楊馭媒,毛元英,張 可,鄭 翼(.成都市第六人民醫(yī)院檢驗科,四川 成都 6005;.四川大學(xué)華西醫(yī)院心內(nèi)科,四川 成都 6004)
QKI基因多態(tài)位點與四川地區(qū)漢族人群冠心病的相關(guān)性分析
楊馭媒1,毛元英1,張 可1,鄭 翼2
(1.成都市第六人民醫(yī)院檢驗科,四川 成都 610051;2.四川大學(xué)華西醫(yī)院心內(nèi)科,四川 成都 610041)
目的 研究QKI基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點與四川地區(qū)漢族人群冠心病(coronary heart disease,CHD)發(fā)病的相關(guān)性。方法 入選570例CHD患者和735例正常對照(NC)樣本,通過病例-對照關(guān)聯(lián)研究方法,選擇QKI基因上4個標簽SNP(rs7756185、rs6941513、rs7745161、rs7751144),以單堿基延伸(SNaPshot)方法進行基因分型,并分析其與CHD的相關(guān)性。結(jié)果 QKI基因4個SNP位點的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P> 0.05)。其等位基因頻率在CHD組與NC組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)。通過單倍體型分析發(fā)現(xiàn),這4個SNP位點處于同一個連鎖不平衡區(qū)域,其風(fēng)險單倍體型TGGG可以增加CHD易感性0.25倍(P= 0.0051),而保護型的單倍體型GACA可降低CHD患病風(fēng)險31%(P= 0.0003)。結(jié)論 QKI基因多態(tài)性位點與四川地區(qū)漢族人群CHD發(fā)病顯著相關(guān),其保護型等位基因可降低CHD的易感性。
QKI基因;單核苷酸多態(tài)性;冠心?。灰赘行?/p>
冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary heart disease,CHD)嚴重危害人類健康。2013年,全球由冠心病導(dǎo)致的死亡人數(shù)超過800萬,居所有死亡原因的首位[1,2]。在我國,CHD死亡率逐年上升;2014年,我國CHD死亡率城市為107.5/10萬、農(nóng)村為105.37/10萬,僅次于腦卒中,居死亡原因第二位[3]。研究表明,CHD是由遺傳因素、環(huán)境因素和不良生活習(xí)慣共同作用所導(dǎo)致的復(fù)雜疾病[4~6],年齡、性別、吸煙、高血壓、高血脂、高血糖、肥胖、缺乏體力活動以及過量飲酒等均與CHD的發(fā)生有關(guān)[7],遺傳因素也是CHD發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵因子[8,9]。隨著全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome Wide Association Study,GWAS)方法的成功應(yīng)用,超過50個染色體區(qū)域被報道與CHD相關(guān)[10,11]。包括與血栓形成、血管收縮/舒張、能量代謝、脂質(zhì)代謝和炎癥相關(guān)的多個基因/位點,其中9p21.3是比較公認的CHD易感區(qū)域[10~12],但仍有部分研究結(jié)果因不同種族、不同地區(qū)人群以及不同研究方法而存在較大差異。最近,Abbas Dehghan等對15個歐洲人群,共計64297例研究對象:包含 3898例心肌梗塞(myocardial infarction,MI)患者和5465例 CHD患者,進行GWAS meta分析,發(fā)現(xiàn)6q26區(qū)域QKI基因上的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)位點rs6941513與心肌梗塞和CHD均顯著相關(guān)[13]。該結(jié)果是基于歐洲人群的發(fā)現(xiàn),在中國人群中還未見QKI基因與CHD相關(guān)性的報道。因此,本研究選取QKI基因上的4個標簽SNP位點(包括rs7756185、rs6941513、rs7745161和rs7751144),通過病例-對照關(guān)聯(lián)研究分析這4個位點與四川地區(qū)中國漢族人群CHD發(fā)病的相關(guān)性。
1.1 一般資料 選取2009年3月至2015年10月期間,四川大學(xué)華西醫(yī)院和成都市第六人民醫(yī)院確診為CHD的住院患者570例為病例組(CHD組),平均年齡55.2歲(37~86歲),其中男性326例(57.2%)。CHD診斷標準依據(jù)國際心臟病協(xié)會/世界衛(wèi)生組織臨床命名標準化專題組聯(lián)合制定的指南,或者冠狀動脈造影陽性(顯示有至少一支冠狀動脈直徑狹窄≥50%)。選取健康體檢人群735例作為正常對照組(NC組),平均年齡62.6歲(50~81歲),其中男性399例(54.3%)。兩組均為四川地區(qū)漢族人群,CHD組的血壓、空腹血糖、甘油三酯、低密度脂蛋白水平均高于NC組(P < 0.05),一般資料比較見表1。本項研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準,所有調(diào)查和取樣均征得受試者同意并簽署知情同意書。
表1 兩組一般資料比較
與對照組比較,*P< 0.05;**P< 0.01
1.2 生化指標檢測 血漿總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、葡萄糖(GLU)測定:受試者過夜空腹(8小時以上)后采集靜脈血;所有生化檢測均在成都市第六人民醫(yī)院檢驗科進行。
1.3 基因組DNA提取 采集受試者外周靜脈血5 ml(EDTA抗凝),加入0.2%NaCl溶液,振蕩,置冰上15分鐘,3000 rpm離心30分鐘,棄掉上清液,用0.2%的NaCl溶液洗滌一次,加入10 mM Tris-HCl (pH=8.0)和10 mM EDTA (4 ml),10% SDS,25 mg/ml的蛋白酶K和10 mg/ml的RNaseA,加入量分別為4 ml、16 μl和20 μl,混勻,37 ℃過夜孵育,加入4 ml酚/Tris溶液,混勻,3000 rpm離心10分鐘,氯仿抽提兩次,采集水相,加入l/10體積的3M NaAC (pH=5.2),兩倍體積的無水乙醇,使DNA沉淀,再用70%的乙醇洗滌兩次以獲得基因組DNA,溶解于TE溶液中,然后定量測定在260 nm的吸收率,計算DNA濃度,并將DNA工作液濃度校正至50 ng/μl,置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.4 聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增目的片段 從基因組數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=snp&cmd)獲取QKI基因4個SNP(rs7756185、rs6941513、rs7745161、rs7751144)位點周圍的基因組序列,采用Primer 3.0在線軟件輔助設(shè)計引物,由上海生工生物工程有限公司合成(PCR引物序列見表2)。PCR 反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性 5分鐘,經(jīng)(95 ℃ 30秒,57 ℃ 30秒,72 ℃延伸30秒)× 35個循環(huán),72 ℃延伸7分鐘,12 ℃保溫。
表2 QKI基因4個SNP位點的PCR和SNaPshot引物序列
1.5 基因分型 采用單堿基延伸(SNaPshot)法。PCR產(chǎn)物純化:9 μl PCR 產(chǎn)物(4個位點各2.25 μl)加入1 U堿性磷酸酶(美國Promega公司)以及1 U 核酸外切酶(英國Biolabs公司),混勻,37 ℃ 30分鐘,75 ℃ 15分鐘。取純化后的產(chǎn)物1μl,分別加入4個SNaPshot引物各0.2 μl(SNaPshot引物序列見表2),SNPshot Multiplex試劑1μl(美國ABI公司),ddH2O補足5 μl。反應(yīng)條件:96 ℃1 分鐘,經(jīng)(96 ℃ 10秒,50 ℃ 5秒,60 ℃ 30秒)× 25個循環(huán),12 ℃保溫。5 μl上述產(chǎn)物中加入1 U堿性磷酸酶,混勻,37 ℃ 15分鐘,75 ℃ 15分鐘。取上步產(chǎn)物1 μl,加入HD 9 μl,ABI 3730XL測序儀檢測基因型,通過Genemap軟件讀取基因分型情況。
1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 所有統(tǒng)計分析使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。單倍型分析采用Haploview 4.2軟件。計量資料以均數(shù)±標準差表示,組間比較采用t檢驗。Hardy-Weinberg 平衡、基因型、等位基因頻率的組間分布比較采用χ2檢驗,應(yīng)用多因素回歸分析基因多態(tài)性與CHD的相關(guān)性。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 QKI基因SNP位點基因型分布情況 Hardy-Weinberg平衡檢驗結(jié)果顯示,4個位點的基因型在CHD組和NC組中的分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P> 0.05,表3),說明本研究資料具有群體代表性。CHD和NC組間4個位點的基因型分布比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P< 0.01);各自小等位基因的純合子對于CHD的發(fā)生具有保護作用。見表3。
表3 兩組QKI基因4個SNP位點中基因型分布情況
2.2 QKI基因SNP位點在CHD組和NC組間的等位基因頻率比較 校正年齡、性別等參數(shù)之后,CHD患者(CHD)組和對照(NC)組QKI基因上4個SNP位點的等位基因頻率比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P< 0.01),見表4。
表4 兩組QKI基因4個SNP位點等位基因頻率比較
2.3 連鎖不平衡和單倍體型分析 采用Haploview 4.2 軟件對QKI基因4個SNP位點進行分析,結(jié)果顯示,這4個SNP位點處于同一連鎖不平衡區(qū)域(linkage disequilibrium block,LD)。進一步比較4個位點所組成的單倍體型發(fā)現(xiàn),共產(chǎn)生6個單倍體型,其中風(fēng)險單倍體型(H1:TGGG)可以增加CHD易感性0.25倍(P= 0.0051,表5),而保護型的單倍體型(H2:GACA)則可降低CHD的患病風(fēng)險31%(P= 0.0003),見表5。
近年來,GWAS已經(jīng)成功應(yīng)用于多種復(fù)雜疾病的易感基因研究,包括老年黃斑變性、糖尿病、肺癌和結(jié)腸癌等。但關(guān)鍵問題是GWAS的結(jié)果是否適用于不同種族以及不同人群;因此,要鑒定出真正的疾病易感基因,還需要對GWAS結(jié)果在其他獨立樣本人群中進行驗證。本研究針對最近的一項歐洲人群CHDGWAS meta分析的結(jié)果[13],在四川地區(qū)漢族人群中進行了進一步的驗證。選取QKI基因上4個SNP位點(rs7756185、rs6941513、rs7745161和rs7751144)在570例CHD組和735例NC組中進行基因分型,并對其基因型和等位基因頻率在兩組之間統(tǒng)計比較。發(fā)現(xiàn)這4個SNP位點均與CHD發(fā)病顯著相關(guān),其小等位基因可以降低CHD的易感性,本研究結(jié)果證實了歐洲人群的發(fā)現(xiàn)。
表5 QKI基因4個SNP位點的單倍體型分析
QKI基因編碼QUAKING蛋白,是一類RNA結(jié)合蛋白,對基因表達起著關(guān)鍵性的調(diào)控作用[14,15]。功能學(xué)研究表明,QKI對血管平滑肌細胞的收縮具有重要調(diào)控作用,抑制QKI活性可以促進血管損傷時的纖維化進程[16]。QKI的RNA結(jié)合活性在單核細胞分化為巨噬細胞的過程中有著舉足輕重的作用[17]。單核細胞轉(zhuǎn)化為巨噬細胞時都伴隨著QKI表達的降低,這在斑塊內(nèi)出血導(dǎo)致的動脈粥樣硬化損傷中均能檢測到。QKI的低表達同時也會延緩單核細胞分化為巨噬細胞的進程,干擾其形成泡沫細胞的能力,并且阻滯動脈粥樣硬化損傷過程中單核細胞的滲透[17]。
結(jié)合這些功能研究和遺傳學(xué)的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)QKI在炎癥反應(yīng)過程中起著一定作用,可以作為心血管疾病潛在的治療靶點。進一步研究QKI基因及其編碼蛋白的功能和作用機理將有助于CHD的早期診斷及精準防治。
[1] GBD 2013 Mortality and Causes of Death Collaborators. Global,regional,and national age-sex specific all-cause and cause-specific mortality for 240 causes of death,1990-2013:a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013 [J]. Lancet,2015,385:117-171.
[2] Moran AE,F(xiàn)orouzanfar MH,Roth GA,et al. The global burden of ischemic heart disease in 1990 and 2010:the Global Burden of Disease 2010 study [J]. Circulation,2014,129(14):1493-1501.
[3] 中國心血管病報告編寫組. 《中國心血管病報告2015》概要[J]. 中國循環(huán)雜志,2016,31(6):521-528.
[4] Chilton R. Pathophysiology of coronary heart disease:a brief review [J]. J Am Osteopath Assoc,2004,104(9 Suppl 7):S5-S8.
[5] Pjanic M1,Miller CL,Wirka R,et al. Genetics and Genomics of Coronary Artery Disease [J]. Curr Cardiol Rep,2016,18(10):102.
[6] McPherson R,Tybjaerg-Hansen A. Genetics of Coronary Artery Disease [J]. Circ Res. 2016,118(4):564-578.
[7] Go AS,Mozaffarian D,Roger VL,et al. Heart disease and stroke statistics-2014 update:a report from the American Heart Association [J]. Circulation,2014,129:e28-e292
[8] Lloyd-Jones DM,Nam BH,D’Agostino RB,et al. Parental cardiovascular disease as a risk factor for cardiovascular disease in middle-aged adults:a prospective study of parents and offspring [J]. JAMA,2004,291(18):2204-2211.
[9] Marenberg ME,Risch N,Berkman LF,et al. Genetic susceptibility to death from coronary heart disease in a study of twins [J]. N Engl J Med,1994,330(15):1041-6.
[10]Deloukas P,Kanoni S,Willenborg C,et al. Large-scale association analysis identifies new risk loci for coronary artery disease [J]. Nat Genet,2013,45(1):25-33.
[11]Nikpay M,Goel A,Won HH,et al. A comprehensive 1000 Genomes-based genome-wide association meta-analysis of coronary artery disease [J]. Nat Genet,2015,47(10):1121-1130.
[12]Samani NJ,Erdmann J,Hall AS,et al. Genomewide association analysis of coronary artery disease [J]. N Engl J Med,2007,357(5):443-453.
[13]Dehghan A,Bis JC,White CC,et al. Consortium. Genome-Wide Association Study for Incident Myocardial Infarction and Coronary Heart Disease in Prospective Cohort Studies:The CHARGE Consortium [J]. PLoS ONE,2016,11(3):e0144997.
[14]Apponi LH,Corbett AH,Pavlath GK. RNA-binding proteins and gene regulation in myogenesis [J]. Trends Pharmacol Sci,2011,32:652-658.
[15]Chénard CA,Richard S. New implications for the QUAKING RNA binding protein in human disease [J]. J Neurosci Res. 2008,86:233-242.
[16]van der Veer E,de Bruin RG,Kraaijeveld A,et al. Quaking,an RNA-binding protein,is a critical regulator of vascular smooth muscle cell phenotype [J]. Circ Res,2013,113(9):1065-1075.
[17]de Bruin RG,Shiue L,Prins J,et al. Quaking promotes monocyte differentiation into pro-atherogenic macrophages by controlling pre-mRNA splicing and gene expression [J]. Nat Commun,2016,7:10846.
Association Study between SNPs in the QKI Gene and Coronary Heart Disease in a Sichuan Han Chinese Population
YANGYu-mei1,MAOYuan-ying1,ZHANGKe1,ZHENGYi2
(1.ClinicalLaboratory,No.6People’sHospitalofChengdu,Chengdu610051,China;2.DepartmentofCardiovascularMedicine,WestChinaHospital,SichuanUniversity,Chengdu610041,China)
ZHENGYi
Objective To investigate the association between single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the QKI gene and coronary heart disease (CHD) in a Sichuan Han Chinese population. Methods Four SNPs (rs7756185,rs6941513,rs7745161 and rs7751144) in the QKI gene were genotyped by the SNaPshot method in a cohort composed of 570 patients with CHD and 735 normal controls of Han Chinese descent. Results All the genotype frequencies of these SNPs were in Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) (P> 0.05). We found that these four SNPs were significantly associated with CHD in this cohort (均P< 0.01). These four SNPs were in the same linkage disequilibrium (LD) block. The risk haplotype TGGG generated by the four SNPs showed significant association with CHD (P= 0.0051,OR=1.25),and the protective haplotype GACA also showed significant association with CHD (P= 0.0003,OR=0.69) in this cohort. Conclusion Our results suggest that genetic variants in the QKI gene were significantly associated with CHD in the Sichuan Han Chinese population.
QKI gene;single nucleotide polymorphism;coronary heart disease;susceptibility
國家自然科學(xué)基金資助項目(編號:30900626)
鄭 翼
R541.4;R394.3
A
1672-6170(2016)06-0019-04
2016-05-11;
2016-10-25)