田 鯤，杜 芹，廖楚航，費(fèi) 偉，任小華

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院口腔科，四川 成都 610071)

人釉原蛋白功能片段LRAP的自組裝行為與礦化能力

田 鯤，杜 芹，廖楚航，費(fèi) 偉，任小華

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院口腔科，四川 成都 610071)

目的 重組并表達(dá)釉原蛋白N-端酪氨酸富集段(tyrosine-rich amelogenin peptide，TRAP)，研究其自組裝行為與礦化能力的關(guān)系。方法 合成TRAP基因，與原核表達(dá)載體pCold-SUMO行質(zhì)粒構(gòu)建，于BL21(DE3)Chaprone宿主菌中誘導(dǎo)表達(dá)并純化，在類(lèi)唾液Ca2+、PO43-環(huán)境中觀察其對(duì)羥基磷灰石晶體成核的誘導(dǎo)作用。結(jié)果 成功獲得人釉蛋白功能電段LRAP并在原核生物中表達(dá)，TRAP能聚集成類(lèi)釉原蛋白的納米球狀功能結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步誘導(dǎo)晶體生長(zhǎng)成熟。結(jié)論 TRAP是重要的釉原蛋白功能域，能部分模擬其定向誘導(dǎo)晶體礦化的能力，是修復(fù)不規(guī)則微量牙體硬組織缺損的又一選擇。

釉原蛋白；TRAP；羥基磷灰石；牙釉質(zhì)

對(duì)于含有多層級(jí)各向異性結(jié)構(gòu)的牙齒來(lái)說(shuō)，進(jìn)行完整的組織工程重建難度非常大，牙釉質(zhì)羥基磷灰石晶體的生長(zhǎng)發(fā)育堪稱(chēng)生物礦化的經(jīng)典：先由釉基質(zhì)蛋白(enamel matrix protein genes)形成礦化框架，搭建晶體的軟模型，隨后礦物離子沉積實(shí)現(xiàn)晶胞生長(zhǎng)和成熟[1]，任何簡(jiǎn)單理化方式均難再現(xiàn)此過(guò)程得到硬度與牙釉質(zhì)相當(dāng)?shù)木w產(chǎn)物。近年來(lái)從仿生礦化思路入手，體外搭建“仿真”的有機(jī)礦化模板，營(yíng)造合適的Ca2+、PO43-微環(huán)境成為微量牙釉質(zhì)晶體再生的合適方法。“仿真”礦化模板也經(jīng)歷了最初簡(jiǎn)單高分子到復(fù)雜多肽，再到直接提取體內(nèi)釉質(zhì)礦化模板的進(jìn)化[2～4]：簡(jiǎn)單高分子價(jià)格便宜、易于取材，但只能模擬釉質(zhì)晶體發(fā)育4個(gè)周期中某一階段蛋白模版的某些功能，得到的是相似某階段釉質(zhì)結(jié)構(gòu)的初級(jí)產(chǎn)物，尤其是晶體長(zhǎng)軸與纖維束成角無(wú)法有效操控，不能“無(wú)縫”整合到缺損牙體原位；類(lèi)釉原蛋白多肽能最大限度的模擬釉基質(zhì)蛋白中的絕對(duì)主角——釉原蛋白(Amelogenin，Am)的聚集，但難以在pH值變化時(shí)自組裝成納米微球超分子結(jié)構(gòu)，對(duì)釉原蛋白結(jié)構(gòu)時(shí)空調(diào)整帶來(lái)的晶體排列多向性未能再現(xiàn)。簡(jiǎn)而言之，礦化模板對(duì)釉原蛋白的模仿程度越高，生成的羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)晶體就越接近牙齒釉柱的排列，理化試驗(yàn)和遺傳學(xué)研究都反復(fù)佐證釉基質(zhì)蛋白在磷酸鈣類(lèi)生物礦物合成中具有不可替代的地位[5]。本實(shí)驗(yàn)直接取材處于成釉蛋白分泌期的人牙胚組織，對(duì)釉原蛋白的重要功能片段——酪氨酸富集段(tyrosine-rich amelogenin peptide，TRAP)進(jìn)行重組和純化，觀察其在礦化溶液中對(duì)Ca2+、PO43-的定向引導(dǎo)成核，證實(shí)其能夠有效誘導(dǎo)羥基磷灰石晶體在c軸生長(zhǎng)，發(fā)育為成熟的類(lèi)牙釉質(zhì)晶胞，為高效利用釉基質(zhì)蛋白體外實(shí)現(xiàn)牙釉質(zhì)的非細(xì)胞再生提供了翔實(shí)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蛋白序列 根據(jù)GenBank公布的人釉原蛋白全長(zhǎng)序列(Genebank M86932)，通過(guò)參考文獻(xiàn)[6，7]及蛋白質(zhì)序列分析網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器對(duì)TRAP功能片段進(jìn)行定義，確定剪切片段如下：ATGCCTCTACCACCT CATCCTGGGCACCCTGGTTATATCAACTTCAGCTAT GAGGTGCTTACCCCTTTGAAGTGGTACCAGAGCAT AAGGCCACCGTACCCTTCCTATGGTTACGAGCCCAT GGGTGGA。

1.2 重組及表達(dá) 設(shè)計(jì)正、反向引物如表1，按照Ryu[8]的方法進(jìn)行擴(kuò)增、回收、克隆及篩選和鑒定。TRAP與pCold-SUMO原核表達(dá)載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，熱激法轉(zhuǎn)化到原核表達(dá)菌株E.coli宿主菌BL21plys中，鑒定后的菌株在LB液體培養(yǎng)基中接種，培養(yǎng)至OD600為0.6時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)劑使其終濃度為0.5 mM /L，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。根據(jù)Ni-NTA Resin純化試劑盒的使用說(shuō)明進(jìn)行純化，得到純化的含有SUMO的重組蛋白，使用rTEV蛋白酶切割融合蛋白得到TRAP蛋白，透析將蛋白溶液pH值調(diào)整為7.0后凍干保存。

表1 富酪氨酸片斷TRAP的PCR引物

1.3 自組裝及礦化實(shí)驗(yàn) 以pH 3.5的雙蒸水溶解TRAP，置入 37 ℃人工唾液(MgCl20.2 mM，CaCl2·H2O 1 mM，HEPES buffer 20 mM，KH2PO44 mM，KCl 16 mM，NH4Cl 4.5 mM，NaF 300 ppm，用1 M NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0)[9]1～3 天，令溶液中TRAP終濃度為10 mg/ml。反應(yīng)液滴于200目的碳膜銅網(wǎng)，乙酯雙氧鈾染色，透射電鏡觀察、原位X射線(xiàn)衍射確定晶體性質(zhì)(Tecnai T12 120 kV TEM，F(xiàn)EI，美國(guó))。

2 結(jié)果

2.1 蛋白鑒定 引物擴(kuò)增的TRAP經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，可見(jiàn)大小為130 bp左右的特異性條帶，與預(yù)期一致，結(jié)果見(jiàn)圖1。DNA測(cè)序結(jié)果及配對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖2，與NCBI基因庫(kù)中人TRAP序列的契合度達(dá)98%。轉(zhuǎn)染原核細(xì)胞后培養(yǎng)、鑒定，分離純化后提取所得蛋白液體，經(jīng)蛋白質(zhì)明膠電泳檢測(cè)顯示所得蛋白的分子量約5.5 Kd，與計(jì)算預(yù)估TRAP分子量吻合(圖3)，證實(shí)提取及重組純化實(shí)驗(yàn)所得的蛋白即為人釉原蛋白酪氨酸富集片段TRAP。凍干蛋白為淡黃色絮狀物(圖4)，密度較小。

圖1 擴(kuò)增TRAP 片段

2.2 自組裝行為及晶體生長(zhǎng) 透射電鏡顯示TRAP蛋白液與人工唾液孵育1小時(shí)后，溶液中可見(jiàn)TRAP團(tuán)聚成30～50 nm的“納米小球”(圖5a，紅色框)，每個(gè)小球的亞單位是6～8個(gè)TRAP單體組成的“戒指環(huán)”狀多聚體(圖5a，藍(lán)色框)，此形態(tài)與釉原蛋白在從pH 3.5～7.0的構(gòu)型變化一致，X射線(xiàn)未能出現(xiàn)晶體環(huán)。4小時(shí)后，納米小球結(jié)構(gòu)逐漸增厚，TEM圖片表現(xiàn)為焦點(diǎn)不清，為晶體生長(zhǎng)已啟動(dòng)，但晶胞形態(tài)稚嫩，仍未見(jiàn)晶體衍射環(huán)。孵育1天后，晶胞逐漸成熟，以納米小球?yàn)閱挝怀霈F(xiàn)晶體結(jié)構(gòu)，直徑100～200 nm，X射線(xiàn)衍射顯示晶體以磷酸八鈣[Ca8H2(PO4)6·5H2O]為主。3天后，晶胞已趨成熟，融合為長(zhǎng)度為3～4 μm的晶體，成分以羥基磷灰石[Ca10(PO4)6(OH)2]為主。

圖2 TRAP測(cè)序?qū)Ρ葓D

圖3 TRAP明膠蛋白電泳圖

圖4 肉眼觀TRAP蛋白

TRAP引導(dǎo)的新生晶體呈矮柱狀，相互平行排列成簇，晶體長(zhǎng)度約為15～35 nm，與正常牙釉質(zhì)的細(xì)微結(jié)構(gòu)非常類(lèi)似(圖3)，普通再礦化組則得到片狀、散在排列的晶體，寬度達(dá)1～2 μm，與正常釉質(zhì)相卻甚遠(yuǎn)。X射線(xiàn)衍射結(jié)果顯示新生晶體為磷酸八鈣和羥基磷灰石，與正常釉質(zhì)相比雖然結(jié)晶度稍低但是晶體性質(zhì)幾近相同(圖4)。反之普通再礦化組得到的晶體以無(wú)定型磷酸鈣、磷酸三鈣和磷酸八鈣居多。

圖5 TRAP蛋白液與仿生唾液孵育后透射電鏡圖 a：1小時(shí)；b：4小時(shí)；c：1天(右下角為原位X射線(xiàn)衍射圖)；d：3天 (右下角為原位X射線(xiàn)衍射圖)

3 討論

人牙釉質(zhì)礦化過(guò)程中，模板不是預(yù)先成型的，而是持續(xù)由成釉細(xì)胞分泌并進(jìn)行自組裝，在目前所知的釉基質(zhì)蛋白及酶家族中，釉原蛋白含量最高，占總量的90%。它由192個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，一級(jí)結(jié)構(gòu)含較多的脯氨酸(Pro)、組氨酸(His)、谷氨酸(Glu)和亮氨酸(Leu)，是典型的極性分子，能提供晶體形核的位點(diǎn)，其二級(jí)結(jié)構(gòu)富含β折疊股、β轉(zhuǎn)角等完全伸展的多肽鏈，能控制晶體生長(zhǎng)[1，5]。釉原蛋白有一個(gè)親水-疏水的核心序列，富含脯氨酸、組氨酸和谷氨酰胺。之前的報(bào)道中，疏水的N端主要影響釉原蛋白的自組裝和蛋白間相互作用，三酪氨酸為主(PYPSYGYEPMGGW)的酪氨酸富集區(qū)TRAP能夠糖基化，具有凝集原樣特性，與其他細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(如成釉蛋白或釉蛋白)結(jié)合，介導(dǎo)釉原蛋白和非釉原蛋白的反應(yīng)[10]。但當(dāng)我們將TRAP單獨(dú)提取出來(lái)并于礦化液共同孵育，發(fā)現(xiàn)其也具備首尾相接形成釉原蛋白特有的納米小球結(jié)構(gòu)。從功能域分析，在中性pH和37 ℃環(huán)境中，全長(zhǎng)釉原蛋白NH2-端疏水的Pro富集區(qū)域相互聚攏，COOH-端親水的帶電荷的氨基酸尾巴TLAGGVA指向外部，形成Ф=20 nm的球狀納米自組裝體，表面暴露多個(gè)可以與多種非釉原蛋白相結(jié)合的氨基酸序列，進(jìn)一步自組裝形成超分子集團(tuán)[1，5，10，11]。冷凍電鏡觀察溶液中pH從3.5～7改變時(shí)，3 nm大小的釉原蛋白單體逐步自組裝為直徑7～15 nm的多聚體，多聚體進(jìn)一步集合為15～50的納米小球[1，11]。此特點(diǎn)在我們的試驗(yàn)中也能觀察到，雖然TRAP序列缺乏親水的氨基酸尾巴，但仍能像釉原蛋白全長(zhǎng)一樣形成球形超分子結(jié)構(gòu)，在反應(yīng)初期(1～4小時(shí))的圖譜中尤為明顯(圖5a；圖5b)。為何缺少親水的結(jié)構(gòu)域TRAP仍能在溶液中團(tuán)聚，進(jìn)一步的蛋白質(zhì)圓二色譜(Circular dichroism spectra)檢測(cè)或許有助于清楚的闡述此類(lèi)現(xiàn)象。

但是在誘導(dǎo)晶體生長(zhǎng)成熟的周期中，TRAP與釉原蛋白全長(zhǎng)的表現(xiàn)又截然不同，配合晶體生長(zhǎng)無(wú)定形前驅(qū)相-中間相-成熟相的過(guò)程，在晶體形成前相，釉原蛋白納米微球的尺寸(α=90.15，β=92.54，γ=108.65)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于羥基磷灰石晶體的晶胞(a=9.432，b=9.432，c=6.881)，可以提高HA的熱力學(xué)穩(wěn)定性[12]。本試驗(yàn)中TRAP初期團(tuán)聚為類(lèi)納米小球后(圖5b)并沒(méi)有進(jìn)一步形成串珠狀結(jié)構(gòu)，而是在Ca2+、PO43-的包裹下形成樹(shù)枝狀脈絡(luò)花樣結(jié)構(gòu)，與納米小球尺寸相當(dāng)。類(lèi)似于在納米小球表面形成晶體生長(zhǎng)中心開(kāi)始生長(zhǎng)，至礦化完成后(圖5d)，納米小球融合成巨大的晶體樹(shù)，結(jié)構(gòu)成熟，晶型改變發(fā)育為成熟的羥基磷灰石。礦化溶液中，只要有合適的結(jié)晶生長(zhǎng)極(高分子、蛋白)等，礦化現(xiàn)象就無(wú)處不在。以往的試驗(yàn)中，用無(wú)機(jī)或有機(jī)高分子作為礦化模板(如十二烷基硫酸鈉/異辛烷反膠團(tuán)附著的Langmuir-Blodgett膜[13]、HS(CH2)nX(-SO3H，-PO4H2，-COOH，-OH，-CH3)組裝的單層膜[14]、自組裝寡肽[4]、瓊脂糖凝膠[15]等)，形成結(jié)晶體形態(tài)和成分千差萬(wàn)別，說(shuō)明礦化模板對(duì)于晶體的生長(zhǎng)成熟起著決定性的作用。所以本試驗(yàn)中，TRAP能誘導(dǎo)形成礦物晶體在情理之中，但礦化初期的納米小球結(jié)構(gòu)卻有力證實(shí)其在釉原蛋白全長(zhǎng)中的重要結(jié)構(gòu)域作用。全長(zhǎng)蛋白介導(dǎo)的礦化過(guò)程中，在生長(zhǎng)基元形成期，納米微球開(kāi)始HA形核并繼續(xù)與釉原蛋白C端的負(fù)電基團(tuán)緊密結(jié)合；由于晶體表面電荷分布的空間匹配，蛋白球沿著晶體的c軸聚集在其周?chē)?。TRAP礦化過(guò)程中此期開(kāi)始與全蛋白出現(xiàn)分化，蛋白球或許沒(méi)有沿著c軸生長(zhǎng)，晶胞在各向皆有長(zhǎng)大，最終形成特有的樹(shù)枝狀晶型，雖然不是釉柱羥基磷灰石的柱狀棒形結(jié)構(gòu)，但其晶胞穩(wěn)定，不失為修復(fù)不規(guī)則微量牙體硬組織缺損的選擇。

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Assembly and mineralization of human tyrosine rich amelogenin peptide (TRAP)

TIAN Kun，DU Qin，LIAO Chu-hang，F(xiàn)EI Wei，REN Xiao-hua

(Department of Stomatology，Sichuan Academy of Medical Science & Sichuan Provincial People’s Hospital，Chengdu 610072，China)

RENXiao-hua

Objective To recombine and express the human tyrosine rich amelogenin peptide (TRAP) and investigate the relationship between assembly and mineralization of recombinant TRAP.Methods In this research，we recombined the human TRAP through prokaryotic expression vector Cold-SUMO，and then transformed into E.coli BL21 (DE3) Chaprone to get the purified protein.Induction role of TRAP in hydroxyapatite crystal nucleation under human saliva like environment of Ca2+and PO43-was investigated.Results Human genes of TRAP success fully expressed in prokarytic,TRAP can make amelogenin-like nano-spherically functional structure，and further induce crystal nucleation maturation.Conclusion TRAP is an important functional domain of amelogenin which has an ability to partially induce crystal nucleation.It is another choice for repairing irregular hard tissue defection

Amelogenin； TRAP； Hydroxyaptite； Enamel

四川省科技支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目(編號(hào)：2013SZ0020)

任小華

R 318

A

1672-6170(2016)04-0056-04

2016-01-07；

2016-05-03)