楊馭媒，毛元英，張 可，鄭 翼(.成都市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 成都 6005；.四川大學(xué)華西醫(yī)院心內(nèi)科，四川 成都 6004)

QKI基因多態(tài)位點(diǎn)與四川地區(qū)漢族人群冠心病的相關(guān)性分析

楊馭媒1，毛元英1，張 可1，鄭 翼2
(1.成都市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 成都 610051；2.四川大學(xué)華西醫(yī)院心內(nèi)科，四川 成都 610041)

目的 研究QKI基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)與四川地區(qū)漢族人群冠心病(coronary heart disease，CHD)發(fā)病的相關(guān)性。方法 入選570例CHD患者和735例正常對(duì)照(NC)樣本，通過(guò)病例-對(duì)照關(guān)聯(lián)研究方法，選擇QKI基因上4個(gè)標(biāo)簽SNP(rs7756185、rs6941513、rs7745161、rs7751144)，以單堿基延伸(SNaPshot)方法進(jìn)行基因分型，并分析其與CHD的相關(guān)性。結(jié)果 QKI基因4個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P> 0.05)。其等位基因頻率在CHD組與NC組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。通過(guò)單倍體型分析發(fā)現(xiàn)，這4個(gè)SNP位點(diǎn)處于同一個(gè)連鎖不平衡區(qū)域，其風(fēng)險(xiǎn)單倍體型TGGG可以增加CHD易感性0.25倍(P= 0.0051)，而保護(hù)型的單倍體型GACA可降低CHD患病風(fēng)險(xiǎn)31%(P= 0.0003)。結(jié)論 QKI基因多態(tài)性位點(diǎn)與四川地區(qū)漢族人群CHD發(fā)病顯著相關(guān)，其保護(hù)型等位基因可降低CHD的易感性。

QKI基因；單核苷酸多態(tài)性；冠心??；易感性

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(coronary heart disease，CHD)嚴(yán)重危害人類健康。2013年，全球由冠心病導(dǎo)致的死亡人數(shù)超過(guò)800萬(wàn)，居所有死亡原因的首位[1，2]。在我國(guó)，CHD死亡率逐年上升；2014年，我國(guó)CHD死亡率城市為107.5/10萬(wàn)、農(nóng)村為105.37/10萬(wàn)，僅次于腦卒中，居死亡原因第二位[3]。研究表明，CHD是由遺傳因素、環(huán)境因素和不良生活習(xí)慣共同作用所導(dǎo)致的復(fù)雜疾病[4～6]，年齡、性別、吸煙、高血壓、高血脂、高血糖、肥胖、缺乏體力活動(dòng)以及過(guò)量飲酒等均與CHD的發(fā)生有關(guān)[7]，遺傳因素也是CHD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵因子[8，9]。隨著全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome Wide Association Study，GWAS)方法的成功應(yīng)用，超過(guò)50個(gè)染色體區(qū)域被報(bào)道與CHD相關(guān)[10，11]。包括與血栓形成、血管收縮/舒張、能量代謝、脂質(zhì)代謝和炎癥相關(guān)的多個(gè)基因/位點(diǎn)，其中9p21.3是比較公認(rèn)的CHD易感區(qū)域[10～12]，但仍有部分研究結(jié)果因不同種族、不同地區(qū)人群以及不同研究方法而存在較大差異。最近，Abbas Dehghan等對(duì)15個(gè)歐洲人群，共計(jì)64297例研究對(duì)象：包含 3898例心肌梗塞(myocardial infarction，MI)患者和5465例 CHD患者，進(jìn)行GWAS meta分析，發(fā)現(xiàn)6q26區(qū)域QKI基因上的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點(diǎn)rs6941513與心肌梗塞和CHD均顯著相關(guān)[13]。該結(jié)果是基于歐洲人群的發(fā)現(xiàn)，在中國(guó)人群中還未見(jiàn)QKI基因與CHD相關(guān)性的報(bào)道。因此，本研究選取QKI基因上的4個(gè)標(biāo)簽SNP位點(diǎn)(包括rs7756185、rs6941513、rs7745161和rs7751144)，通過(guò)病例-對(duì)照關(guān)聯(lián)研究分析這4個(gè)位點(diǎn)與四川地區(qū)中國(guó)漢族人群CHD發(fā)病的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2009年3月至2015年10月期間，四川大學(xué)華西醫(yī)院和成都市第六人民醫(yī)院確診為CHD的住院患者570例為病例組(CHD組)，平均年齡55.2歲(37～86歲)，其中男性326例(57.2%)。CHD診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)國(guó)際心臟病協(xié)會(huì)/世界衛(wèi)生組織臨床命名標(biāo)準(zhǔn)化專題組聯(lián)合制定的指南，或者冠狀動(dòng)脈造影陽(yáng)性(顯示有至少一支冠狀動(dòng)脈直徑狹窄≥50%)。選取健康體檢人群735例作為正常對(duì)照組(NC組)，平均年齡62.6歲(50～81歲)，其中男性399例(54.3%)。兩組均為四川地區(qū)漢族人群，CHD組的血壓、空腹血糖、甘油三酯、低密度脂蛋白水平均高于NC組(P < 0.05)，一般資料比較見(jiàn)表1。本項(xiàng)研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有調(diào)查和取樣均征得受試者同意并簽署知情同意書(shū)。

表1 兩組一般資料比較

與對(duì)照組比較，*P< 0.05；**P< 0.01

1.2 生化指標(biāo)檢測(cè) 血漿總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、葡萄糖(GLU)測(cè)定：受試者過(guò)夜空腹(8小時(shí)以上)后采集靜脈血；所有生化檢測(cè)均在成都市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科進(jìn)行。

1.3 基因組DNA提取 采集受試者外周靜脈血5 ml(EDTA抗凝)，加入0.2%NaCl溶液，振蕩，置冰上15分鐘，3000 rpm離心30分鐘，棄掉上清液，用0.2%的NaCl溶液洗滌一次，加入10 mM Tris-HCl (pH=8.0)和10 mM EDTA (4 ml)，10% SDS，25 mg/ml的蛋白酶K和10 mg/ml的RNaseA，加入量分別為4 ml、16 μl和20 μl，混勻，37 ℃過(guò)夜孵育，加入4 ml酚/Tris溶液，混勻，3000 rpm離心10分鐘，氯仿抽提兩次，采集水相，加入l/10體積的3M NaAC (pH=5.2)，兩倍體積的無(wú)水乙醇，使DNA沉淀，再用70%的乙醇洗滌兩次以獲得基因組DNA，溶解于TE溶液中，然后定量測(cè)定在260 nm的吸收率，計(jì)算DNA濃度，并將DNA工作液濃度校正至50 ng/μl，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增目的片段 從基因組數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db=snp&cmd)獲取QKI基因4個(gè)SNP(rs7756185、rs6941513、rs7745161、rs7751144)位點(diǎn)周圍的基因組序列，采用Primer 3.0在線軟件輔助設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程有限公司合成(PCR引物序列見(jiàn)表2)。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性 5分鐘，經(jīng)(95 ℃ 30秒，57 ℃ 30秒，72 ℃延伸30秒)× 35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7分鐘，12 ℃保溫。

表2 QKI基因4個(gè)SNP位點(diǎn)的PCR和SNaPshot引物序列

1.5 基因分型 采用單堿基延伸(SNaPshot)法。PCR產(chǎn)物純化：9 μl PCR 產(chǎn)物(4個(gè)位點(diǎn)各2.25 μl)加入1 U堿性磷酸酶(美國(guó)Promega公司)以及1 U 核酸外切酶(英國(guó)Biolabs公司)，混勻，37 ℃ 30分鐘，75 ℃ 15分鐘。取純化后的產(chǎn)物1μl，分別加入4個(gè)SNaPshot引物各0.2 μl(SNaPshot引物序列見(jiàn)表2)，SNPshot Multiplex試劑1μl(美國(guó)ABI公司)，ddH2O補(bǔ)足5 μl。反應(yīng)條件：96 ℃1 分鐘，經(jīng)(96 ℃ 10秒，50 ℃ 5秒，60 ℃ 30秒)× 25個(gè)循環(huán)，12 ℃保溫。5 μl上述產(chǎn)物中加入1 U堿性磷酸酶，混勻，37 ℃ 15分鐘，75 ℃ 15分鐘。取上步產(chǎn)物1 μl，加入HD 9 μl，ABI 3730XL測(cè)序儀檢測(cè)基因型，通過(guò)Genemap軟件讀取基因分型情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。單倍型分析采用Haploview 4.2軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。Hardy-Weinberg 平衡、基因型、等位基因頻率的組間分布比較采用χ2檢驗(yàn)，應(yīng)用多因素回歸分析基因多態(tài)性與CHD的相關(guān)性。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 QKI基因SNP位點(diǎn)基因型分布情況 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯示，4個(gè)位點(diǎn)的基因型在CHD組和NC組中的分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P> 0.05，表3)，說(shuō)明本研究資料具有群體代表性。CHD和NC組間4個(gè)位點(diǎn)的基因型分布比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P< 0.01)；各自小等位基因的純合子對(duì)于CHD的發(fā)生具有保護(hù)作用。見(jiàn)表3。

表3 兩組QKI基因4個(gè)SNP位點(diǎn)中基因型分布情況

2.2 QKI基因SNP位點(diǎn)在CHD組和NC組間的等位基因頻率比較 校正年齡、性別等參數(shù)之后，CHD患者(CHD)組和對(duì)照(NC)組QKI基因上4個(gè)SNP位點(diǎn)的等位基因頻率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P< 0.01)，見(jiàn)表4。

表4 兩組QKI基因4個(gè)SNP位點(diǎn)等位基因頻率比較

2.3 連鎖不平衡和單倍體型分析 采用Haploview 4.2 軟件對(duì)QKI基因4個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，這4個(gè)SNP位點(diǎn)處于同一連鎖不平衡區(qū)域(linkage disequilibrium block，LD)。進(jìn)一步比較4個(gè)位點(diǎn)所組成的單倍體型發(fā)現(xiàn)，共產(chǎn)生6個(gè)單倍體型，其中風(fēng)險(xiǎn)單倍體型(H1：TGGG)可以增加CHD易感性0.25倍(P= 0.0051，表5)，而保護(hù)型的單倍體型(H2：GACA)則可降低CHD的患病風(fēng)險(xiǎn)31%(P= 0.0003)，見(jiàn)表5。

3 討論

近年來(lái)，GWAS已經(jīng)成功應(yīng)用于多種復(fù)雜疾病的易感基因研究，包括老年黃斑變性、糖尿病、肺癌和結(jié)腸癌等。但關(guān)鍵問(wèn)題是GWAS的結(jié)果是否適用于不同種族以及不同人群；因此，要鑒定出真正的疾病易感基因，還需要對(duì)GWAS結(jié)果在其他獨(dú)立樣本人群中進(jìn)行驗(yàn)證。本研究針對(duì)最近的一項(xiàng)歐洲人群CHDGWAS meta分析的結(jié)果[13]，在四川地區(qū)漢族人群中進(jìn)行了進(jìn)一步的驗(yàn)證。選取QKI基因上4個(gè)SNP位點(diǎn)(rs7756185、rs6941513、rs7745161和rs7751144)在570例CHD組和735例NC組中進(jìn)行基因分型，并對(duì)其基因型和等位基因頻率在兩組之間統(tǒng)計(jì)比較。發(fā)現(xiàn)這4個(gè)SNP位點(diǎn)均與CHD發(fā)病顯著相關(guān)，其小等位基因可以降低CHD的易感性，本研究結(jié)果證實(shí)了歐洲人群的發(fā)現(xiàn)。

表5 QKI基因4個(gè)SNP位點(diǎn)的單倍體型分析

QKI基因編碼QUAKING蛋白，是一類RNA結(jié)合蛋白，對(duì)基因表達(dá)起著關(guān)鍵性的調(diào)控作用[14，15]。功能學(xué)研究表明，QKI對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的收縮具有重要調(diào)控作用，抑制QKI活性可以促進(jìn)血管損傷時(shí)的纖維化進(jìn)程[16]。QKI的RNA結(jié)合活性在單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞的過(guò)程中有著舉足輕重的作用[17]。單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞時(shí)都伴隨著QKI表達(dá)的降低，這在斑塊內(nèi)出血導(dǎo)致的動(dòng)脈粥樣硬化損傷中均能檢測(cè)到。QKI的低表達(dá)同時(shí)也會(huì)延緩單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞的進(jìn)程，干擾其形成泡沫細(xì)胞的能力，并且阻滯動(dòng)脈粥樣硬化損傷過(guò)程中單核細(xì)胞的滲透[17]。

結(jié)合這些功能研究和遺傳學(xué)的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)QKI在炎癥反應(yīng)過(guò)程中起著一定作用，可以作為心血管疾病潛在的治療靶點(diǎn)。進(jìn)一步研究QKI基因及其編碼蛋白的功能和作用機(jī)理將有助于CHD的早期診斷及精準(zhǔn)防治。

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Association Study between SNPs in the QKI Gene and Coronary Heart Disease in a Sichuan Han Chinese Population

YANGYu-mei1，MAOYuan-ying1，ZHANGKe1，ZHENGYi2
(1.ClinicalLaboratory，No.6People’sHospitalofChengdu，Chengdu610051，China；2.DepartmentofCardiovascularMedicine，WestChinaHospital，SichuanUniversity，Chengdu610041，China)

ZHENGYi

Objective To investigate the association between single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the QKI gene and coronary heart disease (CHD) in a Sichuan Han Chinese population. Methods Four SNPs (rs7756185，rs6941513，rs7745161 and rs7751144) in the QKI gene were genotyped by the SNaPshot method in a cohort composed of 570 patients with CHD and 735 normal controls of Han Chinese descent. Results All the genotype frequencies of these SNPs were in Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) (P> 0.05). We found that these four SNPs were significantly associated with CHD in this cohort (均P< 0.01). These four SNPs were in the same linkage disequilibrium (LD) block. The risk haplotype TGGG generated by the four SNPs showed significant association with CHD (P= 0.0051，OR=1.25)，and the protective haplotype GACA also showed significant association with CHD (P= 0.0003，OR=0.69) in this cohort. Conclusion Our results suggest that genetic variants in the QKI gene were significantly associated with CHD in the Sichuan Han Chinese population.

QKI gene；single nucleotide polymorphism；coronary heart disease；susceptibility

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：30900626)

鄭 翼

R541.4；R394.3

A

1672-6170(2016)06-0019-04

2016-05-11；

2016-10-25)