Han Chinese population.

        QKI gene;single nucleotide polymorphism;coronary heart disease;susceptibility

        國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào):30900626)

        鄭 翼

        R541.4;R394.3

        A

        1672-6170(2016)06-0019-04

        2016-05-11;

        2016-10-25)

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