王 婷，童榮生，鄒 靜，帥小翠，李晉奇

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院藥學(xué)部，四川 成都 610072)

高效液相色譜法測定理氣復(fù)胃口服液中大黃成分的含量

王 婷，童榮生，鄒 靜，帥小翠，李晉奇

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院藥學(xué)部，四川 成都 610072)

目的 建立理氣復(fù)胃口服液中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的含量測定方法，以控制該產(chǎn)品的質(zhì)量。方法 采用高效液相色譜法，使用Phenomenex Gemini C18柱(250 mm× 4.6 mm，5 μm，)，甲醇-乙腈-0.01mol/L NaH2PO4(pH1.5)(2∶5∶3.5，v//v)為流動相，流速1.0 ml/min，檢測波長435 nm。結(jié)果 蘆薈大黃酸、大黃酸、大黃素、大黃酚的濃度為0.8～16.0 μg/ml，大黃素甲醚的濃度為0.4～8.0 μg/ml，與其峰面積有良好的線性關(guān)系(r=0.9999)，蘆薈大黃酸、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚RSD分別是1.72%、1.13%、1.62%、2.04%、1.33%；蘆薈大黃酸、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚平均加樣回收率分別為98.87%、101.43%、100.63%、100.89%和102.41%。結(jié)論 該方法簡單易行，準(zhǔn)確可靠，可用于理氣復(fù)胃口服液的質(zhì)量控制。

理氣復(fù)胃口服液；蘆薈大黃素；大黃酸；大黃素；大黃酚；大黃素甲醚；高效液相色譜法

理氣復(fù)胃口服液是由木香、陳皮、大黃、白術(shù)、枳實(shí)等中藥組成，具有行氣導(dǎo)滯，降濕消痞的功能。臨床上用于治療功能性消化不良具有較好的療效，也可用于手術(shù)后胃腸功能的恢復(fù)?，F(xiàn)以蘆薈大黃素(Aloeemodin)、大黃素(Emodin)、大黃酸(Rhein)、大黃酚(Chrysophanol)和大黃素甲醚(Physcion)為指標(biāo)成分，建立了理氣復(fù)胃口服液中蘆薈大黃酸、大黃素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚的高效液相色譜(HPLC)測定法，為該產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供定量評價方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 Waters 2690高效液相色譜儀，包括中央控制器，高壓泵，全自動進(jìn)樣器，996二極管陣列檢測器，Empower Chromatography Manager 色譜數(shù)據(jù)工作站(美國Waters 公司)。BP 211D型十萬分之一電子分析天平(德國Sartorius公司)。大黃素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110756-200210)，大黃酚對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110796-200208)，大黃酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110757-200206)，蘆薈大黃素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110795-200806)，大黃素甲醚(中國藥品生物制品檢定所，批號110758-200611)。甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。理氣復(fù)胃口服液(四川省人民醫(yī)院·四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·川港康復(fù)中心，批號：141022、150120、150202)。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 分析柱Phenomenex Gemini C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm，110A)，保護(hù)柱Security Guard Cartridges Gemini C18(4 mm×3.0 mm)，柱溫35 ℃；流動相為甲醇-乙腈-0.01mol/L，NaHP2O4(pH1.5)(2∶5∶3.5)，流速1 ml/min，紫外檢測波長435 nm。

1.2.2 儲備液的制備 分別精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和大黃酚7.06 mg、2.77 mg、2.09 mg和2.19 mg，以甲醇溶解并定容至50 ml即得各成分儲備液，精密稱取大黃素甲醚2.89 mg，以甲醇溶解并定容至100 ml即得大黃素甲醚儲備液，置4 ℃冰箱避光儲存。

1.2.3 工作液的制備 精密大黃素、大黃酚、大黃酸、蘆薈大黃素和大黃素甲醚儲備液，加甲醇溶解并稀釋成每1 ml約含大黃素、大黃酚、大黃酸、蘆薈大黃素各4 μg，大黃素甲醚2 μg的混合工作溶液，置4 ℃冰箱避光儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取混合對照品儲備液適量，用甲醇分別稀釋至7個不同濃度，在1.2.1項(xiàng)色譜條件下，分別精密吸取系列濃度的混合對照品溶液10 μl，注入色譜儀，依次進(jìn)樣得系列對照品溶液，取其峰面積面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析。1.2.5 供試品溶液的制備 精密量取混勻的供試品溶液5 ml，置25 ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。精密量取稀釋液5 ml，置圓底燒瓶中，加入8%鹽酸10 ml，混勻，再加入三氯甲烷10 ml，混勻，置沸水浴上回流1小時，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌燒瓶，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷液提取3次，每次10 ml，合并三氯甲烷提取液，置37 ℃水浴上氮?dú)鈸]干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，轉(zhuǎn)移至10 ml容量瓶中，甲醇定容至刻度，混勻，以微孔濾膜(0.425 μm)過濾后進(jìn)樣10 μl。

1.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品(批號150120)按1.2.5項(xiàng)下制備方法平行制備6份樣品，按1.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，測定對照品峰面積積分值，按外標(biāo)法計(jì)算。

1.2.7 精密度試驗(yàn) 按1.2.5項(xiàng)下制備方法，精密量取供試品溶液10 μl，按1.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，測定對照品峰面積積分值，按外標(biāo)法計(jì)算。

1.2.8 樣品穩(wěn)定性考察 取1.2.6項(xiàng)下的供試品1份，室溫放置0、2、4、6、8、12、24 h后按1.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，分別進(jìn)樣，同時取混合對照品溶液進(jìn)樣測定，按外標(biāo)峰面積法測定其含量，比較24 h室溫放置后含量測定的結(jié)果。

1.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[1]，精密量取9份已知含量的同一批號供試品溶液(批號150120)，以高、中、低三濃度水平，每濃度水平三份樣品，各加入一定量的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚以及大黃素甲醚對照品，按照1.2.5項(xiàng)下方法處理，按1.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μl，同時取相應(yīng)濃度的對照品溶液10 μl 進(jìn)樣測定，按外標(biāo)峰面積法測定其含量。

1.2.10 樣品測定 取樣品3批(141022、150120、150202)，按照1.2.5項(xiàng)下方法制備供試品溶液，同時取混合對照品溶液按1.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，按外標(biāo)峰面積法測定其含量。

2 結(jié)果

2.1 色譜圖 樣品在對照品溶液中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚相應(yīng)峰位置，均有色譜峰出現(xiàn)，且分離度均大于1.5，空白供試品在蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚相應(yīng)峰位置均無雜質(zhì)干擾。對照品溶液、樣品及空白供試品色譜圖見圖1。

圖1 五種成分色譜圖 a：對照品溶液；b：樣品；c：空白供試品；1：蘆薈大黃素；2：大黃酸； 3：大黃素； 4：大黃酚；5：大黃素甲醚

2.2 線性關(guān)系 蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚在濃度0.8～16.0 μg/ml以及大黃素甲醚在濃度0.4～8.0 μg/ml線性關(guān)系良好，線性回歸方程見表1。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚的RSD分別為分別為2.55%、2.93%、2.33%、3.23%、3.99%。

2.4 精密度試驗(yàn) 蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚的RSD分別為分別為1.72%、1.13%、1.62%、2.04%、1.33%。

表1 各成分回歸方程

2.5 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn) 蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚的RSD分別為分別為2.25%、2.45%、2.60%、1.95%及2.25%，可見供試品室溫放置24 h較穩(wěn)定。

2.6 加樣回收率試驗(yàn) 供試品的平均回收率為蘆薈大黃素98.87%、大黃酸101.43%、大黃素100.63%、大黃酚100.89%及大黃素甲醚102.41%，見表2。

表2 各組分平均加樣回收率測定

2.7 樣品含量測定 取不同批號(141022、150120、150202)的理氣復(fù)胃口服液，按1.2.5項(xiàng)下測定蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚五種成分含量，見表3。

表3 理氣復(fù)胃口服液含量測定 (μg/ml)

3 討論

理氣復(fù)胃口服液為我醫(yī)院自制制劑，主要功效為行氣導(dǎo)滯，降濕消痞，該藥中大黃作為重要成分，具有主要的功效，且測定結(jié)果顯示成分穩(wěn)定。該藥中另一主要成分木香，經(jīng)測定發(fā)現(xiàn)其揮發(fā)性很強(qiáng)，測定及其不穩(wěn)定。故以大黃含量作為此口服液質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)。

大黃中成分的提取，既往有加熱回流提取和超聲提取法[2，3]，經(jīng)比較加熱回流提取率較高。在提取液的選擇上，文獻(xiàn)報(bào)道[4]預(yù)處理過程用乙醚提取，在實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)用三氯甲烷提取回收率較乙醚有很大提高。因此，本研究選擇三氯甲烷作為提取液。

據(jù)文獻(xiàn)[5]用紫外光譜分別對5種蒽醌類成分進(jìn)行全波長掃描，大黃的5種成分在254和435 nm附近均有吸收。經(jīng)比較，在254 nm下測定理氣復(fù)胃口服液中大黃5種成分，雜質(zhì)峰干擾測定；以435 nm為測定波長則無干擾，因此選擇435 nm作為檢測波長。

理氣復(fù)胃作為醫(yī)院自制制劑，在臨床應(yīng)用20余年，用于治療功能性消化不良有很好的療效，曾將同時測定制劑中大黃素、大黃酚2種蒽醌的含量作為控制該產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[6]。本試驗(yàn)經(jīng)改進(jìn)后，采用反相高效液相色潽法同時測定理氣復(fù)胃口服液中大黃5種蒽醌的含量，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證表明，其精密度、穩(wěn)定性、加樣回收率和重復(fù)性均能滿足定量的要求，故可用于理氣復(fù)胃口服液的質(zhì)量控制。

[1] 陳瑾.應(yīng)用高效液相色譜法測定清熱利膽合劑中綠原酸的含量分析[J].實(shí)用醫(yī)院臨床雜志，2015，9(12)：139-140.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2015年版一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

[3] 譚曉，周文杰，李復(fù)林.”一測多評”法同步測定大黃中五種蒽醌類成分的含量[J].首都食品與醫(yī)藥，2015，9：78-79.

[4] 童榮生.HPLC法同時測定理氣復(fù)胃口服液中木香內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的含量[J].中國藥師2006，9(8)：106-108.

[5] 何素琴，歐陽吉德，肖琳.HPLC法測定膽石通膠囊中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚的含量[J].西北藥學(xué)雜志，2011，26(3)：180-182.

[6] 吳正中，童榮生，席慶，等.HPLC測定理氣復(fù)胃口服液中大黃素和大黃酚的含量[J].華西藥學(xué)雜志，2002，17(1)：61-62.

R917

A

1672-6170(2016)04-0111-03

2016-01-27；

2016-03-30)