余 慧，羅金燕，呂 進，趙玉強，陳 磊，姚紅梅

（1.上海市農(nóng)業(yè)技術推廣服務中心，上海 201103；2.湖州市植物保護植物檢疫站，浙江湖州 313000）

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基于種特異性PCR技術快速鑒定葡萄根瘤蚜

余 慧1，羅金燕1，呂 進2，趙玉強1，陳 磊1，姚紅梅1

（1.上海市農(nóng)業(yè)技術推廣服務中心，上海 201103；2.湖州市植物保護植物檢疫站，浙江湖州 313000）

摘 要：葡萄根瘤蚜是一種嚴重威脅葡萄生產(chǎn)的入侵性害蟲。由于蚜蟲類害蟲種類多、體型微小、形態(tài)相似，難以快速準確地進行鑒別。文章以葡萄根瘤蚜為研究對象，以常見果樹蚜蟲為參照，采用基于線粒體DNA細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ基因的種特異性PCR方法，研究葡萄根瘤蚜的快速鑒定技術。利用mtDNACOI基因通用型引物LCO-1490/HCO-2198獲得葡萄根瘤蚜及其他果樹常見蚜蟲的COI序列，根據(jù)測序結果設計1對種特異性SS-COI引物（VitF269/VitR557），擴增片段大小為308 bp。種特異性檢驗結果顯示，該對引物僅對葡萄根瘤蚜的mtDNACOI基因具有擴增效果，其他5種蚜蟲均沒有擴增條帶。

關鍵詞：葡萄根瘤蚜；種特異性引物；快速鑒定；PCR

文獻著錄格式:余慧，羅金燕，呂進，等.基于種特異性PCR技術快速鑒定葡萄根瘤蚜［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學，2016，57（6）: 901-904.

葡萄根瘤蚜（ViteusvitifoliiFitch）隸屬球蚜總科（Adelgoidea）根瘤蚜科（Phylloxeridae）葡萄根瘤蚜屬（ViteusShimer），既是我國農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物又是進境植物檢疫性有害生物［1］。該蟲原產(chǎn)于北美洲西部［2］。19世紀50年代該蟲隨葡萄苗木傳入歐洲并迅速擴散，毀滅了該地區(qū)大部分葡萄園［3］。葡萄根瘤蚜于1935年在我國山東煙臺市首次發(fā)現(xiàn)［4］，隨后在遼寧大連、蓋縣、丹東、遼陽、昌圖、興城和陜西武功及臺灣地區(qū)均發(fā)現(xiàn)了葡萄根瘤蚜為害［5-7］，后經(jīng)砍伐毀園后，30余年中沒有再見其發(fā)生報道［8］。2005年上海市首次發(fā)現(xiàn)葡萄根瘤蚜危害［9］，2006年湖南懷化亦發(fā)現(xiàn)葡萄根瘤蚜危害［10］。

葡萄根瘤蚜以卵和一齡若蟲在葡萄根部越冬或以越冬卵在較老的藤及主根的樹皮下越冬［3，11］。葡萄根瘤蚜一般情況下以無翅根瘤蚜的形式存在，只在7—10月份才有12%～35%的個體發(fā)育成有翅蚜，爬出土壤進行活動危害葡萄，有翅蚜的出現(xiàn)加速了葡萄根瘤蚜的傳播［12］。從近年來上海市監(jiān)測結果來看，通常同一果園內(nèi)種植多種果樹，同一種蚜蟲可危害多種果樹，如田間調查發(fā)現(xiàn)桃粉大尾蚜既可危害柑橘、桃又可危害葡萄。爬出土壤活動的有翅葡萄根瘤蚜與其他在葡萄樹上危害的蚜蟲均具有體型微小、形態(tài)相似等難以鑒定的特點。因此，快速、準確鑒定葡萄根瘤蚜的方法能有效提高田間葡萄及其他果樹蚜蟲的監(jiān)測效率。

近年來，越來越多的分子生物學技術被運用于昆蟲鑒定［13-14］。葡萄根瘤蚜的分子生物學鑒定也在快速開展。2008年，Herbert等［15］設計并篩選了ITS2序列引物鑒定葡萄根瘤蚜，其篩選的DNA探針能有效地從土壤中鑒定出葡萄根瘤蚜；2011年，Bruce等［16］通過DNA試驗從田間土壤中鑒定出葡萄根瘤蚜；2015年，Zhu等［17］通過Herbert等設計的引物對DVIT-F和DVIT-R從葡萄根和危害葡萄的根結線蟲中鑒定出葡萄根瘤蚜。上述技術是針對土壤及葡萄根中葡萄根瘤蚜的快速鑒定，尚未發(fā)現(xiàn)從其他蚜蟲尤其是危害葡萄的蚜蟲中鑒定出葡萄根瘤蚜的報道。葡萄根瘤蚜與其他果樹蚜蟲快速鑒定方法的缺乏將嚴重影響果樹蚜蟲田間監(jiān)測調查的時效性。因此，迫切需要葡萄根瘤蚜與其他果樹蚜蟲的快速鑒定識別技術。

種特異性PCR（species-specific PCR，SSPCR）技術，在設計目標物種引物時必須充分考慮引物的特異性，在擴增未知模板時能夠根據(jù)目標片段條帶的有無把目標種類與其他種類鑒別開來。本研究采用基于線粒體DNA細胞色素C氧化酶亞基I基因（mtDNACOI）的種特異性PCR技術，建立葡萄根瘤蚜的快速檢測技術，準確快速地完成葡萄根瘤蚜的鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所使用的蚜蟲均為2014—2015年上海植檢站在果樹田間調查監(jiān)測中采集，具體采集信息如表1所示，所有標本浸泡于無水乙醇，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1　用于本研究的蚜蟲種類采集信息

1.2 DNA提取

采用Qiagen公司的Blood &TissueKitDNA提取試劑盒提取蚜蟲總DNA，提取方法按照試劑盒說明書操作。提取的蚜蟲總DNA放入-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 COI基因5′端序列擴增

以葡萄根瘤蚜及其他5種常見果樹蚜蟲的DNA為模板，采用mtDNACOI基因通用型引物LCO-1490（5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3′）與HCO-2198（5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAA AAATCA-3′）進行PCR擴增［18］。PCR反應體系為30 μL，模板DNA1.0 μL，10×buffer3.0 μL，Mg2 +（25 mmol·L-1）3.0 μL，dNTP（2.5 mmol·L-1）3.0 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各1.0 μL，TaqDNA聚合酶（2.5 U·μL-1）0.2 μL，ddH2O 17.8 μL。PCR反應條件為94℃3 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。

取6 μL PCR擴增產(chǎn)物，在含有染色劑GoldView（0.5 μg·mL-1）的1.0%瓊脂糖凝膠上電泳分離，用GelDocUniversalHoodⅡ型凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad Laboratories）分析電泳結果。電泳分析質量合格的PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙向測序。

1.4 葡萄根瘤蚜特異性SS-COI引物的設計

根據(jù)1.3節(jié)中的測序結果，運用Oligo6.0設計1對葡萄根瘤蚜特異性SS-COI引物。上游引物VitF269: 5′-CCCTCTTTAATAATAATACTA-3′，下游引物VitR557: 5′-TATTGTAATAGCACCAGT-3′，送生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.5 葡萄根瘤蚜特異性SS-COI引物種特異性檢測

分別以葡萄根瘤蚜、桃蚜、桃粉大尾蚜、棉蚜、繡線菊蚜和蓮縊管蚜6種蚜蟲的單頭成蟲DNA為模板，以葡萄根瘤蚜為陽性對照，檢驗葡萄根瘤蚜SS-COI引物VitF269/VitR557的特異性。PCR反應體系為30 μL，模板DNA1.0 μL，10× buffer3.0 μL，Mg2 +（25 mmol·L-1）3.0 μL，dNTP（2.5 mmol·L-1）3.0 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各1.0 μL，TaqDNA聚合酶（2.5 U·μL-1）0.2 μL，ddH2O17.8 μL。反應條件為94℃3 min；94℃30 s，48℃30 s，72℃1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物檢測方法同1.3節(jié)。

1.6 葡萄根瘤蚜特異性SS-COI引物種靈敏度檢驗

利用核酸蛋白分析儀測試提取的葡萄根瘤蚜DNA模板的濃度。將葡萄根瘤蚜DNA模板按10-1，10-2，10-3和10-4倍梯度稀釋，然后使用種特異性引物VitF269和VitR557進行PCR擴增，來驗證檢測方法的靈敏度。

2 結果與分析

2.1 蚜蟲類昆蟲COI基因5′端序列的擴增及SSCOI標記分析

以葡萄根瘤蚜及其他5種常見果樹蚜蟲DNA為模板，以mtDNACOI基因通用型引物LCO-1490/HCO-2198進行PCR擴增。電泳檢測結果顯示，6種蚜蟲均能擴增出一條清晰的靶標片段（圖1），測序結果顯示，該片段長度約為680 bp。

圖1　COI基因通用型引物LCO-1490/HCO-2198的擴增效果

2.2 葡萄根瘤蚜SS-COI引物的種特異性檢驗

以葡萄根瘤蚜及其他5種常見蚜蟲類害蟲DNA為模板，以葡萄根瘤蚜特異性SS-COI引物VitF269/VitR557進行PCR擴增。結果顯示，只有葡萄根瘤蚜的DNA能擴增出條帶，其擴增片段大小為308 bp，表明該對引物為葡萄根瘤蚜的特異性引物（圖2）。測序結果表明，該序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的葡萄根瘤蚜序列具有100%的一致性。

圖2　種特異性SS-COI引物VitF269/VitR557的擴增效果

2.3 葡萄根瘤蚜SS-COI引物的靈敏度檢驗

核酸蛋白分析儀測試結果表明，提取的葡萄根瘤蚜DNA模板的濃度為17.5 ng·μL-1。取不同濃度的DNA模板進行最低檢出閾值的測定，隨著模板濃度的降低，擴增出的條帶逐漸減弱，在稀釋10-3倍后仍有明顯條帶，說明該方法具有較高的靈敏度（圖3）。

圖3　引物VitF269/VitR557的靈敏度驗證

3 討論

葡萄根瘤蚜個體微小，為害環(huán)境隱蔽，易隨寄主葡萄苗木的遠距離運輸而傳播擴散，傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定無法滿足快速識別和有效阻截的基本需求。本研究采用基于mtDNACOI基因的SS-COI標記技術，研發(fā)出了葡萄根瘤蚜特異性引物VitF269/VitR557及其快速檢測方法。該引物特異性強，僅對葡萄根瘤蚜有擴增效果，對田間其他常見的果樹蚜蟲如桃粉大尾蚜、桃蚜、棉蚜、蓮縊管蚜和繡線菊蚜不具擴增能力。同時，該技術體系具有較高的靈敏度，能檢測到的DNA模板濃度可低至17.5× 10-3ng·μL-1。此外，數(shù)據(jù)庫同源性比對分析結果顯示，沒有任何一種昆蟲的DNA序列與葡萄根瘤蚜特有的308 bp片段序列完全一致，表明該檢測技術體系完全可以用于田間監(jiān)測和葡萄苗木調運中對葡萄根瘤蚜的快速檢測。

本研究研發(fā)的葡萄根瘤蚜特異性SS-COI引物VitF269/VitR557及其快速檢測技術體系是對葡萄根瘤蚜形態(tài)鑒定識別方法的補充，提高了檢測效率，在葡萄根瘤蚜監(jiān)測檢測中具有較好的應用價值。由于果樹蚜蟲類昆蟲種類較多，一些種類本研究并未涉及，SS-COI引物的特異性有待進一步驗證。

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（責任編輯：侯春曉）

中圖分類號：S436.631.2+1

文獻標志碼：A

文章編號：0528-9017（2016）06-0901-03

DOI：10.16178/j.issn.0528-9017.20160634

收稿日期:2016-01-20

作者簡介:余 慧（1982—），女，河南駐馬店人，農(nóng)藝師，碩士，從事植物檢疫工作，E-mail: yuhui-lucky@163.com。

通信作者:姚紅梅，E-mail: yaohm88@126.com。